FACSCalibur分选.docx

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FACSCalibur分选

第六章FACSCalibur分选

本章要点

1.分选原理

2.维护分选管路

3.分选操作

4.纯度检验

6．1分选概述

流式细胞仪流动室中细胞由下至上运动，流动室喷嘴上方有捕获管用于收集细胞。

细胞通过激光时，电子系统马上依据分选门的限定判定该细胞是否为目的细胞，如确定，即依照之前用户选定的分选模式分选。

一旦决定捕获该目的细胞，电子系统在移动捕获管至样本液流中进行捕获前等待一段固定时间以便让细胞到达捕获部位。

捕获管最大捕获速率为300/秒，不进行细胞分选时，捕获管停留在鞘液中。

下图显示了捕获管静止与分选时的位置。

由于捕获管等待捕获时停留在鞘液中，它在捕获细胞的同时也收集了鞘液，因此会导致样本稀释，所以收获管必须离心以浓集细胞。

图1

6．1.1收集系统

分选后的细胞被收集到50mL收集管中，如图，收集管可以放置在3个收集端口。

机器可以自动检测已连接的收集管数目并自动由左（管1）向右注入分选的样本。

注满每管（40～45mL）大约需要9分钟。

如果在分选结束前收集管被注满，分选会继续，而样本会流入废液罐中。

如果你想在收集管注满后继续分选，可以将其换下换上用BSA包被的新管，点击PAUSE,然后点击START或RESUME。

分选液路清洗按钮

你的机器是否有清洗按钮取决于你购买时的选择。

如机器配有清洗按钮，按动按钮，机器会自动冲洗分选管路。

该按钮用于分选前检测管路是否干净，分选后冲洗管路。

收集管

图2

图3

6.1.2分选模式

分选液滴（sortenvelope）是指捕获管捕获一个目的细胞时所收集的那一段样本液流，其大小反映了捕获管捕获细胞时在样本液流中停留的时间。

当然，该液滴包含目的细胞，也可能包含非目的细胞，这就产生了矛盾：

如果有非目的细胞与目的细胞在一起，捕获管是否该捕获该液滴？

由此需引出分选模式，下图显示了不同分选模式下捕获管的分选策略。

图4分选模式

分选模式的选择依据目的细胞所占的百分比及分选的目的，例如，如果你在分选一个稀少的细胞群你会要求较低的纯度以便获得尽可能多的目的细胞。

可供选择的分选模式有：

★单细胞模式（singlecell）

只有在分选液滴中仅含有单个目的细胞时才会发生分选，如有其它细胞在液滴中，则该液滴将不被捕获。

该模式会有高纯度，不太重视回收率。

★回收模式（recovery）

如分选液滴中除含有目的细胞外还含有其它细胞，该液滴仍会捕获。

如果另一目的细胞恰巧位于该液滴外，捕获管会在样本液流中继续停留至将其捕获。

★排除模式（exclusion）

只有在分选液滴中含有一个目的细胞且不含非目的细胞时分选才会发生。

如果另一目的细胞恰巧位于该液滴外，捕获管不会在样本液流中继续停留捕获它。

6.1.3样本浓度与分选模式的选择

在样本速率为2000粒子/秒时会有最大分选速率，如果一个样本细胞浓度在107细胞/mL，使用低速（LO）即可得到最大分选速率。

如样本浓度增加，样本速率增加，反之则减少。

如样本速率低于或高于2000细胞/秒则分选速率下降。

有时一个细胞浓度为107个细胞/mL的样本上机后，仍需调节细胞浓度以使分选速率达到2000粒子/秒，这可能是因为流式细胞仪低速并非绝对12

μL/秒（LO＝12±2μL/秒），另一个原因可能是血球计数仪不计数红细胞、血小板及碎片等流式细胞仪计数的粒子。

如果你准备分选一个低浓度样本，最好使用<2000粒子/秒流速，减少2个细胞同时出现在一个分选液滴中的可能（coincidence），以便在单细胞模式（singlecell）获得最大收获率。

与单细胞模式及排除模式不同，回收模式在细胞速率>2000粒子/秒（最高可达2500粒子/秒）时分选速率仍增加，表明未达到300次分选/秒，由于忽略了coincidence，分选纯度将随样本速率的增加而下降，这是由于非目的细胞出现在分选液滴中的可能随样本速率增加而最大。

