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分子生物学辅导笔记

（前4章注意概念就行了，重点是转座子，RNA编辑）

Chapter1真核生物基因组结构与功能的特点本章应掌握的基本概念

•细胞核基因组的大小；

•C值矛盾；

•重复序列；

•基因家族；

•真核基因的断裂结构

基因家族（genefamily）指核苷酸序列或编码产物的结构具有一定程度同源性的一组基因。

假基因（pseudogene）在多基因家族中有的成员并不能表达出有功能的产物。

•1、核酸序列相同：

即为多拷贝基因如rRNA基因家族，tRNA基因家族，组蛋白基因家族。

•2、核酸序列高度同源：

如人类生长激素基因家族包括三种激素的基因，人生长激素、人胎盘促乳素和催乳素，它们之间高度同源。

•3、编码产物有同源功能：

基因序列的相似性可能较低，但基因编码的产物具有高度保守的功能区。

如src癌基因家族

•4、编码产物具有小段保守基序：

有些基因家族中各成员的DNA序列可能不明显相关，而所编码的产物却有共同的功能特征，存在小段保守的氨基酸基序。

基因超家族（genesuperfamily）指一组由多基因家族及单基因组成的更大的基因家族，它们的结构有不同的同源性，但功能并不一定相同。

如免疫球蛋白基因超家族。

真核基因的断裂结构

断裂基因（splitgene）基因与基因间的非编码序列为间隔DNA（spacerDNA）.

内含子（intron）无编码意义的DNA片段

外显子（extron）具有编码意义的DNA片段

Chapter2叶绿体基因组

•本章应掌握的基本概念

•叶绿体DNA的信息含量；

•叶绿体基因组的结构；

•叶绿体基因的组成；（记忆每个大标题，了解就可以了）

•叶绿体基因的一些结构特征。

•★p33.RNA编辑

Chapter3线粒体基因组

•本章应掌握的基本概念

•线粒体基因组的大小；

•线粒体基因组的组织结构；

•线粒体基因组的组成；

•线粒体基因的一些特征；

•★p44.RNA编辑；（注意概念，分类，★意义）

•遗传信息在基因组之间的流动。

（适当关注）

Chapter4可移位遗传因子

•本章应掌握的基本概念

•可移位因子的类型；

•转座子；

•LTR逆转录转座子；

•无LTR逆转录转座子；

转位因子（transposableelement）可移动的基因成分，指能在一个DNA分子内部或两个DNA分子之间移动的片段。

在细菌中可指在质粒和染色体之间或在质粒和质粒之间移动的片段。

•转位因子的主要类型

•插入序列（insertionsequence,IS）

•转座子（transposon,Tn）

•逆转录转座子（retroposonsorretrotransposon）

•转座的噬菌体（transposablephage）

插入序列（Insertionsequence）一类简单转位因子，长度约700~2000bp，由一个转位酶基因及两侧的反向重复序列（invertedrepeatsequence,IR）组成，不带任何其它基因。

转位时复制宿主靶位点一小段DNA（4~15bp）形成两端的正向重复序列。

转座子（transposon,Tn）一类较大的可移动成分。

除有关转座的基因外，至少带有一个与转座作用无关并决定宿主菌遗传性状的基因。

转座子中的转位酶常称为转座酶，其功能是介导转座子插入到DNA的其它部位。

转座子与基因表达的关系：

插入编码区，插入5’侧向序列，可在不同植物中起作用

1984年McClintock（巴巴拉．麦克林托克）就提出转座子在植物基因组的重建中起着很重要的作用。

转座子在调节和编码区域的插入和切除都能改变基因的编码功能和表达模式，但在抗病基因分子生物学的研究中，尚未有证据直接证明抗病基因座中新的专化性抗性基因的产生是由转座子的插入或切除所致。

不过已有试验表明，由转座子诱发的基因改变能引起抗病基因的失活和多样化。

转座子通常会造成破坏，而在本例中，它们看来对寄主有利。

加州大学戴维斯分校进化遗传学家ＴｏｄｄＳｃｈｌｅｎｋｅ和同事ＤａｖｉｄＢｅｇｕｎ偶然间发现果蝇加州种群体内有一条含１０万个ＤＮＡ碱基对的染色体片段，所包含的全部基因不存在个体差异。

