发酵工程实验讲义.docx
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发酵工程实验讲义
发酵工程实验
（适合发酵工程原理与技术）
张建国用
前沿
发酵工程（FermentationEngineering
）属于生物技术的范畴，生物技术又称生物工艺学现代生物技术作为一门新兴的高科技术产业，它的生命力在于他对社会经济和发展的各个方面都带来了极大冲击和影响。
发酵工程是指在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的技术。
发酵工程由于涉及到生物催化剂，因而与化学反应有关。
由于生物技术的最终目标是建立工业生产过程为社会服务，因而该生产过程可称为生物反应过程（亦称为生化反应过程）。
在发酵技术中一般包括微生物细胞或动植物细胞的悬浮培养，或利用固定化酶，固定化细胞所做的反应器加工底物（即有生化催化剂参加），以及培养加工后产物大规模的分离提取等工艺。
主要是在生物反应过程中提供各种所需的最适环境条件。
如酸碱度、湿度、底物浓度、通气量以及保证无菌状态等研究内容。
生物技术产品具有多样性，各个学校的教学资源和课时不同，所进行的实验种类不同。
本实验内容根据本校的具体条件进行安排。
安排的思路是以最简洁有效的方式针对发酵过程的重要要素进行实验，便于学生对教学内容有个较好的认识，理顺学习思路，为进行社会科学实践打下良好基础。
第一篇野生型菌株的筛选
经典的发酵产物来自微生物，土壤是微生物的大本营。
生产菌株的选育源头都来自于自然界。
如何从自然界中筛选目的微生物，可以根据目的微生物和产物的特性作为筛选条件，进行筛选提高筛选效率，从而有效的解决菌株从无到有的问题。
实验一产淀粉酶菌株的筛选（4学时）
一．实验目的
筛选一株能够合成分解淀粉的微生物。
二．原理
自然界微生物种类繁多，有些微生物能够以淀粉作为碳源进行生长繁殖是因为它们能够合成分泌淀粉酶，因此我们能够从自然界中定向分离出合成淀粉酶的微生物。
当能合成淀粉酶的微生物在固体培养基中生长时，会将淀粉酶分泌到菌体周围，将菌落周围的淀粉水解成为小分量的糊精、聚糖和单糖。
这些水解物不能包裹单质碘从而在菌体周围形成透明圈。
三.材料与仪器
1.材料
蛋白胨，牛肉膏，NaCl，琼脂条，可溶性淀粉，碘液。
2.仪器
牛皮纸、培养皿、试管、涂布棒、恒温培养箱、玻璃珠
四．方法与步骤
1.筛选培养基的配置
可溶性淀粉2g，NaCl5g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，琼脂20g，水1000ml
2.碘液的配置
称取KI2.0g，用50mL去纯水溶解KI，迅速称量I20.5g并加入KI溶液中，用纯水定容到100ml，搅拌溶解后保存在棕色瓶中，橡皮塞封口。
3.土样的采集
⑴每大组取三种不同环境的土样并记录当时取样环境情况（每一小组以其中一个地方进行分离）。
⑵以小组为单位进行稀释分离。
取土样1克，加入9mL无菌水，逐步稀释至105、106、107。
（每个梯度涂2个瓶皿）。
⑶30℃恒温培养48小时
⑷产淀粉酶菌株的鉴定。
挑选单菌落影印到无菌瓶皿上，同时用签字笔对各单菌落在底皿标号。
标记接种过的培养皿30℃培养24h，取其中一皿喷洒稀碘液记录有水解圈的单菌落。
与此对应找出合成淀粉酶的菌株。
比透明圈＝透明圈直径（mm）/菌落直径（mm）
[5]每小组调去活性优良的菌株接入斜面试管保存，待下一次用。
五．记录与结果
1.环境情况
地点一：
地点二：
地点三：
2.绘制出透明圈
数据共享
地点一
地点二
地点三
产酶菌落数
比透明圈
六．结果分析
从不同地点获得的结果进行分析为什么会出现这样的差异你可以初步得出什么样的结论。
七作业
1.为什么要用淀粉作为碳源？
2.在观察结果的过程中为什么要及时观察,否则会有什么的后果.
3.为什么同样一个同样要稀释几个不同梯度进行涂平板.
