基因克隆的四大要素.docx

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基因克隆的四大要素

基因克隆的四大要素（Four Elements for Gene Cloning）

将外源基因通过体外重组后导入受体细胞，使该基因能在受体细胞内复制、转录、翻译和表达，整个操作称为基因重组技术。

要实施该技术必须具备四大要素：

工具酶、载体、基因和受体（宿主）细胞。

一、工具酶：

基因工程的基本技术是人工进行基因的剪切、拼接、组合。

基因是一段具有一定功能的DNA分子，要把不同基因的DNA线形分子片段准确地切出来，需要各种限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease）；要把不同片段连接起来，需要DNA连接酶（DNAligase）；要合成基因或其中的一个片段，需要DNA聚合酶（DNApolymerase）等。

因此，酶是DNA重组技术中必不可少的工具，基因工程中所用的酶统称为工具酶。

工具酶就其用途而言可分为三大类：

限制性内切酶、连接酶和修饰酶，其中限制性内切酶为一大类酶（达上千种）。

基因重组正是利用了这些工具酶对DNA分子进行一系列的酶催化反应，才得以在体外实现DNA分子的切割和连接。

因此，工具酶的发现为基因操作提供了十分重要的技术基础。

首先重点介绍限制性内切酶（restrictionendonucleases＝restrictionenzyme），其他酶在相关内容中再一一介绍。

从分子生物学发展历史看，核酸限制性内切酶的发现和应用对该学科发展所起的作用是难以估量的。

首先使外源基因在大肠杆菌中克隆的实验是在1973年完成的，StanleyCohen，HerbertBoyer（见补充资料2.1）正是利用了限制性内切酶这一分子手术刀才得以实现。

核酸限制性内切酶是原核生物中的一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶。

原核生物的限制和修饰系统犹如高等动物的免疫系统，依靠一对识别相同序列的核酸限制性内切酶和甲基化酶活性来对抗外来DNA的入侵：

当自身的基因组在复制完成下轮DNA复制尚未开始前就被甲基化酶修饰（使某特定序列甲基化）,避免了被对应的限制性内切酶的识别和水解，而入侵的噬菌体由于未来得及修饰而被破坏，从而保护细菌不受噬菌体的感染。

各种细菌都能合成一种或几种顺序专一的核酸内切酶。

这些酶的功能就是通过特异性序列的识别后进行DNA的切割，来限制外源性DNA侵入自身的细胞内，所以称这种核酸内切酶为限制酶。

根据酶的识别切割序列的特性、催化条件以及是否具有修饰酶的活性而分成三类：

I、II、III类：

第I类限制性内切酶是双功能酶，具有修饰活性（甲基化）和内切酶活性，作用时需要消耗ATP，能识别专一的核苷酸顺序，并在距离识别点大约1000个核苷酸对处切割DNA分子中的双链，但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的。

（生物秀实验频道）

第II类限制性内切酶只具有核酸内切酶活性，能识别专一的具有回文结构的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链，作用时不需要水解ATP提供能量。

第III类限制性内切酶也同时具有修饰活性和内切酶活性，具有专一的识别顺序，但不是对称的回文顺序。

它在识别顺序旁边24-26个核苷酸对的固定位置上切割双链，但这几个核苷酸对则是任意的。

其中II类酶在基因重组中最有应用价值。

因此以下内容均以II类限制性内切酶为主。

1．限制性内切酶的命名和书写

限制性内切酶主要是从原核生物中提取的。

现在通用的命名原则是：

第一个字母是细菌属名的第一个字母，第二、三个字母是细菌种名的前二个字母，这些字母都用斜体字书写；如果同一生物种内又分为不同的血清型和菌株，其菌株名称的第一个字母，用正体字书写，并放在限制酶名称的第三个字母后面。

比如限制酶HincⅡ和HindⅢ則是分別來自流感嗜血菌（Haemophilusinfluenzae）的c和d血清型菌株。

如果同一菌株中有几种不同的内切酶时，则分别用罗马数字Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ……来代表，如表2.1所示。

