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松材线虫病检疫技术操作办法概述
松材线虫病检疫技术操作办法
2009年08月07日 点击数：
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中国森防信息网
松材线虫检疫技术操作办法
1 主题内容及应检范围
1.1 本办法规定了松材线虫Bursaphelenchus xylophilus（SteineretBuhrer）Nickle的检疫检验及检疫处理操作办法。
1.2 本办法适用于林业植物检疫机构对松科植物中松属Pinusspp.、冷杉属Abiesspp.、云杉属Piceaspp.、雪松属Cedruspp.s、落叶松属Larixspp.植物的树木、枝条、伐桩、木材（含原木、锯材、切片）及其制品（含包装材料、电缆盘等）的检疫检验和检疫处理。
2 产地检疫
2.1 踏查
2.1.1 在由松科植物构成的，或以松树为主的生态林、用材林，特别是有松树栽植的风景名胜地，疫情发生区及毗邻地区，曾调入染疫木材（含原木、锯材、切片）及其制品的城镇、工矿企业、交通干线附近、无线通讯台站、广播电视信号台站、电力线路、仓库、码头、车站、驻军营房、贮木场及加工场（点）、集贸市场，以自然界线、道路为单位进行线路（目测）调查。
2.1.2 调查松树的针叶是否有黄绿色、黄褐色、红褐色萎蔫，是否整株枯死或未全部变红仍有部分呈绿色；枯死树针叶在小枝上当年不脱落（如黑松、马尾松等）或脱落（如思茅松）；树脂分泌急剧减少，甚至停止；材质干枯，有蓝变现象。
2.1.3 调查松树是否有天牛危害的羽化孔、侵入孔、蛀道等痕迹。
2.1.4 需进一步确定疫情的，应取样进行分离鉴定。
2.1.4.1 在树干的下部（胸高处）、中部和上部（主侧枝交界处），用斧子、柴刀、木锯或木钻（钻头直径1-1.5cm）在木质部采集样品。
2.1.4.2 取样时在取样部位剥净树皮和外围木质部，直接砍取100-200g木片；或剥净树皮和外围木质部，用手摇钻从木质部至髓心钻取100-200g木屑；或在取样部位分别截取圆盘。
样品标签须填写清楚（包括采集地点、寄主、时间、采集人），与样品一起放入塑料袋内，用橡皮筋扎紧，带回室内检验。
2.2 贮木场及加工场（点）、集贸市场调查
2.2.1 木材（含原木、锯材、切片）及其制品采取楞垛表面或分层方式设点抽样调查。
2.2.2 调查数量每批次按总量（m3、垛）的5%-10%抽取，疫情严重的应全部进行抽样调查。
2.3 疫情监测
2.3.1 定期普查
2.3.1.1 对辖区内由松科植物构成的，或以松树为主的生态林、用材林以及松木贮木场及加工场（点），或人为活动频繁的公路两旁松林，应进行定期普查。
2.3.1.2 每年3-5月和8-10月，应对上述地区的松林进行全面普查。
2.3.2 人工监测
2.3.2.1 在疫情发生区及毗邻地区，在当年秋季刚刚枯死的病树树干下部（胸高处）、中部和上部（主侧枝交界处），剥净树皮，选取靠近蛀道、蛹室部位，用手摇钻钻至树心，取松木木屑（100-200g）进行分离鉴定。
2.3.2.2 对已确定发现松材线虫的林分，应对周围松林进行全面调查，以确定疫情发生范围。
2.3.3 打孔流胶法监测
2.3.3.1 对于松材线虫发生区或其边缘的松树，若外观正常，针叶无明显变色可以用打孔流胶法做初步诊断，要确定是否感染了松材线虫还需进行取样分离诊断法进行确认。
2.3.3.2 使用锤子和打孔器或铳子（直径10-15mm）在松树主干上打一可见木质部的圆孔，位置和方向不限。
2.3.3.3 在春、夏、秋季，打孔后24h即可进行观察；在冬季，打孔后48-72h进行观察。
2.3.3.4 观察打孔后松树流脂情况，按下述标准确定流胶级别。
一级流胶：
