双黄连注射剂的工艺与质量标准研究.pptx
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双黄连注射剂的工艺双黄连注射剂的工艺与质量标准研究与质量标准研究张清波张清波黑龙江省药品检验所黑龙江省药品检验所二二九年八月十二日九年八月十二日主要内容n一、双黄连注射剂系列的品种概况n二、双黄连注射剂系列的研究概况n三、双黄连注射剂系列的指纹图谱研究n四、双黄连注射剂系列的质量研究n五、存在的主要问题FLOSLONICERAERADIXSCUTELLARIAEFRUCTUSFORSYTHIAE黄芩黄芩金银花金银花连翘连翘一、双黄连注射剂系列的品种概况功能与主治功能与主治:
清热解毒，清宣风热。
用于外感风热引起的发热、咳嗽清热解毒，清宣风热。
用于外感风热引起的发热、咳嗽、咽痛。
咽痛。
适用于病毒及细菌感染的上呼吸道感染、肺炎、扁桃体炎、咽炎等。
适用于病毒及细菌感染的上呼吸道感染、肺炎、扁桃体炎、咽炎等。
收载标准：
收载标准：
成方制剂十一册、中国药典成方制剂十一册、中国药典2005年版一部年版一部一、双黄连注射剂系列的品种概况n1、生产企业、生产企业：
黑龙江省生产双黄连注射剂企业共有11家（股份制企业5家、民营企业5家、私营企业1家），从业员工1.1万人。
这些企业分别建厂于1950年至2001年。
有20余年生产双黄连注射剂的历史，企业固定资产净值25亿元，年生产能力11.83亿支。
n22、剂型及规格、剂型及规格：
现有注射液、粉针剂、冻干粉针剂、滴注剂四个剂型；有20ml、300ml、500ml、0.6g、1.2g。
n33、生产量、生产量：
现11家从2000年到2008年底共生产双黄连注射剂2万余批次、27亿支；2004年至2008年生产1.49万批次、20.53亿支。
近三年来实现产值13.4亿元、利税2.1亿元，单品种产值占全行业总产值的12.96%。
n44、销售范围、销售范围：
目前这些企业的品种销往全国各地，分布最广的企业除台湾、香港、西藏外，各省市、自治区、直辖市均有销售和使用。
二、双黄连注射剂系列的研究概况第一阶段:
（2002年2004年）n1、对8家生产企业的近100批产品进行了初步质量分析；n2、进行企业工艺调研与实验室模拟工艺的研究；n3、与生产企业沟通，明确生产工艺应严格按照部颁标准执行n4、药材样本的采集：
共实地采集了不同产地的70多批药材；n5、考察不同采收季节、不同来源，不同产地的药材对指纹图谱的影响；n6、采用色谱指纹图谱技术，对双黄连注射剂指纹图谱的整个获取过程进行了方法学验证并测定了统一工艺路线后的样品n7、考察了药材、中间体与成品指纹图谱的相关性；n8、增加了成品中绿原酸、连翘苷的含量测定标准。
二、双黄连注射剂系列的研究概况第二阶段（2006年2008年）：
n1、根据样品的实测情况对双黄连注射液、注射用双黄连的指纹图谱的评价标准进行了改进；n2、增加了异常毒性、降压物质、过敏试验安全性检测标准。
n3、注射用双黄连指纹图谱已收载于中国药典2005年版一部增补本。
药厂实地调研，考察药厂实地调研，考察药材样品的采集药材样品的采集成品样品的收集成品样品的收集实验室模拟工艺小样实验室模拟工艺小样统一生产工艺统一生产工艺（中期会的召开）（中期会的召开）方法学验证方法学验证双黄连注射剂系列双黄连注射剂系列指纹图谱的建立指纹图谱的建立中间体指纹谱的研究中间体指纹谱的研究相关性考察相关性考察前期准备工作前期准备工作文献检索文献检索研究计划的制定研究计划的制定会议召开会议召开三、双黄连注射剂的指纹图谱研究三、双黄连注射剂的指纹图谱研究市场上近市场上近100批批成品的摸底成品的摸底药材指纹图谱的研究药材指纹图谱的研究双黄连注射剂系列双黄连注射剂系列质量标准的提高质量标准的提高指纹图谱条件的确立指纹图谱条件的确立技术报告的形成技术报告的形成征求反馈意见征求反馈意见生产工艺的追踪生产工艺的追踪工艺参数变动的影响工艺参数变动的影响统一工艺前八个不同厂家的双黄连注射液指纹图谱的比较统一工艺前八个不同厂家的双黄连注射液指纹图谱的比较从这八个厂家的样品色谱图可以看出，无论从色谱峰的个从这八个厂家的样品色谱图可以看出，无论从色谱峰的个数上，还是各峰面积的大小和相对比例，不同厂家的产品质量数上，还是各峰面积的大小和相对比例，不同厂家的产品质量不尽相同，尤其是保留时间在不尽相同，尤其是保留时间在10102020分钟的色谱峰个数、分钟的色谱峰个数、551010分钟的色谱峰面积，分钟的色谱峰面积，厂家之间差异很大。