实验二排斥美兰放线菌的筛选
一．实验目的
筛选能够和美兰发生排斥反应的放线菌。
二．原理
放线菌目前是合成一些抗生物质的主要微生物种群。
美兰在酸性条件下带正电荷，个别放线菌在生长过程中可以释放出带正电荷的产物。
两者在固体培养基中能够形成特殊的排斥圈。
目前研究表明这种产物有可能是一种生物碱性物质，对其他菌体有良好的抑制和杀灭作用，可以作为药物的靶向载体和食品添加剂。
放线菌一般生长条件在中性，而美兰在酸性条件下带正电荷，所以培养条件选择在中性偏酸性。
在筛选过程中会有大量的杂菌生长从而影响筛选效果的观察和筛选分离，为此要在培养基中加入一些对杂菌有抑制作用但对放线菌抑制作用较小的化学物质高锰酸钾。
为了避免杂菌的影响要及时的观察和分离。
三.材料与仪器
1.材料
葡萄糖,酵母粉，NH4SO4，K2HPO4,KH2PO4,MgSO4,ZnSO4,FeSO4,
2.仪器
牛皮纸、培养皿、试管、涂布棒、恒温培养箱、玻璃珠
四．方法与步骤
1.筛选培养基的配置
1）培养基成分
葡萄糖50g·L-1,酵母粉5g·L-1，1NH4SO410g·L-1，0.8gK2HPO40.8g·L-1,KH2PO41.36g·L-1,MgSO40.05g·L-1,ZnSO40.05g·L-1,FeSO40.03g·L-1,调节pH为6.8，1×105Pa灭菌30min，酵母膏单独灭菌。
2）.高锰酸钾溶液的配置
称取7.5gK2Cr2O7，用100mL去纯水溶解灭菌待用。
3）.美兰溶液配制
称取0.2g美兰，用100mL去纯水溶解灭菌待用。
在培养基冷却至70~80℃左右时，分别加入高锰酸钾溶液和美兰溶液，使培养基中的含量分别为75mg/L和0.002g/L。
3.土样的采集和样品的处理
⑴每大组取三种不同环境的土样并记录当时取样环境情况（每一小组以其中一个地方进行分离）。
⑵以小组为单位进行稀释分离。
取土样1克，加入9mL无菌水，逐步稀释至10-1、10-2、10-3。
（每个梯度涂2个瓶皿）。
4.培养
（1）30℃恒温培养120小时
（2）三天后开始间隔24小时观察，生长和形成透明圈情况
五．记录与结果
1.环境情况
地点一：
地点二：
地点三：
2.绘制出透明圈
数据共享
地点一
地点二
地点三
放线菌生长情况
形成透明圈情况
六．结果分析
从不同地点获得的结果进行分析为什么会出现这样的差异你可以初步得出什么样的结论。
七作业
1.为什么要用加入重铬酸钾和美兰？
2.在观察结果的过程中为什么要及时观察,否则会有什么的后果.
3.为什么同样一个同样要稀释几个不同梯度进行涂平板.