树脂从孔口流下，渗出量很多；
二级流胶：
树脂从孔口流下，渗出量较多；
三级流胶：
树脂沉积在孔口下缘；
四级流胶：
树脂渗出到圆孔壁上，呈粒状；
五级流胶：
孔壁上无树脂流出。
2.3.3.5 对于三至五级流胶的松树，按2.1.4进行取样分离鉴定。
2.3.4 天牛引诱剂监测
2.3.4.1 于松褐天牛羽化期，在通风良好便于观测的山顶或林道旁设置诱捕器。
诱捕器距地面高度不得低于1.5m，诱捕器间距50-100m。
2.3.4.2 羽化高峰期1d检查1次，其余时间每隔3-5d检查1次。
将诱捕到的松褐天牛活体进行分离鉴定。
3 调运检疫
3.1 抽样比例
3.1.1 木材（含原木、锯材）及其制品按货物总量的0.5%-10%抽样，但样本数最低不得少于5个。
3.1.2 树木、枝条、伐桩按货物总量的1%-5%抽样，但样本数最低不得少于5个。
3.2 抽样方法
3.2.1 木材（含原木、锯材）及其制品、枝条、伐桩，采取表层或分层方式设点抽样检查。
3.2.2 抽取有蓝变特征或有天牛危害症状的树木、枝条、木材（含原木、锯材）及其制品。
3.3 现场检验
3.3.1 检查木材（含原木、锯材）及其制品的截面是否有松脂痕迹、密度明显减轻、木质部有蓝变现象及有天牛危害的蛀道、蛹室。
3.3.2 检查枝条、伐桩及其制品是否有天牛蛀道、蛹室、补充营养取食痕迹。
3.3.3 对有蓝变、天牛蛀道、蛹室的样本，每个样本取2份样品带回室内做进一步鉴定。
取样品时注意选取靠近蛀道、蛹室的部位，所取样品不得带有树皮。
4 检疫检验
4.1 对产地检疫、调运检疫所取的样品（含诱集到的天牛成虫）经制备后，采用贝尔曼漏斗法或浅盘法进行分离、镜检。
具体方法见附录1。
4.2 根据以下特征，鉴定是否属伞滑刃属：
虫体通常细长，唇区高，缢缩明显。
口针有小的基部膨大。
排泄孔位置通常在中食道球后方。
阴门有时突出，后阴子宫囊长。
雌虫尾端钝圆或尖。
交合刺大而狭，基部通常有明显的喙。
雄虫尾部向腹面弯曲，尾端尖，有一短的尾端交合伞。
在尾部通常有2对乳突，1对在肛门前，1对在肛门后。
无导刺带（引带）。
分属检索表见附录2。
4.3 对照松材线虫形态特征，鉴定是否为松材线虫Bursaphelenchus xylophilus（SteineretBuhrer）Nickle。
松材线虫与近似种拟松材线虫B.mucronatus在形态上的主要区别见附录3。
5 除害处理
5.1 发现携带松材线虫的木材（含原木、锯材）及其制品、枝条、伐桩等，可采取切片处理、热处理、熏蒸处理、销毁处理。
5.2 将病木切成厚度不超过1cm的碎片后用作纤维板、纸浆等工业原料。
或将病死木用旋切机切成厚度为3mm以下薄片，经80℃烘房热烘6h，制成刨花板、胶合板。
5.3 熏蒸处理方法见附录4。
5.4 将病树去皮锯板后置于热处理房，加热至木材中心温度达到65℃以上并保持2-3h（或利用微波处理），取出检查松材线虫死亡率，若死亡率达不到100%，继续进行处理直至松材线虫全部死亡为止。
5.5 如不具备上述条件，就地烧毁。
附录1 线虫分离方法
分离线虫可采用贝尔曼漏斗法和浅盘法。
贝尔曼漏斗法 将玻璃漏斗（直径为10-15cm）置漏斗架上，下面接一段（10cm左右）橡皮管，橡皮管上装一个止水夹。
将劈成“火柴杆”状大小的分离材料，取湿重10g，用两层纱布包好，放入漏斗中，然后放入清水，清水以浸没分离材料为度。
经过4-24h，由于趋水性和本身的重量，线虫离开植物组织，并在水中游动，最后沉降到漏斗底部的橡皮管中。
打开止水夹，取底部约5-15ml的水样，其中含有样本中大部分活动的线虫。
在解剖镜下检查，如果线虫的数量少，可以离心（1500r/min，2-3min）沉降后再检查。
浅盘法：
浅盘分离装置主要由两只不锈钢浅盘组成，其中口径略小的一只底部为粗网筛，放在另一只浅盘上面。