因此在超过单细胞模式最佳样本速率2000粒子/秒时系统仍继续分选。

6.1.4样本速率对分选速率的影响

理解样本速率对分选速率的影响十分重要，下图显示了单细胞模式下两者的关系。

对于不同给定目的细胞百分比的样本，其最大分选速率都出现在样本速率为2000粒子/秒时。

例如，对一个含目的细胞60%的样本，在样本流速为2000粒子/秒时出现其最大分选速率－300细胞/秒。

注意：

如果样本目的细胞含量低于30％，在单细胞模式下将不能达到300次分选/秒的最大分选速率，例如，含目的细胞10％的样本在样本速率为2000粒子/秒时其分选速率为50～100次分选/秒。

图5

6.2分选窗口

6.2.1SortSetup

从Acquiremenu选择SortSetup如图6。

依据样本中目的细胞的百分比及实验目的决定分选模式，例如在分选所占样本比例小的群体时，应选择较低纯度以获得尽可能多的目的细胞。

图6图7

SortSetup窗口中的选项：

●SortGate—显示逻辑门列表，用户从中选择分选门，如选择NoGate（所有细胞）将只进行获取不分选。

●SortCount---选择将要分选的细胞数，选择0将连续分选。

●SortMode---有3种模式可供选择：

SingleCell、Recovery、Exclusion。

●AbortedCell---选择是否显示排除细胞数。

细胞不能准确时将被排除，常见的情况是两个细胞出现距离过近，即coincedence。

6.2.2SortCounters

从Cytometer菜单选择SortCounters，如图7。

3个计数板可以显示4个速率或累积数：

阈值（Theshold）、辅助（Auxiliary）、分选（Sort）、排除（Abort）。

计数板1可以选择Theshold或Auxiliary

计数板2可以选择Theshold或Sort

计数板3可以选择Abort或Sort

●阈值（Theshold）速率或累积数---显示设定阈值以上检测的细胞速率（粒子/秒）或累积数（包括排除细胞）

●辅助（Auxiliary）速率或累积数--显示检测的全部细胞速率（粒子/秒）或累积数（包括排除细胞）

●分选（Sort）速率或累积数--显示分选细胞速率（粒子/秒）或累积数

●排除（Abort）速率或累积数--显示分选细胞速率（粒子/秒）或累积数

6.3准备收集管

收集管应用4%牛血清白蛋白（BSA）包被，以便在离心时保持细胞完整，提高收获率。

BSA使用前过0.45μm滤膜。

4%牛血清白蛋白（BSA）用1PBS/0.1%NaN3配制。

注意：

如要分选活细胞，BSA溶液中不加NaN3！

1.在50mL锥型管中加满4%BSA（1PBS/0.1%NaN3）。

剩余BSA储存在2-80C。

2.将锥型管冰浴或冰箱至少放置1小时。

3.将BSA转入其他锥型管。

BSA溶液可以循环使用1个月。

6.4分选

6.4..1清洗分选管线

如果您的机器有冲洗按钮（PurgeButton）

●进样针处放一支装有PBS的上样管，用PBS替换鞘液。

●按液流控制键RUN。

●在最左边的收集接口放上一支50mL锥型管。

●点击冲洗按钮（PurgeButton）。

●取下锥型管换到中间的收集接口。

●点击冲洗按钮（PurgeButton）。

●取下锥型管换到最右边的收集接口。

●点击冲洗按钮（PurgeButton）。

●按液流控制键STANDBY。

如果您的机器没有冲洗按钮（PurgeButton）

●进样针处放一支装有PBS的上样管，用PBS替换鞘液。

●从左至右依次在收集接口放上3支50mL锥型管。

●按液流控制键RUN。

●点击获取控制窗口内的Aquire键。

●当最左边的锥型管收集大约2mL时取下。

同样操作中间及最右边的。

●点击获取控制窗口内的Pause、Abort键。

●按液流控制键STANDBY。

6.4.2准备

分选前应优化流式细胞仪的测定条件，建立分选门。

●进入CellQuest。