表2.1几种限制性内切酶的来源

2．限制性内切酶的特点：

①识别特定的核苷酸序列：

长度一般为4~6bp并具有回文结构的顺序（palindromes，一段自我互补的DNA顺序，即上下链从5’→3’方向所读的顺序完全一样）。

例如：

②具有特定的酶切位点：

即在识别序列的特定位点对双链DNA进行切割，由此产生特定的酶切末端。

通常双链DNA被酶切后可出现三种形式的末端：

5’突出的粘末端；3’突出的粘末端；平末端。

③由两种酶分子组成的二元系统：

一种是限制性内切酶，另一种是甲基化酶，二者识别位点相同，但后者不是切割，而是对识别序列中的一个碱基进行甲基化修饰，该甲基基团伸入到双螺旋的大沟中去，阻碍了限制性内切酶的作用，使之不受对应的限制性内切酶的切割。

对于原核生物来说，甲基化酶对其自身DNA序列进行甲基化，使其免受限制性酶的作用，因此甲基化酶是细菌体内的一种保护机制。

换言之，正是由于限制性内切酶与甲基化酶，组成了原核生物的一个完整的免疫系统。

3．应用限制性内切酶注意事项：

酶单位（U）的定义：

在50μl反应液中,37℃保温1h,使1μg的特定DNA完全分解所需的酶量为1个活性单位。

由于酶的活性与其所处的反应条件有很大的关系，因此在使用限制性内切酶需注意：

①反应条件：

每种酶所需的最适条件各不相同，包括：

温度、不同的离子浓度、pH、还原剂等，因此为了保证酶处于最佳反应条件，每种酶必须备有配套的缓冲系统（buffer）。

②DNA的纯度是影响反应效率的主要因素，杂质包括：

蛋白质、酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、以及高浓度的盐离子。

降低污染的办法：

适当增加酶的用量、扩大反应体积（通过稀释降低污染物的浓度），或延长反应时间。

（生物秀实验频道）

③注意甘油的浓度（酶储液），所提供的缓冲液均为10倍浓缩液，目的是保证稀释的酶保存液中甘油的浓度不会超过5%。

但较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响，因此酶切反应体系不宜在体积过小（如小于20μl）范围中进行。

④注意反应液的充分混合，但不可振荡。

反应液充分混合是为了保证反应完全，推荐用取液器反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心即可。

上述只是一些基本原则，实际操作中需要综合考虑。

一些大的试剂公司均会提供各种限制性内切酶的详细资料。

特别强调的是，并不是酶量越多越好，反应时间越长越好，因为限制性内切酶都有Star活性，即发生非特异性的反应（所谓Staractivity，是在一些特定的条件下，酶对底物DNA的特异性可能降低，以致在识别序列以外的位点进行切割。

在甘油含量高、酶量大，有机溶剂以及盐浓度低时容易发生）；同时酶在保温过程中，活性也会发生变化。

为了能够正确的利用限制性内切酶，应该注意阅读产品说明书以及相关的介绍。

例如：

各种限制性内切酶在保温过程中的活性变化表；双酶切反应时的通用缓冲液使用表；不同缓冲液中各种限制性内切酶的活性变化表等等。

另外需要注意的是，不同公司产品的酶和缓冲液不要混用。

（见附录四－1，常用限制性内切酶表）

在多数情况下，同一种限制性内切酶所产生的DNA双链末端结构总是相同的，因而用同一种限制性内切酶酶切同一个或两个不同来源的DNA分子所产生的末端都可以相互配对，在DNA连接酶的作用下，3＇和5＇末端重新形成磷酸二酯键，而成为一个重组的DNA分子。

