分子生物学-研究方法(上).pptx

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第五章第五章分子生物学研究方法（上）分子生物学研究方法（上）本章主要内容本章主要内容l常见的常见的DNADNA操作技术操作技术l基因克隆技术简介基因克隆技术简介l蛋白质组学及研究技术蛋白质组学及研究技术引言引言重组重组重组重组DNADNADNADNA技术发展史上的重大事件技术发展史上的重大事件技术发展史上的重大事件技术发展史上的重大事件

（1）

（1）40404040年代，年代，年代，年代，解决了遗传的物质基础问题。

解决了遗传的物质基础问题。

确定了遗确定了遗确定了遗确定了遗传信息的携带者，即基因的分子载体是传信息的携带者，即基因的分子载体是传信息的携带者，即基因的分子载体是传信息的携带者，即基因的分子载体是DNADNADNADNA而不是蛋白质。

而不是蛋白质。

（2）

（2）50505050年代，年代，年代，年代，解决了基因的自我复制和世代交替问题。

解决了基因的自我复制和世代交替问题。

建立了建立了建立了建立了DNADNADNADNA分子的双螺旋结构模型，提出了半保留复制机分子的双螺旋结构模型，提出了半保留复制机分子的双螺旋结构模型，提出了半保留复制机分子的双螺旋结构模型，提出了半保留复制机制。

制。

（3）（3）50505050年代末至年代末至年代末至年代末至60606060年代，相继提出了年代，相继提出了年代，相继提出了年代，相继提出了“中心法则中心法则中心法则中心法则”和和和和操纵子学说操纵子学说操纵子学说操纵子学说,成功地破译了遗传密码，充分认识成功地破译了遗传密码，充分认识成功地破译了遗传密码，充分认识成功地破译了遗传密码，充分认识了遗传信息的流动和表达途径。

了遗传信息的流动和表达途径。

从此，大肠杆菌就成了分子克隆中最常用的转化受体。

1970年年Mandel和和Higa发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处发现，大肠杆菌细胞经适量氯化钙处理后，能有效地吸收理后，能有效地吸收噬菌体噬菌体DNA。

1972年，年，Cohen等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细等人又报道，经氯化钙处理的大肠杆菌细胞同样能够摄取质粒胞同样能够摄取质粒DNA。

基因工程的主要内容或步骤基因工程的主要内容或步骤基因工程的主要内容或步骤基因工程的主要内容或步骤“分分分分-切切切切-连连连连-转转转转-筛筛筛筛”（1111）从基因组中）从基因组中）从基因组中）从基因组中分离分离分离分离、或、或、或、或PCRPCRPCRPCR扩增、或人工合成带有目的扩增、或人工合成带有目的扩增、或人工合成带有目的扩增、或人工合成带有目的基因的基因的基因的基因的DNADNADNADNA片段。

片段。

（2222）用适当的限制酶分别）用适当的限制酶分别）用适当的限制酶分别）用适当的限制酶分别切割切割切割切割适当的适当的适当的适当的载体分子和载体分子和载体分子和载体分子和含有目的含有目的含有目的含有目的基因的基因的基因的基因的DNADNADNADNA分子。

分子。

（3333）将目的基因）将目的基因）将目的基因）将目的基因连接连接连接连接到载体分子上，形成重组到载体分子上，形成重组到载体分子上，形成重组到载体分子上，形成重组DNADNADNADNA分子。

分子。

（4444）将重组）将重组）将重组）将重组DNADNADNADNA分子分子分子分子转移转移转移转移到适当的受体细胞中并增殖。

到适当的受体细胞中并增殖。

（5555）筛选筛选筛选筛选重组转化子，扩增目的基因。

再将目的基因克隆重组转化子，扩增目的基因。

再将目的基因克隆到表达载体上，导入受体细胞，使表达目的产物。

到表达载体上，导入受体细胞，使表达目的产物。

基因工程技术区别于其它技术的基因工程技术区别于其它技术的根本特征根本特征：

具：

具有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因有跨越天然物种屏障、把来自任何生物的基因置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的置于毫无亲缘关系的新的寄主生物细胞之中的能力。

能力。

19621962年年ArberArber发现限制性核酸内切酶，发现限制性核酸内切酶，19671967年年GellertGellert发现了发现了DNADNA连接酶。