厂家之间差异很大。
金银花与连翘分别煎煮提取与混合煎煮提取对指纹图谱的影响金银花与连翘分别煎煮提取与混合煎煮提取对指纹图谱的影响金银花、连翘混提与单提，特征色谱峰之间差异较大，表现在5、6、7号色谱峰在单提液中缺失或减弱。
除1、3号色谱峰相对稳定外，大多特征峰的相对峰面积比值发生变化，混提比单提有增高的趋势，表明混提增加了某些成分的溶出量。
实验室模拟小样金银花与连翘分别煎煮提取金银花与连翘混合煎煮提取金银花、连翘提取不同的煎煮时间对指纹图谱的影响金银花、连翘提取不同的煎煮时间对指纹图谱的影响峰号峰号保留保留时间相相对峰面峰面积RSD（%）煎煮煎煮2小小时/次次煎煮煎煮1小小时/次次15.9790.2110.2804.85929.2621.0001.0000.000310.2790.2760.3535.484411.2870.0340.0380.275515.0960.0500.0480.127615.5250.0400.0420.152715.8960.0830.0770.446820.1500.2560.1994.019921.2160.4430.4963.7331022.1710.0600.0580.1481126.0660.5040.5513.317对金银花、连翘提取的煎煮时间分别进行每次煎煮1小时和每次煎煮2小时的考察，结果特征峰的峰数与峰位没有变化，相对峰面积的比值变化不大。
金银花、连翘提取各步骤对指纹图谱的影响金银花、连翘提取各步骤对指纹图谱的影响峰号峰号保留保留时间醇沉醇沉纯化纯化稀配稀配RSD（%）15.9830.2800.1500.05511.29529.2361.0001.0001.0000.000310.2670.3530.1960.11412.184411.3300.0380.0210.0200.989515.1140.0480.0370.0350.689615.5440.0420.0320.0310.624715.9250.0770.0410.0352.286820.1640.1990.1030.1364.846921.1830.4960.3240.3349.6491022.1970.0580.0420.0361.1401126.0610.5510.3320.28214.292重点考察醇沉、纯化、稀配这三步留样。
HPLC分析结果显示，特征色谱峰的峰数与峰位无大的区别，即成分未有变化，但来自金银花药材的2号特征峰（绿原酸）及1、3、9、11号特征峰的峰面积随着一步步生产而降低，其它特征峰相比受影响较小。
醇沉纯化稀配金银花、连翘提取不同醇沉温度对指纹图谱的影响金银花、连翘提取不同醇沉温度对指纹图谱的影响峰号峰号保留保留时间相相对峰面峰面积RSD（%）20OC醇沉醇沉40OC醇沉醇沉60OC醇沉醇沉15.9860.1360.0820.0813.13229.2001.0001.0001.0000.000310.2670.1640.1670.1630.190411.2800.0250.0260.0260.019515.0830.0490.0660.0471.056615.5170.0420.0440.0420.070715.8920.0610.0630.0600.126820.1300.2560.2650.2530.607921.1640.4500.4680.4461.1381022.1660.0550.0560.0540.0811126.0550.3970.4070.3930.74240CO20CO60CO对金银花、连翘提取进行20C、40C、60C不同醇沉温度的考察，结果特征峰的峰数与峰位没有变化，相对峰面积的比值变化较小（RSD小于3%）金银花、连翘提取中冷藏放置与冷冻放置对指纹图谱的影响金银花、连翘提取中