原因可能是该相同区域中某个特别的等位基因迅速扩散到了整个种群，同时捎带上它附近的各等位基因Ｃｙｐ６ｇ１基因，它与一个“跳跃基因”相连，负责清除杀虫剂和其他毒物的毒性。

试验表明，当转座子存在时，Ｃｙｐ６ｇ１基因比较活跃，这可能是由于跳跃过程打开了某个“基因开关”，而Ｃｙｐ６ｇ１基因通常是处于关闭状态的。

逆转录转座子（retroposonsorretrotransposon）：

逆转录转座子又称“反转位子”。

这些流动的遗传元素首先被转录成RNA，然后再被由该反转位子本身产生的一种逆向转录酶重新转变成DNA。

该DNA版本可在任何位置结合进基因组中。

LTR逆转录转座子p58：

在结构、转录特性和转座机制上十分类似于逆转录病毒的原病毒，在其两端具有长的同相重复序列（LTRs）

无LTR逆转录转座子p63：

有与逆转录转座子类似的序列结构，但两端缺少长的同相重复序列。

典型的例子是长散布元件（longinterspersedelement，LINE）

转座的噬菌体（transposablephage）：

具有转座功能的溶源性噬菌体

Chapter5核酸的分子操作

5.1限制性内切酶概念、分类、性质（做一般性的了解）

限制性内切酶：

一类能识别双链DNA中短的特定碱基序列，并在序列内或旁侧一定距离内特异切割双链DNA的核酸水解酶。

是体外剪切DNA的重要工具。

分为I，II，III型

同裂酶：

两种酶的识别核苷酸顺序和切割位点都相同，它的区别只是在于，当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种可以切割，而另一种不能切割。

同尾酶：

两种酶的识别序列不完全相同，但是切割后产生的粘性末端是相同的。

限制性内切酶酶促反应的条件（需要注意）

1．DNA的纯度

2．DNA的甲基化程度

3．酶切的反应温度，一般为37℃

4．DNA的分子结构

5．溶液中的离子强度核种类

6．缓冲液的ph值

星活性（staract）：

当条件改变时，可能改变酶切识别序列的专一性，这种酶切特异性降低的现象称为星活性或星号活性

引起星活性的因素

1.甘油的浓度过高>5%

2.酶过量>100单位/ug

3.低离子强度<25mM

4.高ph值>8.0

5.有机溶剂,如乙醇，乙二醇等

6.用其他阳离子代替Mg离子

避免星活性的方法相应有：

减少酶的用量，降低甘油浓度，提高离子强度，保证反正体系中没有有机溶剂，降低ph值，用Mg离子做二价阳离子。

5.2操作和标记核酸的酶（了解）

5.3核酸分子杂交技术

概念：

具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。

核酸分子杂交的基本原理:

DNA变性和复性或杂交（hybridization）

影响杂交的因素

1．核酸分子的浓度和长度：

浓度大，复性快；分子量大，复性慢

2．温度

3．离子强度

4．杂交液中的甲酰胺

5．核酸分子的复杂性

6．非特异性杂交反应预杂交：

封闭非特异性杂交位点，用鲑鱼精子DNA

分子杂交的基本方法

1．Southern印迹法：

DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。

2．Northern印迹法：

检测RNA（主要是mRNA）的方法

3．斑点印迹杂交：

将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上。

优点：

简单、快速、可同时检测多个样品

4．原位杂交：

将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交，称为原位杂交。

5．Western印迹法：

检测蛋白质，即将电泳分离的非标记蛋白质转移到固相载体上，用特异的抗血清对蛋白质进行鉴定及定量的方法

6．液相杂交

Chapter6分子克隆

本章应掌握

作为受体细胞的大肠杆菌；

★由质粒衍生的载体；

由λ噬菌体衍生的载体；

粘粒载体；

单链丝状噬菌体M13载体；

★外源DNA与载体重组；

★重组DNA导入受体细胞；

★阳性重组体的筛选和鉴定。

本章涉及的主要概念

基因克隆:

利用重组DNA技术分离目的基因

克隆:

动词：

指从单一祖先产生同一的DNA分子群体或细胞群体的过程

名词：

指从一个共同祖先无性繁殖下来的一群遗传上同一的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。

基因文库：

由大量含有特定基因的不同DNA片段的克隆所构成的群体，分为基因组文库和cDNA文库

基因文库的构建：

如果构建基因组文库，首先提取基因组DNA，随机打断，打断的方法有物理和生物方法，物理方法是超声波粉碎（主要使用的方法），生物方法是酶切，然后用这些片段构建质粒，转化并表达于大肠杆菌，得到大量的克隆。

再将得到的序列进行测序，测序完成后就建成了基因文库。

对于文库中的每一个克隆它的序列都是已知的。

cDNA文库的构建基本相似，先提取mRNA，然后反转录得到cDNA，打断，装入质粒，大量表达，最后测序。

载体：

将外源DNA或基因携带入宿主细胞（hostcell）的工具称为载体

载体应具备以下特点：

1.在宿主细胞内必须能够自主复制（具备复制原点）；

2.必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不影响其复制；

3.有一定的选择标记，用于筛选；

4.有一定的拷贝数，便于制备。

5.附加因素：

MSC，LacZ’（α-互补），ssDNA，phage，origin，Promoter以及cos位点等。

载体的类型质粒（plasmid）、噬菌体（phage）、粘粒载体（cosmid，又称柯斯质粒）、噬菌粒（phagemid）

第一节质粒载体

（Plasmidvectors）

一、质粒的基本特性

1．概念:

染色体外的遗传因子，能进行自我复制（但依赖于宿主编码的酶和蛋白质）;大多数为双链、闭合环壮DNA分子，少数为线性;大小1kb～20kb，也有更大的（200kb）

2．质粒的表型：

抗抗菌素、抗重金属、产生抗菌素、产生大肠杆菌素、产生溶血素、产生肠毒素、产生硫化氢、降解芳香族化合物、诱发植物肿瘤、糖发酵、产生限制酶和修饰酶

3．质粒的拷贝数：

严紧型：

拷贝数有限，大约1～几个；松弛型：

拷贝数较多，几十至几百

4．质粒的不相容性：

两个质粒在同一宿主中不能共存的现象。

在第二个质粒导入后，在不涉及DNA限制系统时，不相容的质粒一般为利用同一复制系统，质粒分配到子细胞时会发生竞争，随机挑选，微小差异，最终放大。

5．转移性：

在自然条件下，很多质粒可以通过称为细菌接合的作用转移到新宿主内。

供体和受体细胞通过供体细胞表面的纤毛接触，然后一个质粒拷贝通过该纤毛进入受体细胞

F质粒：

又叫F因子，即致育因子（fertilityfactor）的简称，为细菌的游离基因，在细菌的结合中使细菌能够起雄性的作用。

雄性细菌充当一个DNA供体并产生F性须，通过F性须DNA被转移到受体的雌性细胞。

二、标记基因（做一般性了解）

（1）氨苄青霉素抗性基因（AmpRamprampicillin）

青霉素抑制细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。

（2）四环素抗性基因（tetrtetracycline）

与核糖体30S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位

（3）氯霉素抗性基因（chloramphenicol,CmrorCat）

Cm与核糖体50S亚基结合并抑制蛋白质合成。

（4）卡那霉素和新霉素抗性基因（kanamycin／neomycin）

可与核糖体成分相结合并抑制蛋白质合成的脱氧链霉胺氮基糖苷

★α-互补（αcomplementation）p90.LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。