将两层纱布打湿铺于筛盘上，把样品劈碎（或钻取的木屑）置于筛盘纱布上，慢慢注入清水，使水浸没样品。
分离结束后，移去筛盘，把大盘内的分离液集中于小烧杯内。
小烧杯内的线虫分离液可通过自然沉降或离心机（1500r/min，2-3min）浓缩至适宜的量，以便镜检。
常规镜检：
分别将各标号盛有线虫分离液的培养皿置于解剖镜下观察，先确认有无线虫。
对有线虫的样品进行活体镜检，观察它的一般形态结构。
然后选择几条成熟、特征易观察的线虫，用针或吸管移至载玻片上的水滴中。
将此载玻片在酒精灯火焰上方往返几次（5-6s）或放置于已盛满高温热水、打开盖子的保温瓶口上，蒸30-60s至虫体死亡，加盖玻片后在显微镜下观察。
根据形态特征予以初步鉴别，以确定是否需作进一步的鉴定。
快速镜检：
（1）用显微镜直接观察线虫浓缩分离液。
分离液经一定时间后，当漏斗下端和乳胶管内出现透明度降低甚至混浊现象、表明线虫的游离量较多时，即可用培养皿接取混浊状分离液3-5滴，直接置于解剖镜下观察；如有线虫，就将盛有分离液滴的培养皿，放置于已盛满高温热水、打开盖子的保温瓶口上，进行30-60s的热杀处理，擦干培养皿底部凝结的小水珠，直接放置于显微镜下（先用低倍物镜，找到目标线虫，再转换到高倍物镜）观察形态特征予以鉴别。
（2）用显微镜直接观察线虫分离液。
用培养皿盛放贝尔曼漏斗放出的线虫悬液适量，直接移放在光学显微镜下观察，用低倍镜调整焦距，找到线虫，一手移动培养皿，不断变换所观察线虫的位置，一手不断调整焦距。
在10倍的接物镜下松材线虫的基本形态鉴定特征如头部、中食道球、阴门、交合刺、尾形等都可以清晰地观察到。
发现分离液中存有松材线虫时，挑取线虫并制成临时玻片标本进一步观察。
形态鉴定：
依据雌雄成虫的形态，主要是雌成虫的形态进行鉴定。
但分离到的线虫没有成虫或极少时，需进行培养，以获得大量雌雄成虫供鉴定。
常见的松材线虫培养方法是利用真菌培养线虫。
100ml烧瓶中加入约30g浸泡2-4d的玉米粒，棉塞封口；或按5:
1的比例将玉米粒与来自健康黑松或马尾松的木屑混合后装入100ml烧瓶中，棉塞封口。
经121℃，10.34×104Pa条件下灭菌40min，冷却后接种灰葡萄孢Botrytiscinerea或球壳孢Sphaeropsissapinea等线虫喜食真菌，待真菌长好后，接种松材线虫，并置于25℃下培养。
松材线虫表面消毒：
松材线虫分离纯化后，为了避免受到污染，在培养之前，需对线虫体表进行消毒。
消毒方法和消毒液根据工作需要进行选择，一般松材线虫的表面消毒液为0.002%放线菌酮和0.1%硫酸链霉素的抗菌素混合液。
（1）供试样品松材线虫个体较多时，在离心管内进行消毒。
具体做法是：
通过离心浓缩线虫至离心管底部，用无菌滴管将底部线虫液约2ml移入另一支无菌离心管中。
加入2ml双倍浓度的消毒液，轻轻振荡混匀，处理5min后，在1500r/min下离心5min，吸去上清液。
按上述步骤重复消毒1次，用无菌水换洗2次。
最后用无菌滴管将线虫吸入真菌培养基上。
（2）供试样品松材线虫个体较少时，在载玻片上进行消毒。
具体做法是：
将载玻片在70%酒精中浸泡1min，经过火焰灭菌，冷却后置于双目解剖镜镜台上。
将消毒液或无菌水分开滴在载玻片表面的3个点上，每点1滴，其中2个点为消毒液。
挑线虫至消毒液中，约1min后再依次转入另一消毒液滴和无菌水中。
最后用无菌细头滴管将经过消毒的线虫转至真菌培养基上。
样木保温保湿培养：
将发现幼虫的样品切成长约10cm，横截面长、宽各1cm的小木棍多根，使其一端浸在水中至1/3处，放入25℃保温保湿培养箱中培养线虫，2-3d后能够获得所需的成虫。
同样将样本适量喷水后，外套牛皮纸并扎紧，放入培养箱中3-5d后也能获得松材线虫成虫。
松材线虫临时玻片标本的制作
