细胞生物学的研究技术和方法.ppt
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细胞生物学的研究技术和方法本章内容提要本章内容提要一、细胞生物学概念一、细胞生物学概念二、细胞生物学与医学二、细胞生物学与医学三、细胞生物学发展简史三、细胞生物学发展简史一、细胞生物学一、细胞生物学（cellbiology）利用现代物理、化学技术和利用现代物理、化学技术和分子生物学方法，从细胞整分子生物学方法，从细胞整体、亚显微结构、分子水平体、亚显微结构、分子水平来研究细胞生命活动基本规来研究细胞生命活动基本规律的科学。
律的科学。
研究对象：
细胞研究对象：
细胞细胞（细胞（cell）是由膜包围着含有细胞）是由膜包围着含有细胞核核（或拟核或拟核）的原生质所组成的原生质所组成是生物体结构和功能的基本单位是生物体结构和功能的基本单位是生命活动的基本单元是生命活动的基本单元?
研究内容研究内容：
细胞各组分：
膜、质、器、核等细胞各组分：
膜、质、器、核等结构和功能以及相互关系。
结构和功能以及相互关系。
细胞整体和动态的功能活动：
细胞整体和动态的功能活动：
发育、分裂、分化、遗传、变异、发育、分裂、分化、遗传、变异、衰老、死亡等衰老、死亡等及其调控。
及其调控。
研究任务研究任务：
通通过过对对细细胞胞各各组组分分、细细胞胞整整体体和和动动态态的的功功能能活活动动的的研研究究，阐阐明明细细胞各种生命活动的本质和规律。
胞各种生命活动的本质和规律。
进进一一步步利利用用和和控控制制细细胞胞活活动动的的现现象象和和规规律律，达达到到造造福福于于人人类类的的目的。
目的。
为什么要从为什么要从三个层次来三个层次来研究细胞？
研究细胞？
为什么要把细胞为什么要把细胞单独作为一门学单独作为一门学科进行研究？
科进行研究？
细胞内具有细胞内具有高度有序且为动态的结构体系：
高度有序且为动态的结构体系：
遗传信息结构体系遗传信息结构体系膜结构体系膜结构体系细胞骨架结构体系细胞骨架结构体系分子复合物分子复合物三大结构体系三大结构体系细胞细胞生物体生物体二、细胞生物学与医学二、细胞生物学与医学
（一）细胞生物学是现代医学的重要
（一）细胞生物学是现代医学的重要基础理论基础理论
（二）现代医学重要课题的研究将依
（二）现代医学重要课题的研究将依赖于细胞生物学的更深入的发展赖于细胞生物学的更深入的发展如肿瘤发生的机制、治疗如肿瘤发生的机制、治疗（三）细胞生物学的研究成果应用于医学实践（三）细胞生物学的研究成果应用于医学实践如干细胞的研究如干细胞的研究1996年年7月月5日日，世世界界上上第第一一只只克克隆隆羊羊“多多利利”在在英英国国苏苏格格兰兰卢卢斯斯林林研研究究所所（伊伊恩恩博博士士）的的试验基地诞生。
试验基地诞生。
干细胞研究不仅为基础生物干细胞研究不仅为基础生物学研究开辟了新领域学研究开辟了新领域,还将还将为多种疾病的治疗新的思路为多种疾病的治疗新的思路和手段和手段三、细胞生物学发展历史三、细胞生物学发展历史
（一）萌芽阶段
（一）萌芽阶段17世纪中叶世纪中叶19世纪初叶世纪初叶1665年年RobertHooke：
CellcellMadebyA.vanLeeuwenhoek（1632-1723）.Magnificationrangesat50-275x.1675年年:
原生动物、原生动物、RBC、精子、精子
（二）
（二）细胞学说创立阶段细胞学说创立阶段19世纪初叶世纪初叶19世纪中叶世纪中叶MatthiasJacobSchleidenTheodarSchwann细胞学说细胞学说（celltheory）一切生物，从一切生物，从单细胞到高等动物单细胞到高等动物和植物都是由细胞和植物都是由细胞组成的，细胞是生组成的，细胞是生物形态结构和功能物形态结构和功能活动的基本单位。