附
柠檬酸产生菌的分离
◆柠檬酸又名枸橼酸，它是存在于柠檬等水果中的一种有机酸。
学名为3-羟基3-羧基戊二酸。
◆柠檬酸具有令人愉快的酸味，它入口爽快，无后酸味，安全无毒，是发酵法生产的最重要有机酸。
它在水中的溶解度极高，能被生物体直接吸收代谢。
它的许多特殊优点使它在各个工业部门得到了广泛的应用。
柠檬酸的盐类和衍生物也各具优点，用途广泛，在国民经济中占有重要地位。
◆实验目的：
1、了解黑曲霉菌在工业生产中的不同作用；
2、复习掌握从土壤中分离工业用微生物的原理及方法；
3、掌握利用变色圈法筛选产酸菌的方法。
实验原理：
◆1、新菌株的分离大致可分为采样、增殖（富集）培养，分离鉴定、性能测定等步骤。
◆2、柠檬酸可由曲霉菌发酵糖类而生成，其中尤以黑曲霉产酸能力最强。
目前工业生产中多以黑曲霉为柠檬酸产生菌。
◆3、黑曲霉耐酸性较强，在pH值1.6时仍能良好生长。
利用其产酸高、耐酸强的生理特征，使用pH1.6的酸性营养滤纸分离该菌，简单易行，再加上用变色圈法进行初筛，使产柠檬酸的菌株更易被选出。
◆4、黑曲霉产生的柠檬酸,可利用Deniges氏液鉴别；其产酸量可用0.1N氢氧化钠滴定。
柠檬酸产生菌的分离实验步骤:
◆1、土壤采样
◆2、准备稀释分离用的器材
◆3、将平皿、吸管包好后干热灭菌
◆4、配制察氏培养基
◆5、做成固体斜面
◆6、配成蓝色的察氏-多民培养基
◆7、湿热灭菌
◆8、摆斜面、倒平板
◆9、稀释土样
◆10、涂布均匀
◆11、倒置培养。
变色圈反应
柠檬酸产生菌的初筛实验步骤
◆1、配制初筛发酵培养基并灭菌
◆2、观察菌落
◆3、挑选菌落变色圈，测量变色圈与菌落直径之比，取比值较大者
◆4、将选好的菌株编号，接入斜面。
同时采用倒置接种法在培养皿上点植接种
◆5、培养斜面和平皿
◆6、摇瓶发酵
◆7、柠檬酸鉴定
◆8、产酸量的测定。
思考题
◆1.简述从土壤中筛选产目的产物微生物菌种的过程。
◆2.土壤采样时应注意的哪些问题？
◆3.黑曲霉柠檬酸产生菌菌株的富集应考虑利用哪些特点来进行富集？
第二篇菌种选育
微生物菌种的选育目的防止菌种退化解决生产实际问题，提高生产能力，提高产品质量，开发新产品。
目前菌种选育的方法主要有自然选育、诱变育种、杂交育种、分子育种等手段。
但是诱变育种还是育种的主流，诱变育种根据诱变剂的种类可分为化学诱变和物理诱变。
本实验以紫外线作为物理剂进行诱变。
诱变过程一般包括诱变出发菌株的选择、诱变剂量的选择和诱变及其筛选。
实验一产淀粉酶菌株的诱变育种（8学时）
（1）产淀粉酶菌株的诱变剂量选择（4学时）
一.目的
通过对出发菌株进行不同剂量条件下的照射，找出最佳诱变剂量。
二.原理
DNA是遗传物质的基础，主要组成分为脱氧核酸。
DNA的在260nm下有最大能量吸收峰，15W紫外灯在30cm处的紫外线波长多数为260nm左右。
当菌体处在这样的波长条件下就会吸收大量能量造成DNA分子发生断裂、分子结构形式发生改变。
有些微生物由于DNA分子大面积损伤而死亡有些因为菌体进行了修复而存活。
在修复过程中有些虽然存活了但DNA碱基发生了改变从而形成了突变菌株。
突变菌中有些发生了产量正突变有些发生负突变。
通过选择的手段选择出实验要求的突变菌株。
从而使野生型或出发菌株的性状得到改良。
三.材料与仪器
1.材料（出发菌株选取一个；例如枯草芽孢杆菌）
蛋白胨，牛肉膏，NaCl，琼脂条，可溶性淀粉，碘液。
2.仪器
紫外灯、磁力搅拌器、报纸、红灯泡、灯口、电线、插座、瓶皿、无菌三角瓶（内含玻璃珠）、含有磁针的无菌瓶皿
四．方法与步骤
1.培养基
可溶性淀粉2g，NaCl5g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，琼脂20g，水1000ml
2.无菌生理盐水
3.出发菌株的制备（无菌条件下操作）
将出发菌株从试管中用25mL生理盐水多次洗出洗出，倒入含有玻璃珠的无菌三角瓶中，进行反复振荡20min。