用做筛选标记

MCS（Multiplecloningsites）多克隆位点：

人工构建的，紧密排列的具有多种限制酶识别序列的一段DNA序列，可方便的用于外源DNA片段的插入。

限制酶谱筛选

1．转化后挑取许多独立的细菌菌落

2．少量培养并提取质粒

3．根据克隆片段和插入载体的位点，选择合适的限制酶进行酶切

4．凝胶电泳分析限制酶图谱，从而选出阳性克隆

表达筛选

1．构建表达载体（含高效启动子）

2．鉴定表达产物——蛋白质的分子大小

3．还可利用抗体进行筛选

核酸探针筛选

根据核酸序列的同源性，利用核酸探针与转化后宿主细胞中的质粒杂交，可筛选出重组的质粒。

这种方法多用于大量筛选

★天然质粒用作克隆载体的局限性

1．分子量较大，不便于操作

2．拷贝数较低，不利于质粒DNA的制备

3．抗菌素抗性基因少，不便于选择

4．单一的限制性酶切位点少，且不集中，不利于基因克隆

★质粒载体应具备的基本条件

设法将一些克隆中常见的有用性状组装进质粒载体，将天然质粒改造成理想的基因操作载体或适合于特定用途的载体。

1．具有复制起点

2．具有抗菌素抗性基因

3．具有若干限制酶单一识别位点，且在其中插入适当大小的外源DNA片段之后，应不影响质粒DNA的复制功能

4．具有较小的分子量和较高的拷贝数

复制子（replicon）：

能够自我复制，而且仅具有一个复制起点的DNA分子

三、质粒载体的种类（一般了解）

pBR322是最早人工构建的质粒

1.克隆载体：

用于扩增或保存DNA片段，为最简单的载体。

如pBR322

2.表达载体

基因的表达包括转录、翻译与翻译后加工、分离纯化等过程

根据被表达的基因和表达基因所用的系统，可将表达分为：

1）原核基因在原核细胞中表达

2）真核基因在原核细胞中表达

3）原核基因在真核细胞中表达

4）真核基因在真核细胞中表达

原核表达系统主要有：

1）E.coli系统

2）枯草杆菌系统

真核表达系统主要有：

1）酵母细胞系统

2）哺乳动物细胞系统

3）昆虫细胞（杆状病毒）系统

4）高等植物系统

克隆载体与表达载体的区别

1．在原核克隆载体中通常都带一个松驰型复制子、一个多克隆位点和一个筛选标记，以便被克隆和筛选的DNA序列能够大量增殖。

2．原核表达载体除了上述因子外，还需要有强启动子、核糖体结合位点、转录起始信号、转录终止信号、翻译起始密码子和终止密码子等一系列调控序列。

表达载体的选择非常重要，选择时主要应考虑下列因素：

1.所表达的蛋白质是融合蛋白还是天然蛋白。

如果是天然蛋白，必须考虑如何将目的基因准确地与载体衔接。

如果是融合蛋白，则可以用三种不同阅读框架的载体使目的基因与载体序列吻合。

2.被表达的基因是原核基因还是真核基因。

原核基因一般都带有核糖体结合位点，只需考虑它是否带有强启动子。

对真核基因除考虑该基因是否带有启动子、核糖体结合位点外，还须考虑该基因是否会产生翻译后加工，以后是否需要转到真核表达系统中表达等。

核糖体结合位点（ribosome-bindingsite）又称SD序列（Shine-Dalgarnosequence），它是指mRNA分子中能与核糖体结合的序列，通常位于翻译起始密码子前面3～12个碱基，该序列与16SrRNA的3’端互补。

3.表达蛋白是否分泌到体外。

如需要分泌，则必须带有信号肽序列，故应选择带适当信号肽序列的载体。

信号肽（signalpeptide）又称前导肽（1eaderpeptide），这是一种位于分泌蛋白质或输出蛋白质N端上长约15～30个氨基酸的序列，可被细胞的蛋白质加工机制所识别，使蛋白质通过细胞膜被分泌出来。