活动的基本单位。
（三）经典细胞学阶段（三）经典细胞学阶段19世纪中叶世纪中叶20世纪初叶世纪初叶细胞核及其在分裂时的变化细胞核及其在分裂时的变化有丝分裂、减数分裂有丝分裂、减数分裂中心体、线粒体、高尔基复合体中心体、线粒体、高尔基复合体（四）实验细胞学阶段（四）实验细胞学阶段20世纪初叶世纪初叶20世纪中叶世纪中叶形态形态生理功能、生物化学、遗传发育机理生理功能、生物化学、遗传发育机理（细胞培养技术、电子显微镜）（细胞培养技术、电子显微镜）（五）（五）细胞生物学阶段细胞生物学阶段始于始于20世纪世纪60年代年代细胞生物学今后的发展方向细胞生物学今后的发展方向从从细胞细胞与与分子分子的角度研究：
的角度研究：
基因的结构、表达与调控基因的结构、表达与调控细胞内的信号转导细胞内的信号转导细胞结构体系的组装细胞结构体系的组装细胞增殖、分化、凋亡的相互关系细胞增殖、分化、凋亡的相互关系及其调控等。
及其调控等。
分子细胞生物学分子细胞生物学（molecularcellbiology）复复习习思思考考题题1、根据细胞生物学研究的内容与你所、根据细胞生物学研究的内容与你所掌握的知识，谈谈医学生学习细胞掌握的知识，谈谈医学生学习细胞生物学的必要性，并举例说明细胞生物学的必要性，并举例说明细胞生物学与医学的密切关系生物学与医学的密切关系2、细胞生物学是一门什么样的学科、细胞生物学是一门什么样的学科3、阐述细胞、细胞学说的内容、阐述细胞、细胞学说的内容第二章第二章细胞生物学的研究技术和方法细胞生物学的研究技术和方法本本章章内内容容提提要要一、形态结构研究：
显微结构、亚微结构一、形态结构研究：
显微结构、亚微结构二、细胞组分的测定及分离：
二、细胞组分的测定及分离：
细胞化学技术、放射自显影技术、细细胞化学技术、放射自显影技术、细胞组分的分级分离胞组分的分级分离三、其他实验技术：
三、其他实验技术：
细胞培养技术、细胞融合技术、细胞细胞培养技术、细胞融合技术、细胞原位分子杂交技术原位分子杂交技术一、形态结构观察一、形态结构观察
（一）显微结构
（一）显微结构（microscopicstructure）光镜下所见的细胞结构光镜下所见的细胞结构1、普通光镜、普通光镜分辨力分辨力显微镜或人眼在显微镜或人眼在25cm的明视距离处能够区分相近两点间最的明视距离处能够区分相近两点间最小距离的能力。
小距离的能力。
人肉眼分辨力：
人肉眼分辨力：
100m光镜最大分辨力：
光镜最大分辨力：
0.2m人卵细胞人卵细胞2、相差显微镜、相差显微镜观察活细胞观察活细胞（倒置相差显微镜）（倒置相差显微镜）观察活细胞内细胞器以及观察活细胞内细胞器以及液体介质中的细菌和真菌等液体介质中的细菌和真菌等特点特点:
反差大、分辨力高（反差大、分辨力高（0.04m）,但但不能分辨内部微细结构不能分辨内部微细结构3、暗视野显微镜、暗视野显微镜4、荧光显微镜、荧光显微镜对对细细胞胞中中的的荧荧光光物物质质进进行行定定性性、定位观察（可检测蛋白质、核酸）。
定位观察（可检测蛋白质、核酸）。
光源光源紫外线紫外线自发荧光自发荧光:
VitA、核黄素、叶绿素等核黄素、叶绿素等诱发荧光诱发荧光:
丫啶橙丫啶橙DNA黄黄色色RNA绿绿色色罗达明罗达明蛋白质蛋白质蓝色荧光示蓝色荧光示DNA；绿色荧光；绿色荧光示微管微管
（二）细胞的亚微结构