4.诱变条件选择（操作过程在红光或黑暗条件下进行）
吸出5mL至含有磁针的无菌瓶皿中，置于磁力搅拌器上，缓慢加速磁力搅拌器。
然后打开瓶皿盖，再打开紫外灯迅速记时。
时间到立刻关闭紫外灯。
（5S、10S、15S、20S、25S、30S、35S、40S）。
5.涂瓶皿
⑴对照：
将未进行辐射的菌悬液稀释适当倍数105，106，107，涂瓶皿。
⑵处理组：
将进行辐射的菌悬液稀释适当倍数103，104，105，涂瓶皿。
6.30℃恒温培养48小时（培养物用黑布袋或报纸包裹严实进行培养）。
7.计数并计算致死率
五结果
致死率＝（对照－粗活）/对照
对照
稀释倍数
菌落数
辐照
稀释倍数
菌落数
致死率
=lg（辐照的菌落数）/lg（照射的菌落数）
2.绘制时间和致死率之间的关系，确定该诱变的最适诱变条件。
诱变剂量选择根据出发菌株的诱变史。
一般来讲出发菌株为野生型第一进行诱变时都采用大剂量（致死率较高的计量），对于诱变史较为复杂的一般选用小剂量进行。
六讨论
七作业
1.外诱变的机理是什么？
2.为什么要在黑暗或在红色光下进行诱变和培养工作？
（2）紫外线的诱变（4学时）
一.目的
在最佳诱变剂量下选育发生淀粉酶产量发生正突变的菌株。
二.原理
发生正突变的概率约为10-8左右，需要在大量的照射菌落中寻找发生正突变的菌株。
如果从大量的待选辐照菌中进行定量或半定量筛选分析，工作量巨大，不切合实际。
一般根据经验依据微生物的形态和高产菌的关系或根据比透明圈与对照的比透明大小进行筛选。
形成透明圈的大小不仅与遗传有关还与培养条件有关。
为了消除培养环境的误差，在此规定当比透明大于对照比透明25%为正突变，小于25%为负突变，在此±25%之间认为是没有发生突变。
三.材料与仪器
1.材料（出发菌株选取一个；例如枯草芽孢杆菌）
蛋白胨，牛肉膏，NaCl，琼脂条，可溶性淀粉，碘液。
2.仪器
紫外灯、磁力搅拌器、报纸、红灯泡、灯口、电线、插座、瓶皿、无菌三角瓶（内含玻璃珠）、含有磁针的无菌瓶皿
四．方法与步骤
1.培养基
可溶性淀粉2g，NaCl5g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，琼脂20g，水1000ml
2.无菌生理盐水
3.出发菌株的制备（无菌条件下操作）
将出发菌株从试管中用25mL生理盐水多次洗出洗出，倒入含有玻璃珠的无菌三角瓶中，进行反复振荡20min。
4.紫外线诱变及初筛
选择合适辐照剂量对出发菌株进行诱变，接入摇瓶培养2个小时后稀释涂布平板，用报纸包裹在黑暗条件下培养48h，然后喷洒稀碘液记录比透明圈。
比透明圈＝透明圈直径（mm）/菌落直径（mm）
五.记录汇总与分析
1.列出各组结果
2.各做进行对比分析在不同剂量条件的正突变发生率和发生正突变幅度和计量的关系以及发生最大突变的幅度在什么剂量条件下。
六讨论
七作业
1.统计不同剂量条件的正突变发生率和发生正突变幅度和计量的关系以及发生最大突变的幅度在什么剂量条件下的意义是什么？
2.为什么最后把最佳诱变剂量用致死率和正突变率进行表示，而不用诱变时间进行描述？
（3）高产淀粉酶菌株复筛（4学时）
一目的
进一步对高产淀粉酶菌株进行筛选定量确定为高产淀粉酶生产菌。
二原理
琼脂平板活性测定方法，可以简便、快速得进行初筛节约大量得时间，但是难以得到确切的产量水平，只适合于初筛。
初筛具有不稳定性，要进一步确定生产优良性状的菌株就有必要对其进行摇瓶复筛，定量的确定其生产水平，更为准确的确定优良性状的菌株。
三.材料与仪器
1.材料（出发菌株选取10个）
蛋白胨，牛肉膏，NaCl，可溶性淀粉，葡萄糖（分析纯）、蒸馏水DNS液
2.仪器
三角瓶、容量瓶、吸管（1mL,5mL,25mL）、烘箱、试管架、吸耳球、称量纸、分光光度计、烧杯、恒温水浴锅、离心机、记号笔、电炉、搪瓷缸
四．方法与步骤
1.摇瓶培养基的配置