连接酶。

重组重组DNADNA实验中常见的主要工具酶实验中常见的主要工具酶酶酶类功功能能限制性核酸内切限制性核酸内切酶酶识别并在特定位点切开并在特定位点切开DNADNADNADNA连接接酶酶通通过磷酸二磷酸二酯键把两个或多个把两个或多个DNADNA片段片段连接成一个接成一个DNADNA分子分子DNADNA聚合聚合酶酶II（大（大肠杆菌）杆菌）按按55到到33方向加入新的核苷酸，方向加入新的核苷酸，补平平DNADNA双双链中的缺口中的缺口反反转录酶酶按照按照RNARNA分子中的碱基序列，根据碱基互分子中的碱基序列，根据碱基互补原原则合成合成DNADNA链多核苷酸激多核苷酸激酶酶把磷酸基把磷酸基团加到多聚核苷酸加到多聚核苷酸链的的5-OH5-OH末端（末端（进行末端行末端标记实验或用来或用来进行行DNADNA的的连接接末端末端转移移酶酶在双在双链核酸的核酸的33末端加上多聚末端加上多聚单核苷酸核苷酸DNADNA外切外切酶酶IIIIII从从DNADNA链的的33末端逐个切除末端逐个切除单核苷酸核苷酸噬菌体噬菌体DNADNA外切外切酶酶从从DNADNA链的的55末端逐个切除末端逐个切除单核苷酸核苷酸碱性磷酸碱性磷酸酯酶酶切除位于切除位于DNADNA链55或或33末端的磷酸基末端的磷酸基团科学家已几乎能随心所欲地把任何科学家已几乎能随心所欲地把任何DNADNA分子切割成一系列不连续的片段，分子切割成一系列不连续的片段，再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。

再利用凝胶电泳技术将这些片段按照分子量大小逐一分开，以供下一步研究。

1DNA1DNA操作技术操作技术DNADNA分子的切割与连接分子的切割与连接核酸分子杂交核酸分子杂交凝胶电泳凝胶电泳细胞转化细胞转化核酸序列分析核酸序列分析基因的人工合成基因的人工合成基因的定点突变基因的定点突变PCRPCR扩增扩增基因敲除基因敲除1.11.1核酸的凝胶电泳核酸的凝胶电泳原理：

原理：

种类：

琼脂糖琼脂糖（agaroseagarose）凝胶电泳；凝胶电泳；聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺（polyacrylamidepolyacrylamide）凝胶电泳凝胶电泳用途：

用途：

鉴定重组鉴定重组DNADNA分子分子蛋白质与核酸相互作用蛋白质与核酸相互作用DNADNA分型分型DNADNA核苷酸序列分析核苷酸序列分析限制酶酶切片段分析限制酶酶切片段分析限制酶酶切作图限制酶酶切作图琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶分辨琼脂糖凝胶分辨DNADNA片段的范围为片段的范围为0.2-50kb0.2-50kb之间之间聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶分辨范围为分辨范围为1-10001-1000个碱基对个碱基对凝胶类型及浓度凝胶类型及浓度分离分离DNA片段的大小范围（片段的大小范围（bp）0.3%琼脂糖琼脂糖5000010000.7%琼脂糖琼脂糖2000010001.4%琼脂糖琼脂糖60003004.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺100010010.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺5002520.0%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺501凝胶的分辨能力同凝胶类型和浓度有关，凝胶凝胶的分辨能力同凝胶类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。

反之，浓度降低，孔隙越小，其分辨能力就越强。

反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。

孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。

1.21.2转基因方法转基因方法1.2.11.2.1细菌转基因的方法细菌转基因的方法

（1）

（1）结合（结合（conjugationconjugation）

（2）

（2）转化（转化（transformationtransformation）（常规转化、电转化等常规转化、电转化等）（3）（3）转染（转染（transfectiontransfection）（4）（4）转导（转导（transductiontransduction）1.2.21.2.2动物转基因的方法动物转基因的方法

（1）

（1）显微注射法：

包括细胞核内和细胞质内注射。

显微注射法：

包括细胞核内和细胞质内注射。

（2）

（2）电导转基因法电导转基因法（3）（3）逆转录病毒介导法逆转录病毒介导法（4）（4）胚胎干细胞介导法胚胎干细胞介导法（5）（5）精子载体法精子载体法1.2.31.2.3植物转基因的方法植物转基因的方法

（1）Ti

（1）Ti质粒介导质粒介导

（2）

（2）电转化法电转化法（3）（3）基因枪法基因枪法1.3.11.3.1放射性同位素技术放射性同位素技术同位素：

同位素：

原子序数相同而质量不同的元素。

放射性同位素放射性同位素同位素可分为稳定同位素和不稳同位素可分为稳定同位素和不稳定同位素，后者又称为放射性同位素。

不稳定同位定同位素，后者又称为放射性同位素。

不稳定同位素原子核结构不稳定，易自发产生衰变，产生素原子核结构不稳定，易自发产生衰变，产生-射线、射线、-射线和射线和-射线等，同时从不稳定同位素射线等，同时从不稳定同位素变成稳定同位素。