●从获取菜单连机。

●打开CellQuest中存储的获取窗口，打开优化后存储的仪器设置条件。

●进样针处防上样本管。

●点击Aquire。

●点击工具栏，在FITC与PE双阳性的细胞群体圈门2。

如图8，门1在优化时圈在淋巴细胞上。

图8

●从Gates菜单选择GateList，定义G3=R1ANDR2（旦门被定义，将变为斜体显示G3）此时FL1与FL2双阳性的淋巴细胞将被分选。

●关闭GateList。

6.4.3收集分选前数据

分选前收集一个数据资料，将此数据与用分选后的样本收集的数据比较，以确定分选样本的纯度。

●选取存储文件夹及文件名

●选取存储参数，去除P6、P7。

●去除获取控制窗口SETUP前的。

●获取样本。

●进样针处换上蒸馏水跑至少30秒。

●按液流控制键STANDBY。

●保存实验文件。

6.4.4分选条件设置

●从获取菜单选取SortSetup。

●分选门一栏选择G3=R1ANDR2。

●分选计数一栏选择0。

●分析模式一栏选择排除（Exclusion）。

●排除细胞一栏选择不显示。

●点击OK。

●从Cytometer菜单选择分选计数板。

●计数板第一栏选择ThresholdTotal。

●计数板第二栏选择SortTotal。

●计数板第三栏选择SortRate。

6.4.5分选目的细胞

●确认除获取控制窗口SETUP前的存在。

●从左至右依次在收集接口放上3支BSA包被的50mL锥型管。

●按流速控制键LO。

↯注意：

注满一支50mL锥型管大约需要9分钟。

当锥型管注满，点击Pause，换新管，再点击Restart，计数板会回零，如点击Resume，计数板将继续计数。

但无论点击Restart或Resume，分选收集将从最左边的锥型管重新开始。

●点击液流控制键RUN。

●从进样针进样。

●点击获取控制窗口Aquire。

●分选结束时点击Pause，Abort。

●取下样本管，换上1mL蒸馏水。

●点击获取控制窗口Standby。

●取下收集锥型管。

↯注意：

分选的细胞含有大量BSA，如果实验要求低水平的外源性蛋白（如Western-blot），可以将细胞重新悬浮与1mLPBS中，转入干净的试管再离心。

6.4.6清洗分选管路

♥准备注射器

●将注射器注满蒸馏水。

●排空气泡。

●将注射器与流式细胞仪SALINEFILTER端口连接。

如图9。

图9

如果您的机器有冲洗按钮（PurgeButton）

●在最左边的收集接口放上一支50mL锥型管。

●进样针处放一支装有蒸馏水的上样管。

●按液流控制键RUN。

●点击冲洗按钮（PurgeButton）。

●缓慢而有力的推进注射器柄，直至推入10mL蒸馏水，进入收集锥型管。

↯注意：

每次点击冲洗按钮（PurgeButton）真空泵将连续工作30秒，如果锥型管未收够10mL，可以再次点击冲洗按钮。

●取下锥型管换到中间的收集接口。

●点击冲洗按钮（PurgeButton）。

●取下锥型管换到最右边的收集接口。

●点击冲洗按钮（PurgeButton）。

●取下注射器，重新连好液路。

●从获取菜单选择SortSetup。

●分选门一栏选择NOGATE。

●点击OK。

●按液流控制键STANDBY，进样针处放上1mL蒸馏水。

如果您的机器没有冲洗按钮（PurgeButton）

●从左至右依次在收集接口放上3支50mL锥型管。

●断开滤膜。

●将注射器与流式细胞仪SALINEFILTER端口连接。

●进样针处放一支装有蒸馏水的上样管。

●按液流控制键RUN。

●确认除获取控制窗口SETUP前的存在。

●点击获取控制窗口内的Aquire键。

●缓慢而有力的推进注射器柄，直至推入10mL蒸馏水，进入收集锥型管。

●取下锥型管换到中间，同样操作中间及最右边的。

●点击获取控制窗口内的Pause、Abort键。

●按液流控制键STANDBY。

●取下注射器，重新连好液路。