可溶性淀粉2g，NaCl5g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，琼脂20g，水1000ml
2.接种
取斜面，倒入无菌培养基，用无菌接种针打散斜面上的菌苔，再倒回装有无菌培养基的三角瓶中进行培养24小时。
24小时后以10％接种量进行扩大培养24小时。
3.离心
将发酵液离心，取上清。
4.淀粉酶活力的测定
比色法测定α-淀粉酶的活力
五结果
共享数据
菌株编号
酶活
确定最优生长性状的淀粉酶菌株
六讨论
七作业
为什么要进行复筛？
（4）高产淀粉酶生产菌株的稳定性（4学时）
一目的
通过复筛获得的高产突变菌株进行遗传稳定性研究
二原理
由于高产酶诱变菌株在培养繁殖过程中容易发生回复突变或由于纯化不够彻底造成菌株的退化等现象。
尤其是紫外诱发的多是碱基转换，在培养过程更容易发生再次转换从而造成回复突变。
通过多次传代培养观察其产量变化情况，或通过连续培养观察其产量变化情况。
三.材料与仪器
1.材料（出发菌株选取10个）
蛋白胨，牛肉膏，NaCl，可溶性淀粉，葡萄糖（分析纯）、蒸馏水
2.仪器
三角瓶、容量瓶、吸管（1mL,5mL,25mL）、烘箱、试管架、吸耳球、称量纸、分光光度计、烧杯、恒温水浴锅、离心机、记号笔、电炉、搪瓷缸
四．方法与步骤
1.摇瓶培养基的配置
可溶性淀粉2g，NaCl5g，牛肉膏5g，蛋白胨10g，水1000ml
2.接种及连续传代培养
取斜面，倒入无菌培养基，用无菌接种针打散斜面上的菌苔，再倒回装有无菌培养基的三角瓶中进行培养8小时。
8小时后以10％接种量进行扩大培养8小时，依次类推至10代。
3.离心
将发酵液离心，取上清。
4.淀粉酶活力的测定
比色法测定α-淀粉酶的活力
五实验结果
代数
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
活力
六讨论
七作业
1.传代培养的意义？
2.传代培养的方法还有哪些？
（5）淀粉酶活力测定（2学时）
（1）DNS法
目的和要求
掌握DNS法测定还原糖和多糖的方法，并利用此法测定该工艺中淀粉酶的糖化力，以及酒精发酵过程中还原糖的测定达到对发酵过程的控制。
一.原理
3，5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的颜色深度成正比。
因此，可利用分光光度计进行比色测定，求得样品的含糖量。
该方法主要用于糖化酶的淀粉酶活力测定。
二.材料与试剂
a）材料：
葡萄糖（分析纯）、蒸馏水
b）试剂：
DNS液
c）器材：
容量瓶、吸管（1mL,5mL,25mL）、烘箱、试管架、吸耳球、称量纸、分光光度计、烧杯、恒温水浴锅、离心机、记号笔、电炉、搪瓷缸
三.操作方法
a）标准曲线的制作
管号
0
1
2
3
4
5
葡萄糖标准液（mL）
0
0.2
0.4
0.4
0.8
1.0
蒸馏水（mL）
2
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
DNS试剂（mL）
1.5
沸水浴（min）
5
冷却
流水冷却
蒸馏水（mL）
21.5
A540
四.结果
1.以吸光度为横坐标，葡萄糖质量为纵坐标作图。
并借助计算机计算出相关系数和曲线方程。
（2）比色法测定α-淀粉酶的活力
一、原理:
酶促反应速度大小可以作为酶活性的大小,也可以作为酶量多少的衡量标准,故可以从单位时间内一定条件酶促反应中底物的消耗量或产物的生成量来测定.
本实验采用的快速比色法即利用一定量的淀粉被淀粉酶水解后,不能与碘显蓝色所需要的时间来确定其活性.该方法简单、快速、经济。
该方法主要用于液化淀粉酶活力的测定。
试剂：
二、试剂配置
ApH6.0,0.02mol/L磷酸盐缓冲液
（a）液0.02mol/L的Na2HPO4·2H2O（相对分子质量178.05）溶液配置：
精确称取3.56克磷酸氢二钠,用去离子水定容至1000mL.