冷藏放置与冷冻放置对指纹图谱的影响峰号峰号保留保留时间相相对峰面峰面积RSD（%）冷藏冷藏冷冷冻15.9830.2720.2800.57629.2711.0001.0000.000310.2750.3340.3531.352411.2960.1590.0388.575515.1000.0470.0480.080615.5290.0430.0420.053715.9040.0810.0770.274820.1540.2170.1991.293921.2080.4880.4960.5721022.1710.0720.0580.9831126.0660.5630.5510.848对金银花、连翘药材水煎、浓缩后进行冷藏放置与冷冻放置对比考察，结果除4号特征峰差别较大外（冷藏的峰面积增值较大），其它均相差无几。
以上研究结果表明：
1、金银花、连翘药材的合煎与分煎对某些成分的溶出有较大的影响；2、生产工艺各步骤的一致性也是获得稳定的双黄连注射液指纹图谱的关键因素；3、在一定范围内，不同的煎煮时间、不同的醇沉温度对双黄连注射液指纹图谱的影响不大。
三、双黄连注射剂的指纹图谱研究双黄连注射剂药材指纹图谱的研究连翘药材连翘药材【中国药典中国药典】连翘为木犀科（连翘为木犀科（Oleaceae）连翘属植物连翘）连翘属植物连翘Forsythiasuspensa（Thunb.）Vahl.的干燥果实。
秋季果实初熟尚带绿色时采的干燥果实。
秋季果实初熟尚带绿色时采收，除去杂质，蒸熟，晒干，习称收，除去杂质，蒸熟，晒干，习称“青翘青翘”；果实熟透时采收，晒干，；果实熟透时采收，晒干，除去杂质，习称除去杂质，习称“老翘老翘”。
22批连翘批连翘药材的质药材的质量情况量情况来源来源水分（水分（%）连翘苷含量（苷含量（%）三精三精6.90.134晨星晨星6.00.295乌苏里江里江7.30.252福和福和华星星6.10.183齐齐哈哈尔尔7.00.088哈中哈中药二厂二厂6.40.115浙江浙江药检所提供（山所提供（山东产）6.10.126河南淅川河南淅川5.30.152三精河北安国（三精河北安国（2003年年10月上旬）月上旬）6.40.200三精山西降三精山西降县（2003年年1011月）月）7.10.068山西（青山西（青翘）12.10.612山西山西6.90.111山西陵川（老山西陵川（老翘）6.60.098栾川栾川县（伏牛山北）（伏牛山北）（2003年年11月）月）7.10.083栾川栾川县（伏牛山北）（青（伏牛山北）（青翘2003年年910月）月）6.60.079辉县南塞南塞镇（太行山（太行山02年老年老翘）7.70.047辉县南塞南塞镇（青（青翘水煮后晒干）水煮后晒干）5.30.206辉县南塞南塞镇（太行山（太行山03年老年老翘）7.60.312陕西商洛市山阳西商洛市山阳县玉竹玉竹乡7.20.091陕西西临汾（青汾（青翘）6.50.122商洛市商州商洛市商州县（2003年）年）7.00.043编号号保留保留时间山西山西陕西西栾川栾川辉南南陵川陵川812.74144.809254.42321.266115.767136.2261013.663160.6315.233395.051110.449214.5821214.5621385.105170.253135.429248.32470.0872021.346888.85232.18599.311824.281273.4932424.43514758.922557.8072055.913498.953993.9252625.76385.36559.82653.66944.99553.7362726.814616.897199.472263.935241.897317.0283637.035379.5276.96655.552230.448261.9013737.924962.039158.784100.574394.731207.0874440.924125.83273.951172.306104.606236.1944842.587264.63489.187159.407268.868474.2765244.23123.37159.18163