由于这些限制性内切酶的识别序列都是对称的，因而两个DNA片段可以从两个不同的方向连接起来。

这种外源DNA片段的插入没有一定的方向，这对插入片段的方向并不显得重要时适用，如在构建基因文库时。

然而在研究基因表达时，考虑外源DNA的插入方向则是十分重要的，需要采取不同的方式进行控制，以达到定向连接的目的。

（生物秀实验频道）

虽然不同种的限制性内切酶产生的DNA双链末端结构在大多数情况下是不相同的，但有些不同种限制性内切酶产生的末端却是相同的，即具有相同类型的突出末端（都是5＇端或3＇端突出），突出的核苷酸数目相等且序列也相同，因而可以互相连接起来。

这种由不同种的限制酶产生的能相互连接的末端常称之为相容性末端，这些酶则称之为同尾酶（isocaudamer）。

例如，限制酶BamHI和BglⅡ都能识别各自的6核苷酸序列，且切点都在同一位置，依次为GGATCC和AGATCT，因此产生的DNA片段都产生一个相同的单键5＇端突出（突出序列是GATC）。

当这些酶作用DNA分子后，它们都能相互连接，但是新形成的DNA分子将同时失去这两种酶的识别序列。

如：

通常，不同的限制酶具有不同的识别序列，但有些不同来源的酶能识别相同的序列，这些酶被称为同裂酶（isoschizomer），不过其中有些酶具有相同的切点，而有些酶的切点却并不相同，如AccⅢ与BspEⅠ、BseAⅠ、BsiMⅠ、Bsp131、Kpn21、MroⅠ识别序列都是TCCGGA,t它们的切点都在T和C之间，即T/CCGGA；但BbeⅠ与KasⅠ、NarⅠ、SfoⅠ识别序列都是GGCGCC，但它们的切点分别为GGCGC/C、G/GCGCC、GG/CGCC、GGC/GCC。

现在已从各种微生物中发现三千余种限制酶，它们识别序列的长度最短的是4个核苷酸，最长的为8个核苷酸。

基因克隆过程中使用频率最高的是识别6个核苷酸的限制酶。

这是因为由4个核苷酸组成的识别序列在DNA分子中出现的频率很高，如果按完全随机分布的原则，每44＝256个核苷酸可出现一个相同的4核苷酸识别序列。

如果是由6个核苷酸序列组成的限制酶识别位点，那么就应该有46＝4096bp才可能出现一次。

识别8个核苷酸的限制酶识别位点就应该有48＝65,536bp才重复一次。

因此，在一个DNA分子中，识别4个核苷酸的限制酶位点太多，识别8核苷酸的限制酶位点又太少。

换句话说，识别4核苷酸的限制酶将DNA切得太短，识别8个核苷酸的限制酶将DNA切得太长，而识别6个核苷酸的限制酶则比较适中，切下的DNA片段平均长4.1kb左右。

除此之外，片段过长或过短，从技术角度讲，操作起来也不太方便。

实际上，任何一种生物基因组的DNA分子中的核苷酸分布并不是完全随机的。

也就是不同物种的基因组DNA中，所含的限制性内切酶位点的种类和数量各不相同。

也正由于此，可以通过绘制限制性内切酶图谱来描述某一个物种的基因组特征，即物理图谱。

比如，在SV40（Simianvacuolatingvirus，猿猴空泡病毒）的DNA分子中（基因组长为5,243bp）仅有一个HpaII位点（识别序列为C↓CGG），而ThaI位点（识别序列为CG↓CG）则根本没有。

但是，在大小相似的原核生物DNA分子中，如最常见的大肠杆菌质粒载体pBR322（总长4,363bp）则有26个HpaII位点和23个ThaI位点。

在一个含有75%AT和25%GC的DNA分子中，长达262,144bp中只有一个SmaI位点（识别序CCC↓GGG）。

一种裸藻（Euglenagracilis）的叶绿体DNA分子（130,000bp）中因没有SmaI位点，而无法用SmaI将其切为两段。

因此使用DNA限制性内切酶的过程中，需要根据不同的研究目的来选择。

比如在建立基因组文库时，DNA片段要求尽可能长一些以便使这些片段含有完整的基因，这就需要选择一些限制酶，它们的识别序列在该生物DNA分子中应当是一些不常见的核苷酸序列；而在绘制限制酶图谱时，选择的限制酶则应该识别较为常见的识别序列。