在载玻片上滴一滴水，用挑针或吸管将线虫移入水滴中。
或用吸管吸一滴线虫悬液在载玻片上。
然后在酒精灯上将线虫杀死。
用解剖镜检查线虫是否死亡，并用挑针将线虫轻轻按到水滴底部，以免盖盖玻片时线虫会随水流到盖玻片边缘，影响观察。
在盖盖玻片时要从侧面慢慢放下，尽量不产生气泡。
如果有条件的话，最好在制片前在载玻片上用指甲油画一小的圆圈，画得很薄。
一方面它可起支撑作用，避免盖玻片压迫线虫虫体，另外也可阻止线虫随水流到盖玻片边缘。
如果线虫已经杀死并固定，就可直接用固定液做浮载剂制片。
制片后立即观察，可不用封片。
如果观察时间较长，可用封片剂将盖玻片边缘封固。
蜡、指甲油、中性树胶、阿拉伯树胶等均可用来封片。
这种玻片制作简单，不需要特殊的仪器。
而且线虫未经透明，各种器官均非常清晰，易于辨认。
附录2
滑刃目线虫分属检索表
1.侧区通常至少有6条侧线，神经环环绕食道腺；雄虫交合刺较细，有明显的基柄，似垫刃类交合刺，引带显著、细长…………………………………………………………………2
侧区侧线不超过4条，神经环环绕肠前端；雄虫交合刺粗，玫瑰刺形或不规则形，通常无引带或引带短、不明显…………………………………………………………………………3
2.食道腺叶状从背面长覆盖肠；雌虫尾圆筒形或近圆筒形，端宽圆；雄虫交合伞显著，伸对尾端……………………………………………………………………真滑刃属Aphelenchus
食道腺长瓶形或梨形，不覆盖肠；雌虫尾圆锥形，端圆并且有1个尾尖突；雄虫无交合伞……………………………………………………………………拟滑刃属Paraphelenchus
3.雌虫有阴门盖；雄虫尾端包有交合伞………………………………………………………4
雌虫通常无阴门盖，若有则尾端有4个端缘呈穗状的梗节；雄虫无交合伞…………………………………………………………………………………………………5
4.虫体细（a值约为100）；雌虫尾呈长圆筒形、端圆……细杆滑刃属Rhadinaphelenchus
虫体粗（a值小于60）；雌虫尾短，呈圆筒形到圆锥形，端圆到锐尖，有时有1个尾尖突……………………………………………………………………伞滑刃属Bursaphelenchus
5.雌雄虫尾端有4个端缘呈穗状的梗节，雌虫有和无阴门盖……咽滑刃属Laimaphelenchus
雌雄虫尾端出上述特征，雌虫无阴门盖………………………………………………………6
6.头部高，显著缢缩成球状，前端呈盘状；口针长35μm，无基部球…猪头属Anomyctus
头部低，微缢缩到显著缢缩，但不呈球形，前端也不呈盘状；口针短于20μm……………7
7.角质层环粗（宽1.7μm），头部显著缢缩；口针粗，长约17μm，基部球大、圆；食道前体部的前部宽，后部呈细柱形，整个前体部呈倒瓶形………………………………大针属Megadorus
角质层环细，头部微缢缩；口针细，长度通常为10-12μm（一般不超过20μm），有小的基部球或基部膨大；食道前体部柱形……………………………………………………滑刃属Aphelenchoides
附录3
松材线虫与近似种拟松材线虫B.mucronatus在形态上的主要区别
拟松材线虫雌虫尾部和幼虫尾部都呈圆锥形，尾端指状，有明显的尾尖突。
雌成虫尾尖突长度为3.18-5.72μm，幼虫为2.54-3.81μm。
松材线虫雌虫亚圆锥状，尾端宽圆，无尾尖突或尾端指状，如有尾尖突，幼虫为0.63-1.25μm，成虫为0.63-1.88μm（图2-1-3）。
拟松材线虫交合伞平截形，交合伞末端边缘有2个小的突起，松材线虫交合伞卵圆形。
图2-1-1 松材线虫形态特征
A雌成虫 B雄成虫 C雄虫尾端 D交合伞 E交合刺
F雌虫前部（口针 中部食道球神经环 肠道）G雌虫阴门 H-J雌虫尾端变化
图2-1-2 拟松材线虫形态特征