（二）细胞的亚微结构亚微结构（亚微结构（submicroscopicstructure）指细胞内小于指细胞内小于0.2m的的微细结构微细结构1、透射电子显微镜（、透射电子显微镜（TEM）观察细胞观察细胞内部内部细微结构细微结构特特点：
平面图象点：
平面图象分辨力：
分辨力：
0.08nnm2、扫描电子显微镜（扫描电子显微镜（SEM）观察样品（细胞）观察样品（细胞）表面表面形貌形貌特特点：
立体图象点：
立体图象分辨力：
分辨力：
3nnmFigure3-32.Cellsinculture.Scanningelectronmicrographofratfibroblastsgrowingontheplasticsurfaceofatissue-culturedish.3、高压电子显微镜（、高压电子显微镜（HEM）电镜电子束加速电压：
电镜电子束加速电压：
120KV以下以下常规常规EM120KV以上以上高压高压EM500KV以上以上超高压超高压EM特点：
特点：
分辨力高，可观察厚切片（分辨力高，可观察厚切片（1m）二、细胞组分的测定（二、细胞组分的测定（P27）及分离）及分离
（一）测定
（一）测定1、细胞化学技术、细胞化学技术保保持持细细胞胞完完整整结结构构的的基基础础上上，利利用用某某些些化化学学物物质质可可与与细细胞胞内内某某种种成成分分发发生生化化学学反反应应，在在局局部部范范围围内内形形成成有有色色沉沉淀淀（或或电电子子密密度度高高的的物物质质）的的原原理理，对对细细胞胞的的化化学学成成分分进进行定性、定位和定量的研究。
行定性、定位和定量的研究。
可对蛋白质（酶）、核酸、碳水化合可对蛋白质（酶）、核酸、碳水化合物等进行定性、定位、定量研究。
物等进行定性、定位、定量研究。
2、荧光细胞化学技术、荧光细胞化学技术原原理理：
用用荧荧光光色色素素对对细细胞胞进进行行染染色色，在在荧荧光光显显微微镜镜下下观观察察细细胞胞中中的的荧荧光光现现象象（研研究究对对象象同同上上，但但特特异异性性比比一一般般细细胞胞化化学学技技术术强强，灵敏度高）。
灵敏度高）。
3、放射自显影技术、放射自显影技术通通过过跟跟踪踪被被放放射射性性同同位位素素标标记记的的生生物物大大分分子子或或其其前前体体物物质质的的代代谢谢过过程程，在在不不破破坏坏组组织织和和细细胞胞结结构构的的情情况况下下，研研究究机机体体和和细细胞胞代代谢谢状状态态和和动态变化动态变化的过程。
的过程。
能揭示细胞分子水平的动态变化。
能揭示细胞分子水平的动态变化。
放射性同位素（放射性同位素（3H、32P、125I等）等）标记生物分子标记生物分子或其前体物质或其前体物质引入细胞或机体中引入细胞或机体中取组织制片取组织制片感感光光分析分析胸腺嘧啶胸腺嘧啶核苷酸核苷酸3H
（二）细胞组分的分离
（二）细胞组分的分离（P23）包括细胞各种结构和各化学组分的分离。
包括细胞各种结构和各化学组分的分离。
细胞分级分离法细胞分级分离法细胞各种结构的分离细胞各种结构的分离组织细胞匀浆组织细胞匀浆分级分离分级分离分析分析1、组织细胞匀浆、组织细胞匀浆机械性研磨细胞机械性研磨细胞2、分级分离、分级分离根根据据细细胞胞内内各各种种结结构构的的比比重重和和大大小小不不同同，而而致致在在同同一一离离心心场场内内沉沉降降速度也不相同的原理。
速度也不相同的原理。
差速离心差速离心密度梯度离心密度梯度离心差差速速离离心心3、分析、分析用细胞化学法等鉴定得到的组分用细胞化学法等鉴定得到的组分密度梯度离心密度梯度离心三、其它实验技术三、其它实验技术
（一）细胞培养技术
（一）细胞培养技术P21细细胞胞培培养养：