表2.2列出一些限制酶消化不同物种的基因组DNA获得的平均DNA片段的长度。

表2.2一些限制酶消化不同物种的基因组DNA*获得的平均DNA片段的长度（bp）

*基因组DNA的总长度：

E.coli，4.6Mb；S.cerevisiae,12.1Mb；C.elegans，100Mb；D.melanogaster,3.8Mb；H.sapiens，22Mb

二、载体（Vectors）：

一种能够结合外源DNA片段形成重组DNA，并能进行自我复制的DNA分子称为Vectors。

最主要的载体是质粒、噬菌体和病毒，分别应用于原核细胞或真核细胞。

从功能来分，有克隆载体（构建基因组文库或cDNA文库）、测序载体、表达载体以及能在两个不同物种中存在的穿梭质粒。

随着生物技术的发展和科学研究的深入，不断出现具有不同功能的新载体，如可以容纳几百万碱基的酵母人工染色体。

载体的具体种类有：

PAC（P1衍生人工染色体）

MAC（哺乳动物人工染色体）

这些载体均有各自的特点，表2.3中列出它们的主要特性。

表2.3各种克隆载体特性的比较

1．质粒（plasmids）

质粒是细菌内的共生型遗传因子。

作为染色体外小型双链环状DNA复制子，它能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主（受体菌）某些代谢活动和抗药表型，是比病毒更简单的原始生命。

质粒由Lederburg发现并于1952年正式命名。

由于质粒不仅可以携带外源基因进入细菌中进行扩增和表达，而且在添加真核复制信号和启动子后，构建出能在原核或真核细胞中均可复制的穿梭质粒，使外源基因在真核细胞中得以表达，因而成为基因的运载工具（即载体），在基因工程中具有极广泛的应用价值。

质粒并不是宿主染色体的永久组成部分，而是一种自主复制的遗传单元。

不同质粒DNA的复制，其机理不尽相同，根据质粒拷贝数的不同，分为严紧型和松弛型，前者与宿主的繁殖结合，致使每个细胞仅有一个或几个拷贝质粒，而后者却是由质粒自己编码的基因合成功能蛋白所调节，因此在宿主染色体复制停止的情况下，质粒可以继续扩增，因而具有10－200个拷贝数。

对于克隆载体，松弛型质粒更为适用。

天然质粒不足以用为载体，必须根据基因克隆的要求进行体外修饰改造。

因此可以用作载体的质粒需具备一定的基本元件后才有相应的功能。

（1）质粒（载体）具备的基本元件：

①复制起始点（ori）：

使质粒可以自我复制和扩增。

②抗生素抗性基因：

一般有两个，以便为受体菌提供易于检测的表型性状的选择记号，而且在外源基因插入后形成的重组质粒中，至少仍保留一个强选择记号。

常用的抗性有：

抗氨苄青霉素基因Ampr、抗四环素基因Tetr、抗卡那霉素基因.Kanr、抗氯霉素基因Cmlr、抗链霉素基因Strr。

③若干限制酶单一识别位点（多克隆位点，polylinker）：

满足各种基因克隆的需要，而且外源基因插入后不影响质粒的复制功能。

④较小分子量和较高拷贝数：

便于进行分子操作和质粒扩增。

典型质粒pBR322的物理图谱（图2.1）和pUC18/19的物理图谱及多克隆位点（图2.2）

图2.1pBR322质粒物理图谱

图2.2pUC18/19质粒多克隆位点顺序

2）质粒的功能：

①运载外源DNA片段：

质粒通常用于运载小于15kb的外源基因片段到宿主中。

为了便于操作，人们又构建了穿梭质粒（Shuttleplasmids）。

所谓穿梭质粒是指一类人工构建的具有两种不同复制起点和选择标记，因而可以在两种不同类群宿主中存活和复制的质粒载体[1]。

此概念不仅用于不同的微生物菌群之间，也可以推广到真核生物表达载体的构建，如用于枯草的pBE2、酵母的pPIC9K、哺乳动物表达载体pMT2和用于植物细胞的Ti质粒。