1.雌成虫 2.雄成虫 3.雌虫前部 4、5雌虫尾部 F.雄虫尾端 7.交合伞
8.三龄幼虫尾节 9.四龄耐久型幼虫尾部 10.四龄耐久型幼虫前端
图2-1-3 松材线虫和拟松材线虫雌成虫的尾端形状
附录4
熏蒸处理
目前应用的熏蒸剂有溴甲烷（含量不低于98%）、硫酰氟（含量不低于95%）和磷化铝（含量不低于56%）。
熏蒸用具
熏蒸帐幕材料：
厚度0.15mm以上的聚乙烯帐幕或厚度0.19mm以上的聚氯乙烯帐幕或双面挂胶苫布。
施药管（溴甲烷和硫酰氟）：
采用不易腐蚀的高压氧气管。
盛药盘或盛药罐（磷化铝）。
磅秤：
称量范围0-150kg，感量0.1kg。
测温装置：
水银温度计（测温范围0-100℃，精度0.5℃）或数字测温计（测温范围-10-100℃，精度0.1℃）或远红外测温计（测温范围-20-300℃，精度0.1℃）。
浓度检测器材：
溴甲烷、硫酰氟气体浓度检测采用热导式熏蒸气体浓度检测仪，灵敏度1g/m3。
磷化氢气体浓度检测管，1-50ml/m3和100-2000ml/m3；溴甲烷气体浓度检测管，5-50ml/m3和10-100g/m3。
上述检测设备也可用于渗漏检测。
防漏检测仪器：
使用卤化物渗透检测器、测溴灯等各种类型的检测器进行检漏。
使用卤化物渗漏检测器时先用火柴从燃烧的开口处将其点燃，然后再向左慢慢转动调节阀，待反应板或锥形体发热变红时，把火焰调至能够维持这种颜色的最小范围。
将探测管末端开口处放在被检处，然后观察火焰的颜色是否发生变化，如火焰颜色变绿，则说明有溴甲烷外漏，外漏程度越严重，火焰的绿色越深，以致变为蓝绿色、蓝色。
溴甲烷帐幕熏蒸方法
熏蒸场地：
就地选择一块地势平坦、土壤紧密、阳光较充足、通风良好、交通方便、远离居民区的地块作为熏蒸场地。
熏蒸布置：
将须熏蒸处理的松木或其加工制品等在选择好的熏蒸场地上堆垛。
成一个长立方形。
一般垛高为1.5-2.0m。
挖沟：
在堆垛四周挖一圈宽20cm以上，深30cm以上的沟，挖出的土堆放在沟外侧，用作覆盖帐幕后回填。
覆盖帐幕：
将准备好的帐幕覆盖在堆垛上，帐幕四周边埋在沟内，用沟外侧的土回填，适当加水，踩紧踏实。
投药量和熏蒸时间：
投药量和熏蒸时间的选择参照下表，其中温度为熏蒸当日最高气温；投药量指帐幕内容积每立方米的投药量。
当日最高气温低于4℃时则停止熏蒸。
在熏蒸密闭空间内的温度低于15℃或投药量大于3kg时，溴甲烷熏蒸应采用药剂汽化装置投药，汽化器出口气体温度不低于20℃。
投药量和熏蒸时间
温度（℃）
投药量（g/m3）
熏蒸时间（h）
4－10
104－125
48
69－83
72
10－20
63－83
48
42－56
72
20以上
42－63
48
28－42
72
投药：
投药前先检查帐幕有否破损，确认封闭严密后开始投药。
操作人员站在上风处，缓缓打开置于磅秤上的钢瓶阀门，使溴甲烷通过投药管进入堆垛，直至磅秤上显示已放完所需的总投药量时即关闭阀门，取出投药管，封好进药口，保持密闭至所选择的熏蒸时间。
散毒：
熏蒸完毕，先将帐幕下风方向一边打开，0.5h后再揭幕充分散毒。
效果检查：
效果检查需在揭幕1h后进行。
在堆垛上部抽取3段长约50cm的样段，将3个样段分别劈开检查松褐天牛幼虫死活。
松褐天牛的死活可参照下表鉴定。
松褐天牛存活与死亡特征
检查项目
活
死
体表色泽
有光泽
无光泽
虫体软硬程度
有弹性
无弹性
对外界刺激反应
动
不 动
头部位置
向腹面弯曲
前 伸
虫体截面形状
圆 形
扁圆形
另外，在使用硫酰氟熏蒸时，常用量为30g/m3，温度17-30℃，密闭48h，松褐天牛成虫和幼虫死亡率100%。
溴甲烷和硫酰氟在熏蒸时加入适量CO2，有显著增效作用，加入量为熏蒸剂的10%-40%。
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