.377218.658196.2245646.695414.1669.53982.698134.358177.1015949.95262.156150.72761.458145.694568.693不同产地青翘不同产地青翘指纹图谱指纹图谱编号号保留保留时间山西山西栾川栾川辉南南02辉南南03陵川陵川112.746244.096105.838148.517402.338292.936213.673333.769131.911174.775478.842359.515314.56969.824110.50642.545173.50191.267421.359173.135449.678398.463953.514421.195524.4821218.2141574.895741.3191671.2941519.973626.848161.595136.62656.855181.487168.898727.351102.1432.99759.298164.022150.951837.037216.25876.14348.68193.45103.987937.927228.20291.31248.804317.689201.4771040.903118.25768.01588.394197.192131.6021142.573274.572237.432164.058221.832458.2151249.951223.584106.84145.13684.168114.063不同产地老翘不同产地老翘指纹图谱指纹图谱有3对相同产地的青老翘，分别是山西、栾川、陵川，把它们的图谱进行比较发现：
1、山西青老翘在色谱峰的保留时间和峰数上较为一致，只是峰面积有所增减，如老翘中10.919、12.737、13.662的峰面积稍有增加，而14.562、18.850、21.323、46.666和37.902（连翘苷）的峰面积明显减少；2、栾川青老翘在色谱峰的保留时间和峰数上也较为一致，老翘色谱峰除了12.737、13.662峰面积减少外，其它色谱峰无明显变化；3、陵川老翘则在10.919、49.944峰面积明显减少，其它峰面积无明显变化。
总之，相同产地的老翘大部分色谱峰峰面积均比青翘减少。
相同产地相同产地青、老翘青、老翘指纹图谱指纹图谱双黄连注射剂药材指纹图谱研究黄芩药材黄芩药材【中国药典中国药典】黄芩为唇形科植物黄芩黄芩为唇形科植物黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥的干燥根，春秋二季采挖，除去须根和泥沙，晒后撞去粗皮，晒干。
根，春秋二季采挖，除去须根和泥沙，晒后撞去粗皮，晒干。
药材样品的收集药材样品的收集黄芩药材的匹配结果黄芩药材的匹配结果双黄连注射剂药材指纹图谱研究金银花药材金银花药材【中国药典中国药典】本品为忍冬科植物忍冬本品为忍冬科植物忍冬LonicerajaponicaThunb.、红腺忍冬红腺忍冬LonicerahypoglaucaMiq.、山银花、山银花LoniceraconfusaDC或毛花柱忍冬或毛花柱忍冬LoniceradasystylaRehd.的干燥花蕾或带初开的花。
夏初花开放前采收，干燥。
的干燥花蕾或带初开的花。
夏初花开放前采收，干燥。
金银花质量情况金银花质量情况金银花同山银花比较金银花同山银花比较7批金银花药材的图谱比较批金银花药材的图谱比较忍冬与红腺忍冬的区别忍冬与红腺忍冬的区别n1、不同品种的药材得到的指纹图谱不同；n2、不同产地的药材得到的指纹图谱不同；n3、不同采收季节的药材得到的指纹图谱不同n4、要获得到稳定、均一的成品指纹图谱，固定药材的品种、产地、采收季节是不可忽略的因素之一。
双黄连注射剂药材指纹图谱研究金银花中间体在金银花药材中的追踪金银花中间体在金银花药材中的追踪三、双黄连注射剂的指纹图谱研究金银花中间体金银花药材连翘提取物三、双黄连注射剂的指纹图谱研究连翘中间体在连翘药材中的追踪连翘中间体在连翘药材中的追踪连翘药材5批黄芩提取物匹配结果三、双黄连注射剂的指纹图谱研究黄芩中间体在黄芩药材中的追踪黄芩中间体在黄芩药材中的追踪三、双黄连注射剂的指纹图谱研究1、中间体的各特征峰均可在药材指纹图谱中得到追踪；2、药材通过适当的方法提取纯化后的HPLC谱图中的色谱峰比中间体的多；3、中间体色谱图与相对应的药材色谱图在对应峰的量上有所变化。