（b）液0.02mol/L的NaH2PO4·H2O（相对分子质量138.01）溶液配置：
精确称取2.76克磷酸氢二钠,用去离子水定容至1000mL.
取上述（a）液12.3mL,（b）液87.7mL混合再利用（a）液和（b）液使用酸度计调节混合液至pH6.0.
B.原碘液:
称取结晶碘2.2g,碘化钾4.4g,先用少量去离子水使碘溶解后（注意不可加热,否则碘挥发）,再用去离子水定容至100mL,贮存于棕色瓶,避光保存.
C.稀碘液:
取上述原碘液2mL,加20g碘化钾,用去离子水定容至500mL,贮存于棕色瓶,避光保存.
D.标准终点色溶液:
（a）液:
精确称取氯化钴（CoCl2·6H2O）40.243g和重铬酸钾0.488g,用去离子水定容至500mL.
（b）液:
精确称取铬黑-T（C20H12N3NaO7S）40mg,用去离子水溶解并定容至100mL,棕色瓶保存.
使用时（a）液40mL（b）液5ml混合,装棕色瓶中于冰箱保存,现用现配,使用15d后需要重新配置.
E.2%可溶性淀粉溶液:
称取2g可溶性淀粉,缓缓倒入煮沸的去离子水中,加热煮沸至溶液透明为止,冷却后定容至100mL.
三测定方法
A.在6孔（12孔）比色板中,一孔约加0.5mL标准终点色溶液,作为比较颜色的标准;其余孔内用滴管加入约0.5mL稀碘液,备用.
B.在25mL比色管中分别加入2%淀粉溶液20mL和pH6.0磷酸盐缓冲液5ml,置60℃恒温水浴锅中预热4~5min.
C.用移液管吸取1mL待测酶液,加入上述预热的装有pH6.0的磷酸缓冲液和淀粉溶液的比色管中,充分混匀,同时立即利用秒表开始记时.定时用滴管吸取反应液约0.5ml,迅速滴入预先含有比色稀释碘液的比色板孔内,当不断取样,至孔内颜色反应逐渐由紫色变为红棕色,与标准终点色相同时,即为反应终点,秒表停止记时,记录反应时间t（min）.
四酶活计算
酶活单位的定义:
在60℃，pH6.0的条件下,每毫升酶液每分钟水解可溶性淀粉的微摩尔数,即为一个酶活力单位,以μmol/（min·ml）表示或（u/mL表示）.
计算公式:
酶活力=
式中:
n---酶液稀释倍数
t---反应时间,mim
V—酶液加量,ml
20—可溶性淀粉溶液的体积,mL
2%--可溶性淀粉溶液的浓度
106---将g换算为μg.
第三篇培养条件优化
1试验设计
在工业化发酵生产中，发酵培养基的设计是十分重要的，因为培养基的成分对产物浓度、菌体生长都有重要的影响。
实验设计方法发展至今可供人们根据实验需要来选择的余地也很大。
1.1单因素法（Oneatatime）
单因素方法的基本原理是保持培养基中其他所有组分的浓度不变，每次只研究一个组分的不同水平对发酵性能的影响。
这种策略的优点是简单、容易，结果很明了，培养基组分的个体效应从图表上很明显地看出来，而不需要统计分析。
这种策略的主要缺点是：
忽略了组分间的交互作用，可能会完全丢失最适宜的条件；不能考察因素的主次关系；当考察的实验因素较多时，需要大量的实验和较长的实验周期。
但由于它的容易和方便，单因素方法一直以来都是培养基组分优化的最流行的选择之一。
1.2正交实验设计（Orthogonaldesign）
正交设计就是从“均匀分散、整齐可比”的角度出发，是以拉丁方理论和群论为基础，用正交表来安排少量的试验，从多个因素中分析出哪些是主要的，哪些是次要的，以及它们对实验的影响规律，从而找出较优的工艺条件。
石炳兴等利用正交实验设计优化了新型抗生素AGPM的发酵培养基，结果在优化后的培养基上单位发酵液的活性比初始培养基提高了18.9倍。
正交实验不能在给出的整个区域上找到因素和响应值之间的一个明确的函数表达式即回归方程，从而无法找到整个区域上因素的最佳组合和响应值的最优值。
而且对于多因素多水平试验
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