4.所产生的融合蛋白是否需要切割加工及如何切割加工。

对需要切割的融合蛋白，在目的基因和载体序列间应有适当的切割识别序列。

5.是否需要用强启动子提高表达水平。

当需要提高表达水平时，可选用强启动子。

但在某些情况下，由于被表达蛋白质对宿主有毒或其大量表达对宿主不利，可选用诱导型载体，只有经诱导后，蛋白质才能被表达。

表达融合蛋白的优点

以E.coli基因与外源目的蛋白基因组成融合基因产生的融合蛋白，可用作抗原产生抗体，然后用这种抗体测定或分离天然的目的蛋白。

融合蛋白有下列优点：

1.转录和翻译起始从正常的E.coli序列开始，故通常可以产生高水平的融合蛋白。

2.融合蛋白往往比天然的外源蛋白更加稳定。

3.产生的融合蛋白较大，因此很容易从蛋白质凝胶电泳中区别出来。

融合蛋白带可以从凝胶上切下，经冷冻干燥，磨成粉末后即可作为抗原。

4.有些融合蛋白带有信号肽，可以分泌到细胞外，这有助于蛋白质的分离和纯化。

真核基因的表达载体

对表达真核基因，除了启动子外，还需要有一个有效的核糖体结合位点。

因为只有当被转录的mRNA与核糖体结合后，mRNA才能被有效地翻译。

真核基因的第二个密码子必须紧接在ATG之后，才能产生一个完整的蛋白质。

因此需要用人工合成的转接头、人工合成的DNA引物或用DNA切割修补等方法使真核基因与载体的序列完全吻合。

分泌型表达载体

有时为减少所需蛋白质在宿主体内被蛋白酶降解，或为使蛋白质能够在体外正确折叠和便于提纯，经常需要将被表达的蛋白质分泌到细胞外，因此要用分泌型载体。

分泌型载体的优点

1．一些在胞内被蛋白酶降解的蛋白质在周质中很稳定。

2．一些在胞内无活性的蛋白质在分泌后便具有活性，分泌可能使蛋白质能够正确折叠。

3．产生的蛋白质没有氨基末端甲硫氨酸，因为切割位点在信号肽与编码序列之间，甲硫氨酸会影响许多蛋白质的活性。

分泌型载体的缺点

1．目的蛋白质的产量往往很低，

2．信号肽不能被切除或切在错误位置。

提高原核细胞中外源基因表达效率的措施

1．以融合蛋白表达目的蛋白提高融合蛋白的稳定性和产量。

2．使用强启动子提高mRNA产量，并在基因下游加入稳定mRNA的强转录终止子，防止转录过度。

3．调整SD序列与ATG间的距离。

SD序列与ATG的距离过长或过短都会影响目的基因的表达，有时由于这种距离的影响蛋白质合成会相差2,000倍以上。

应该在目的基因ATG上游100bp左右开始，用酶切形成不同长度的片段，与带启动子和SD序列的载体连接后，产生一系列重组DNA。

从中选择产生高水平天然目的蛋白的重组体。

4．利用蛋白酶缺陷型的宿主，例如用lon营养缺陷型减少外源蛋白的降解。

5．在宿主内表达蛋白酶抑制产物，从而抑制蛋白酶活性。

6．使蛋白质分泌到体外，减少反馈抑制或蛋白酶降解。

7．调整带目的基因的表达质粒的拷贝数，增加模板数。

8．利用诱导物进行表达。

过早地大量表达外源基因往往影响宿主细胞的繁殖，因此当不表达时，可使宿主细胞迅速繁殖生长得到较大的生物量，然后利用诱导物诱导目的基因表达。

9．人工合成目的基因，在不改变蛋白质氨基酸的前提下，根据简并性，利用宿主偏爱的密码子改变部分碱基序列。

10．定点诱变，消除核糖体结合位点附近可能的二级结构，这种二级结构会影响翻译起始效率。

外源DNA与载体重组

粘性末端连接：

连接效率高

若DNA插入片段与适当的载体存在同源粘性末端，这将是最方便的克隆途径。

同源粘性末端包括相同内切酶产生的粘性末端和不同的内切酶产生的互补粘性末端。

相同内切酶产生的粘末端连接得到的重组质粒能够保留接合处的限制酶切位点，因此可以使用原来酶将插入片段从重组体上完整地重新切割下来。

而不同酶产生的粘性末端连接得到的重组质粒不能够保留接合处的限制酶切位点，因此不可以使用原来酶将插入片段从重组体上完整地重新切割下来。

以上两类粘性末端的连接方法都很重要。