4、建立的指纹图谱可以很好地控制药材、中间体乃至成品的质量。
样品的测定样品的测定10个厂家个厂家21批样品批样品6个厂家个厂家18批样品批样品从整个色谱峰面积看：
1、各厂家的黄芩苷的投料比较稳定（10号峰的峰面积RSD值最小）；2、属于连翘的5、6号色谱峰和属于金银花及连翘的7号峰，属于黄芩及连翘的8号峰的峰面积虽然不大，也相对比较稳定；3、属于金银花的1-4号和9号峰变化较大；结果表明，确保不同厂家生产出相同质量产品的关键是1-4号和9号这5个色谱峰的峰面积的相对稳定，即金银花的质量和生产工艺的同一性。
三、双黄连注射剂的指纹图谱研究三、双黄连注射剂的指纹图谱研究21批双黄连注射液指纹图谱相似度批双黄连注射液指纹图谱相似度输出黄芩苷信号未输出黄芩苷信号11批双黄连注射液指纹图谱相似度（未输出黄芩苷信号）双黄连注射液对照指纹图谱（未输出黄芩苷信号）双黄连注射液双黄连注射液药材与成品、中间体的相关性药材与成品、中间体的相关性色谱峰描述色谱峰描述共有10个特征峰，分为两部分，保留时间在15分钟以前的是14号峰，不应有多峰现象，其中2号峰为绿原酸，其分离度高，峰面积积分值适中，作为参照峰（S）；13号峰来自金银花药材；4号峰为连翘药材中含有的成分，同时也是工艺过程中转化的产物。
保留时间在15分钟以后的是510号峰，其中5、6号峰为连翘药材的特征峰，7号峰为连翘和金银花药材所共有，8号峰为连翘和黄芩药材所共有，9号峰为金银花药材的特征峰，10号峰为黄芩苷，10号峰之后有一组黄芩药材的特征峰。
双黄连注射液对照指纹图谱双黄连注射液对照指纹图谱金银花金银花连翘连翘黄芩黄芩注射用双黄连对照图谱色谱峰描述色谱峰描述：
共有7个特征峰，分为两部分，保留时间在15分钟以前的是1-3号峰，均来自金银花药材，2号峰为绿原酸；保留时间在15分钟以后的4、5号峰为连翘药材的特征峰，6号峰为金银花药材的特征峰，7号峰为黄芩苷色谱峰。
金银花金银花连翘连翘黄芩黄芩注射用双黄连注射用双黄连1：
绿原酸：
绿原酸2：
咖啡酸：
咖啡酸3：
木犀草苷：
木犀草苷4：
金丝桃苷：
金丝桃苷5：
芦丁：
芦丁6：
黄芩苷：
黄芩苷7：
木犀草素：
木犀草素8：
黄芩素：
黄芩素9：
汉黄芩素：
汉黄芩素10：
连翘苷：
连翘苷11：
獐牙菜苦苷：
獐牙菜苦苷双黄连注射液化学物质基础的研究双黄连注射液化学物质基础的研究混合对照品双黄连注射液双黄连注射液123456789101112131411、11种对照品在350nm处，除连翘苷、獐牙菜苦苷没有吸收外，其它9种对照品均可显现，且分离良好；2、成品色谱图中，具有与9种对照品相同的保留时间，且光谱图相似的有5个色谱峰：
2号峰可能是绿原酸，4号峰可能是咖啡酸，10号峰可能是黄芩苷，13号峰可能是黄芩素，14号峰可能是汉黄芩素，其它所对应成分，有待以后进一步分析确认；3、根据质谱检测结果经对照品比对，2号峰和10号峰确定为绿原酸和黄芩苷，其它的化学成分还需进一步的确认。
双黄连注射液化学物质基础的研究双黄连注射液化学物质基础的研究总结11、通过药材指纹图谱的研究，明确了药材的产地、品、通过药材指纹图谱的研究，明确了药材的产地、品种，为成品的稳定、均一打下了物质基础；种，为成品的稳定、均一打下了物质基础；22、中间体指纹图谱的研究使企业的生产过程达到了可、中间体指纹图谱的研究使企业的生产过程达到了可控；控；33、成品指纹图谱可以体现不同企业产品的同一性及同、成品指纹图谱可以体现不同企业产品的同一性及同企业产品的稳定性，在产品的整体性上可给予评价。
企业产品的稳定性，在产品的整体性上可给予评价。
三、双黄连注射剂的指纹图谱研究四、双黄连注射剂系列的质量标准提高n1、多厂家产品质量不一致。
n2、不同厂家所用原料产地不一致。
n3、化学成分基础研究不足。
五、存在的主要问题
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