在分子生物学研究中，得到应用变成稳定同位素。

在分子生物学研究中，得到应用的是放射性同位素。

的是放射性同位素。

1.31.3核酸的分子杂交核酸的分子杂交放射性的衰变类型放射性的衰变类型-射线：

带正电荷的高速粒子流射线：

带正电荷的高速粒子流-射线：

带负电荷的射线：

带负电荷的粒子流粒子流-射线：

光子流射线：

光子流分子生物学研究中常用的放射性同位素及其性质分子生物学研究中常用的放射性同位素及其性质元素名称元素名称半衰期半衰期12.112.1年年57005700年年14.314.3天天87.187.1天天5.85.8年年141477N+N+1100nn141466C+C+1111HH141466CC141477N+N+00-1-1ee2382389292UU2062068282Pb+8Pb+84422He+6He+600-1-1e（te（t1/21/2=4.510=4.51099a）a）放射性强度的探测放射性强度的探测（11）盖革计数器（）盖革计数器（GeigercountertuberGeigercountertuber），），闪烁计数器。

闪烁计数器。

（22）放射自显影：

）放射自显影：

X-X-光乳胶片覆盖于样品，在光乳胶片覆盖于样品，在黑暗中，黑暗中，-70-70，曝光。

，曝光。

放射性分子的制备放射性分子的制备：

核物理，化学，生化反应，：

核物理，化学，生化反应，生化分离技术生化分离技术核酸分子的放射性同位素标记应用举例核酸分子的放射性同位素标记应用举例利用切口平移技术制备利用切口平移技术制备DNADNA放射性探针放射性探针1.3.21.3.2分子杂交类型分子杂交类型根据鉴定对象不同，可将分子杂交法分为根据鉴定对象不同，可将分子杂交法分为33种类型：

种类型：

Southern杂交由E.M.Southern于1975年创立。

SouthernSouthern杂交：

杂交：

将将将将DNADNADNADNA分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上，分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上，分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上，分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上，然后与核酸探针进行杂交。

然后与核酸探针进行杂交。

NorthernNorthernNorthernNorthern杂交杂交：

将将将将RNARNARNARNA分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上，分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上，分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上，分子从电泳凝胶转移至杂交滤膜上，然后与核酸探针进行杂交。

然后与核酸探针进行杂交。

WesternWesternWesternWestern杂交杂交：

将蛋白质从电泳凝胶中转移到杂交滤膜上，将蛋白质从电泳凝胶中转移到杂交滤膜上，将蛋白质从电泳凝胶中转移到杂交滤膜上，将蛋白质从电泳凝胶中转移到杂交滤膜上，然后同放射性同位素然后同放射性同位素然后同放射性同位素然后同放射性同位素125125125125IIII标记的特定蛋白质进行反应。

标记的特定蛋白质进行反应。

1.3.31.3.3核酸分子杂交核酸分子杂交复性（退火）：

复性（退火）：

在一定条件在一定条件下变性的两条单链重新结合下变性的两条单链重新结合为双链的过程为双链的过程杂交：

杂交：

来源不同的两条单链来源不同的两条单链结合为双链分子的过程。

结合为双链分子的过程。

核酸探针：

指序列或功能特指序列或功能特性已知的标记分子，为双链性已知的标记分子，为双链或单链，长度通常为几十至或单链，长度通常为几十至几百几百bp,bp,包括包括DNADNA探针、探针、RNARNA探探针和针和cDNAcDNA探针。

探针。

若退火的核酸来自若退火的核酸来自不同的生物有机体，则不同的生物有机体，则所形成的双链分子就被所形成的双链分子就被称为称为杂种核酸分子杂种核酸分子。

（11）SouthernSouthern杂交（杂交（SouthernSouthern印迹）：

印迹）：

用适当用适当的限制酶消化待测的限制酶消化待测DNADNA，电泳后，将凝胶浸于碱，电泳后，将凝胶浸于碱性溶液中以变性性溶液中以变性DNADNA，再经毛细作用将变性的，再经毛细作用将变性的DNADNA从凝胶中转移至杂交膜上并固定，然后与放从凝胶中转移至杂交膜上并固定，然后与放射性同位素标记的核酸探针杂交，再经放射自射性同位素标记的核酸探针杂交，再经放射自显影显示杂交结果。