另外，当用单酶切时，虽然产生了互补的粘性末端，但由于载体存在自连现象，也会降低正确插入的频率。

通过一些处理可以减少自连现象的发生。

常用的方法是用小肠碱性磷酸酶（CIP）去掉载体5-磷酸来达到抑制DNA片段的自身环化的目的。

综上所述，在进行基因重组时，一般采用插入片段及载体两端具有两个相应的能够产生粘性末端的酶进行酶切后重组，如插入片段和载体的一端为EcoRI，另一端为BamHI，它们都能产生粘性末端，不仅易于连接，而且又不能互补，所以能够得到较好的重组结果。

平端连接：

连接效率低

待插入片段的平末端主要由两方面来源，即由酶切后产生的平端和补平后产生的平端。

一般由酶切产生的平端较易连接。

但在试验过程中，往往会遇到插入片段和载体之间没有互补的末端，这时，就需要将末端进行“补平”或去除3突出端，然后再用T4噬菌体DNA连接酶连接两个平端。

不过，平端连接的效率是比较低的，一般通过提高DNA的浓度或增加连接酶的用量可提高平端的连接效率，有时也可采取在平端加上合成的接头的方法，产生粘性末端，也可以提高连接的效率。

一端是粘性末端，另一端是平末端连接

不需要去磷酸化。

作连接用的基因片段要纯化，量大一点，感受态做好一点。

只是通常连接时间会长一点（过夜好一点），用比较浓的酶。

重组DNA导入宿主

要注意的几个名词：

转化转导转染感染结合

转化（transformation）：

即一来自一个细菌细胞（供体）DNA（片段）被另一个细胞（受体）所吸收（随后同受体染色体一起进行重组）

感受态细胞（competentcell）：

能够吸收DNA的细胞

转导（transduction）：

由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程或者说由噬菌体将细菌基因由一个细菌（供体）转移到另一个细菌（受体）的过程。

转染（transfection）：

感受态细胞经分离出来的噬菌体核酸感染,随后能产生出正常噬菌体后代或者说真核细胞主动摄取或被动导入外源DNA片段而获得新的表型的过程。

感染（infection）：

病原微生物在寄主组织内立足的状态

目的基因的筛选和鉴定（screening/selection）

1．遗传学方法

插入灭活法（insertioninactivation）:

抗药性标志选择

标志补救：

表达产物与营养缺陷互补。

包括α-互补、蓝白斑筛选

2．免疫学方法

3．分子杂交探针--原位杂交

4．PCR

5．限制性酶切图谱

第七章DNA序列测定与分析

★测序策略

Sanger双脱氧链终止法

Maxam-Gilbert化学直读法

杂交测序与DNA芯片技术

★EST

DNA序列分析

DNA序列测定的几个支撑技术

Sanger双脱氧末端终止法；PCR技术；DNA自动测序仪的发展；生物信息学分析软硬件设施

大规模基因组测序的两种策略

逐步克隆法（ClonebyClone）

基因组DNA→BAC文库→根据物理图谱正确定位的BAC或contig→用于霰弹法测序的候选克隆→用于霰弹法测序的亚克隆→测序并组装→完整的基因组序列

全基因组霰弹法（WholeGenomeShot-gun）又叫鸟枪法

基因组DNA→霰弹法克隆→测序并进行全基因组序列组装→完整的基因组序列

两种大规模基因组测序策略的比较

项目

策略

全基因组霰弹法

逐步克隆法

遗传背景

不需要

需要（需构建精确的物理图）谱）

速度

快

慢

费用

低

高

计算机性能

高（以全基因组为单位进行）拼接）

低（以BAC为单位进行拼接）

适用范围

工作框架图

精细图

代表测序物种

果蝇、拟南芥、水稻

人、线虫

物理图谱的构建（不是重点）

★大规模表达序列标签（EST）测定及分析　p120.

需要掌握：

★1、什么是EST?

★2、EST的应用

3、EST序列测定及分析过程

★ESTs（ExpressedS