这些穿梭质粒不仅可以在大肠杆菌中复制扩增，也可以在相应的枯草、酵母、动物或植物细胞中扩增和表达。

由于大肠杆菌的培养、基因重组、扩增、测序等工作易于进行，技术也相当成熟，因此利用穿梭质粒把要表达的基因组装好后，再转入相应的细胞中进行表达，这无疑给基因工程操作，特别是以真核细胞为表达体系的工作提供了极大的方便。

②筛选重组子：

通常以质粒的抗生素抗性基因作为筛选的遗传标记。

当外源基因插入质粒的某一个抗性基因中，就使该抗性基因不能正常表达，致使含有该质粒的细菌丢失抗性。

利用抗性的变化，很容易筛选出含有外源基因的重组子（见图2.3）。

图2.3pBR322质粒克隆DNA片段的筛选（tetr失活）

质粒除有抗性基因外，往往还带有其他明显的筛选标记，最常用的是蓝白斑筛选（β-半乳糖苷酶系统）。

其基本原理可见图2.4，此类载体携带lacZ’基因，它编码β-半乳糖苷酶的N-末端（α-肽），并且处于可被安慰诱导物IPTG（异丙基硫代半乳糖苷，与乳糖结构类似但不能被β-半乳糖苷酶降解）诱导的启动子调控之下。

质粒转化的宿主菌为LacZ△M15基因型（含有编码N-末端缺陷型的β-半乳糖苷酶多肽的基因）。

未重组的质粒转化宿主菌后，在IPTG的诱导下，质粒与基因组分别表达缺陷但可以相互补偿的两个肽（即α-互补），形成了有功能的β-半乳糖苷酶，该酶能把培养基中无色的X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）底物分解成半乳糖和深蓝色的5-溴-4-氯-靛蓝。

然而当外源DNA插入质粒位于α-肽编码序列中的多克隆位点时，由于破坏了α-肽的阅读框架，因而不能表达出与宿主菌基因组表达的缺陷型β-半乳糖苷酶多肽发生α-互补。

由于没有β-半乳糖苷酶的酶解作用，致使重组菌形成白色菌落。

由此，可以借助蓝白斑很容易筛选出重组子。

不过实际操作中发现当插入小片段时，重组子也有形成浅蓝斑的情况。

据最新报道，大概有30%的假阴性，即蓝色菌斑也有可能含外源基因，同时还会出现一定程度的假阳性。

尽管蓝白斑筛选应用了二十余年，但假阳性和假阴性却经常出现，促使人们不断对分子克隆方法提出改进，并思考着建立新的载体和克隆技术。

但迄今为止，几乎没有一个克隆系统可以保证不会出现假阳性克隆。

SlilatySN和LebelS.研究证明[2]，蓝白斑筛选的载体，通常将插入位点放在LacZ’基因的起始密码子ATG到第7个氨基酸密码子之间。

但如果将插入位置改变到LacZ’基因的第11-36个氨基酸密码子之间，那么就可以完全消除假阳性和假阴性。

GenomicsOne公司正是利用了他们的研究结果开发出TrueBlue技术，同样是蓝白斑筛选，但准确率可达100%。

③DNA测序：

为了便于对克隆到质粒中的外源DNA片段进行鉴定，必须进行DNA序列的测定。

通常克隆质粒（包括某些表达质粒）中位于多克隆位点两侧含有通用引物，因此无论插入何种DNA片段，均可利用通用引物进行测序，而不必另外设计特异测序引物，如pGEM-T载体（图2.5）。

图2.5pGEM-T载体多克隆位点及相关序列位点