该技术可有效地分析基因显影显示杂交结果。

该技术可有效地分析基因结构或检测待测结构或检测待测DNADNA样本中是否含有特定的序列。

样本中是否含有特定的序列。

1）1）电泳电泳:

将已酶切的待检将已酶切的待检DNADNA样品进行琼脂糖凝胶电泳。

样品进行琼脂糖凝胶电泳。

2）2）转膜转膜:

将分离的核酸样品转移到滤膜上（将分离的核酸样品转移到滤膜上（印迹印迹转移）。

移）。

3）3）杂交杂交:

将滤膜与标记的将滤膜与标记的DNADNA或或RNARNA探针进行杂交。

探针进行杂交。

印迹法：

凝胶印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和凝胶印迹法、斑点和狭线印迹法、菌落和噬菌斑印迹法。

噬菌斑印迹法。

杂交膜：

尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜等。

放射自显影DNA印迹转移探针杂交杂交模式图杂交模式图某作者用人的一放射性某作者用人的一放射性DNADNA探针与鼠基因组探针与鼠基因组DNADNA进行杂交，在所得到的杂交图谱中，第进行杂交，在所得到的杂交图谱中，第11泳道的点泳道的点样处有一略呈拖尾状的放射性杂交斑点；第样处有一略呈拖尾状的放射性杂交斑点；第22泳道泳道呈较长的弥散形杂交带；第呈较长的弥散形杂交带；第33泳道有泳道有33条较清晰的杂条较清晰的杂交条带，上下两条带的显色程度相当，中间的条带交条带，上下两条带的显色程度相当，中间的条带显色最深，约分别为其上下两侧条带的两倍。

试分显色最深，约分别为其上下两侧条带的两倍。

试分析上述实验结果。

析上述实验结果。

例题：

SouthernSouthern杂交应用举例杂交应用举例环状芽孢杆菌基因启动子的分离与鉴定环状芽孢杆菌基因启动子的分离与鉴定环状芽孢杆菌环状芽孢杆菌C-2C-2基因启动子探针与重组基因启动子探针与重组DNADNA分子的斑点杂交分子的斑点杂交（22）斑点杂交）斑点杂交（DotblotDotblot）：

直接将）：

直接将DNADNA样品点在滤样品点在滤膜上使之成为斑点，变性并固定，与探针杂交，放射膜上使之成为斑点，变性并固定，与探针杂交，放射自显影。

自显影。

检测重组体克隆的菌落杂交技术检测重组体克隆的菌落杂交技术检测重组体克隆的菌落杂交技术检测重组体克隆的菌落杂交技术（33）菌落原位杂交）菌落原位杂交（Hybridizationinsitu）Hybridizationinsitu）：

又分又分为菌落杂交和空斑杂交。

在杂交膜上接种转化子细胞，裂为菌落杂交和空斑杂交。

在杂交膜上接种转化子细胞，裂解以释放待检解以释放待检DNADNA，变性并固定，变性并固定DNADNA，与探针杂交，放射自，与探针杂交，放射自显影。

显影。

用于鉴定阳性重组体。

（44）组织原位杂交）组织原位杂交（TissueinsituhybridizationTissueinsituhybridization）：

）：

指组织或细胞的原位杂交。

经适当处理后，使细胞通透指组织或细胞的原位杂交。

经适当处理后，使细胞通透性增加，让探针进入细胞内与性增加，让探针进入细胞内与DNADNA或或RNARNA杂交，以确定探针互杂交，以确定探针互补序列在胞内的空间位置。

补序列在胞内的空间位置。

LocalizationofRNA1.41.4聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction（PolymeraseChainReaction，PCRPCR）PCRPCR技术简史技术简史1.4.1PCR1.4.1PCR原理原理PCRPCR是一种体外无性扩增是一种体外无性扩增DNADNA的实验技的实验技术。

待扩增术。

待扩增DNADNA片段经高温变性成为单链后，在低温片段经高温变性成为单链后，在低温（如（如5252）下与寡聚核苷酸引物退火，然后在中温下）下与寡聚核苷酸引物退火，然后在中温下以每一条单链为模板，由多聚酶催化延伸引物链，分以每一条单链为模板，由多聚酶催化延伸引物链，分别合成一条新链。

经过解链、退火和链延伸等多个循别合成一条新链。

经过解链、退火和链延伸等多个循环反应，原环反应，原DNADNA片段就可得到大量扩增。

片段就可得到大量扩增。

注注:

TaqTaq来自来自ThermusaquaticusThermusaquaticusPCRPCR仪仪1.4.2PCR1.4.2PCR反应体系反应体系TmplateDNATmplateDNADNAPrimersDNAPrimersdNTPsdNTPsTaqDNAPolymeraseTaqDNAPolymerase10Buffer10Buffer1.4.31.4.3基本反应步骤基本反应步骤11个循环包括个循环包括高温变性、低温退火和中温延伸高温变性、低温退火和中温延伸反应反应。

经经nn次循环后次循环后,一个一个DNADNA分子可分子可扩增扩增为为22nn个分子。

个分子。

模板模板DNADNA的变性：

模板的变性：

模板DNADNA经加热至经加热至9494左右左右一定时间后，使模板一定时间后，使模板DNADNA双链解离，使之成为单双链解离，使之成为单链，以便与引物结合。

链，以便与引物结合。

Primer1Primer2535533模板模板DNADNA与引物的退火与引物的退火（复性复性）：

模板：

模板DNADNA经加热经加热变性成单链后，温度降至变性成单链后，温度降至5555左右，引物与模板左右，引物与模板DNADNA单链上的互补序列配对结合。

单链上的互补序列配对结合。

335Primer1Primer253553533TaqDNAPolymerase引物的延伸：

引物的延伸：

DNADNA模板模板-引物结合物在引物结合物在TaqTaqDNADNA聚聚合酶的作用下，以合酶的作用下，以dNTPdNTP为反应原料，靶序列为模板，为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对原则，合成一条新的与模板按碱基配对原则，合成一条新的与模板DNADNA互补的链。

互补的链。

一般每完成一个循环需一般每完成一个循环需2-42-4分钟，分钟，2-32-3小时就能小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。

将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。

11个个PCRPCR循环产生循环产生22条双链分子条双链分子PCR的基本原理模板DNAPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点引物1引物2Taq酶Taq酶PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第1轮结束PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点TaqTaqTaqTaqPCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点第2轮结束PCR反应条件PCR过程PCR的特点重复30轮后230=1,073,741,824第第11轮扩增轮扩增第第22轮扩增轮扩增第第33轮扩增轮扩增第第44轮扩增轮扩增第第55轮扩增轮扩增第第66轮扩增轮扩增电泳分析电泳分析PCR设备电泳分析电泳分析（33）PCRPCR的应用的应用反向反向PCRPCR：

扩增已知序列旁侧的未知扩增已知序列旁侧的未知DNADNA序列序列锚定锚定PCR:

PCR:

用于测定基因结构用于测定基因结构不对称不对称PCR:

PCR:

用于扩增某一单链模板用于扩增某一单链模板RT-PCR（RT-PCR（逆转录逆转录-PCR）:

-PCR）:

逆转录联合逆转录联合PCRPCR以扩增以扩增cDNAcDNA复合复合PCR:

PCR:

用多对引物同时扩增几条用多对引物同时扩增几条DNADNA片段片段易错易错PCRPCR：

引入引入错配错配碱基，导致随机突变碱基，导致随机突变荧光定量荧光定量PCR:

PCR:

用于估计模板用于估计模板DNADNA的浓度的浓度免疫免疫PCRPCR：

扩增抗原扩增抗原-抗体复合物上的抗体复合物上的DNADNA分子分子原位原位PCRPCR：

在组织或细胞标本片上直接进行在组织或细胞标本片上直接进行PCRPCR微生物微生物PCR:

PCR:

用于微生物的鉴定和分类用于微生物的鉴定和分类设计引物应遵循以下原则设计引物应遵循以下原则：

引物长度：

15-30bp15-30bp，常为，常为20nt20nt左右。

左右。

引物扩增跨度：

以引物扩增跨度：

以200-500bp200-500bp为宜。

为宜。

引物碱基：

G+CG+C含量以含量以40-60%40-60%为宜。

避免为宜。

避免55个以上个以上相同碱基的成串排列。

相同碱基的成串排列。

引物内部应避免出现出现二级结构，避免两条引引物内部应避免出现出现二级结构，避免两条引物间互补。

物间互补。

引物引物33末端碱基，应与模板单链末端碱基，应与模板单链严格严格配对。

配对。

引物中具有或能够加上合适的酶切位点。

特异性：

与数据库中的其它序列无明显同源性。

特异性：

与数据库中的其它序列无明显同源性。

pPICZpPICZ物理图谱物理图谱定向克隆应用举例定向克隆应用举例PrimerF：

5-GCTGAATTCGAATTCATGGGCAACTCAGCGCTCGACCTT-3PrimerR：

5-TGTTCTAGATCTAGATTAGACGTTACCGGCGGCGCCAGT-3上、下

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