在在无无菌菌条条件件下下，从从活活体体中中取取出出的的细细胞胞或或其其它它建建系系细细胞胞，在在模模拟拟体体内内正正常常生生理理环环境境情情况况下下，使使之之能能继继续续生生存存、生生长长、增殖的一种方法。
增殖的一种方法。
原代培养：
原代培养：
传代培养：
传代培养：
当原代培养的细胞生长、增当原代培养的细胞生长、增殖达到一定密度后，从一个培养殖达到一定密度后，从一个培养器以一定比例分装或转移到另一器以一定比例分装或转移到另一个或两个以上容器中所进行的再个或两个以上容器中所进行的再次培养（传一次称为一代）。
次培养（传一次称为一代）。
指指直直接接从从肌肌体体获获取取组组织织或或细细胞胞后后立即进行的首次细胞培养。
立即进行的首次细胞培养。
细细胞胞培培养养技技术术是是细细胞胞生生物物学学中中最最基基本本、最最常常用用的的一一项项实实验验技技术术，细细胞胞大大量量生生理理、生生化化数数据以及功能活动资料大多由它而获得。
据以及功能活动资料大多由它而获得。
（a）：
Hela细胞细胞（b）：
中国地鼠卵巢细胞：
中国地鼠卵巢细胞
（二）细胞融合技术
（二）细胞融合技术细胞融合细胞融合:
指细胞彼此接触时，指细胞彼此接触时，两两个或个或两两个以个以上的细胞合并形成一个细胞的现象。
上的细胞合并形成一个细胞的现象。
细胞融合的结果：
细胞融合的结果：
含两个不同亲本细胞核的细胞含两个不同亲本细胞核的细胞含同一亲本细胞核的细胞含同一亲本细胞核的细胞异核体异核体同核体同核体自然融合自然融合人工诱导融合（生物、物理、化学）人工诱导融合（生物、物理、化学）细胞融合技术是研究细胞遗传、细胞融合技术是研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤等的重要手段，尤细胞免疫、肿瘤等的重要手段，尤其对单克隆抗体的产生开拓了一条其对单克隆抗体的产生开拓了一条新的途径。
新的途径。
单克隆抗体技术单克隆抗体技术B淋淋巴巴细细胞胞能能分分泌泌特特异异抗抗体体，但但不不能能长长期期培培养养，瘤瘤细细胞胞可可以以在在体体外外长长期期培培养养，但但不不分分泌泌特特异异抗抗体体。
于于是是Kohler和和Milstein1975将将两两种种细细胞胞杂杂交交而而创创立立了了单单克克隆隆抗抗体体技技术术，获获1984年年诺诺贝贝尔尔奖。
奖。
HAT:
hypoxanthine，aminopterin，thymidine（三）核酸分子杂交技术（三）核酸分子杂交技术P32利用碱基互补原则使两条核利用碱基互补原则使两条核酸单链形成双链杂交分子，该过酸单链形成双链杂交分子，该过程称核酸分子杂交。
应用此原理程称核酸分子杂交。
应用此原理检查两种核酸分子碱基排列的互检查两种核酸分子碱基排列的互补程度称核酸分子杂交技术。
补程度称核酸分子杂交技术。
细胞原位分子杂交技术：
细胞原位分子杂交技术：
使细胞中使细胞中DNA或或RNA在保持原在保持原来位置条件下进行的分子杂交。
可对来位置条件下进行的分子杂交。
可对所用材料中被杂交的所用材料中被杂交的DNA分子进行分子进行定位、定量分析以及基因表达水平的定位、定量分析以及基因表达水平的观察。
观察。
复复习习思思考考题题1、总结已学习过的各种显微镜的主要用途、总结已学习过的各种显微镜的主要用途2、细胞化学法的原理及应用、细胞化学法的原理及应用3、怎样获取细胞的不同组分、怎样获取细胞的不同组分4、两个不同亲本的细胞融合后可能得到哪、两个不同亲本的细胞融合后可能得到哪两种类型的细胞两种类型的细胞5、电镜下我们是怎样认识细胞结构的、电镜下我们是怎样认识细胞结构的
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