●从获取菜单选择SortSetup。

●分选门一栏选择NOGATE。

●点击OK。

●按液流控制键STANDBY，进样针处放上1mL蒸馏水。

6.4.7浓缩样本

●取下锥型收集管，盖好。

●离心300g5分钟。

●用真空系统及巴斯德加样器吸取上清。

●将细胞重新悬浮于0.5mLPBS中。

●将细胞悬液转移至1275mmFalcon管中。

6.5检验分选纯度

分选后细胞纯度应在95%以上。

包括：

●获取一个分选后数据资料。

●检验分选纯度。

↯注意：

收集分选后数据资料前应跑3分钟蒸馏水，确保分选前的残存细胞不影响分选后数据资料的分析。

1、用先前的获取窗口或文件获取分选后的细胞，存储一个数据文件。

2、重新定义FSC&SSC,FL1&FL2两个获取窗口为分析窗口，设为NOGATE。

3、载入分选后数据资料至两窗口。

4、做两窗口的门内统计。

5、比较%Gated与%TotalforG3（两者数值应一致）。

6.6分选问题讨论

下列几个因素会影响分选的结果，是实验中需要严格控制的关键。

1、鞘液

●分选前切记拧紧鞘液桶盖。

分选过程中，鞘液流速是决定分选时间的重要因素，鞘液桶盖不严或滤膜

处大量气泡会改变液流流速，影响分选效果。

拧紧鞘液桶盖后，仔细听有

无嘶嘶声，如有，需要重新拧紧鞘液桶盖，如果鞘液桶盖已拧紧，仍有嘶

嘶声，说明鞘液筒或盖子有漏洞，需要更换。

●分选前灌满鞘液，避免分选中加液。

可以用CellQuest中的Status窗口监测鞘液筒状况，但最好在实验开始前

查看鞘液水平。

2、细胞收获率与存活率

●如果分选后的细胞不能马上转移，应将锥型收集管置于冰上。

如果希望获得活细胞，应在分选后立即离心，离心后细胞于含蛋白培养基中4

0C冰浴。

用5mL冷的20%BSA在分选前包被收集管会提高细胞存活率。

●确定分选后的目的细胞都被收集了，在分选时间较短的情况下更为重要。

分选结束后取下样本管，防上PBS管继续分选20秒以使所有被分选了的目的细胞都能到达收集管。

可以用CellQuest中的计时器（Timer）计时。

3、分选

●优化样本测定阈值

阈值以下的粒子仪器会自动排除在分选之外。

如果希望检测红细胞或血小板，

散射光阈值应射得足够低，使其能够被检测到。

如果阈值过低，机器会检测到碎片，碎片与目的细胞同时出现在一段分选液

柱的频率增大（coincidence），会影响目的细胞被分选。

●使用低速分选

分选模式是依据低速液流建立，高速或中速会影响分选纯度。

●如果分选时细胞未到达收集管，检查分选液路及收集部件电子系统。

小的盐晶会在分选管或收集部件处形成。

轻触管路会使它们松脱，如果不行，见下一节栓块排除或日常维护清洗章节。

↯注意：

当打开分选装置盖检查时，激光会自动熄灭以确保安全。

查看机器状态栏确保激光回复到最大功率后再开始分选。

如果分选时细胞仍未到达收集管，检查分选液路及收集部件后边的电子系统：

分选时会有两个红灯亮着，一个表示机器处于分选模式，另一个显示处于收集状态的收集管位置。

如果更换收集中的收集管，一个灯继续亮，另一个灯将转换到新的收集部位。

如果此处有异常，请与BD工程师联系。

●长时间分选时经常摇晃样本管，防止样本沉积。

样本沉积是分选中分选速度降低的最常见原因。

如果取下样本摇匀,应点击Pause停止分选。

重新上样后等几秒钟再按Restart或Resume，避免在样本加压时分选。

●当收集管3收满后换上3个新的包被过的收集管，将收集设到管1。

4、栓塞

使用下列方法排除分选管路或收集管路中的栓塞。

●确认进样针处有上样管，液流控制打到RUN。

●打开仪器盖，断开分选管路。

即关闭到收集部的管路。

如果断端有液体流出，说明此处无栓塞，可以重新连上管路。

反之，需要仔细检查该管路，有无可见颗粒、盐晶，可以轻压栓塞处管外壁以排除。

●检查收集部管路。

5、检测分选工作状况

建议鞘液使用，用FACSFlow稀释的CaliBRITE标准微球检测分选状况。

●清洗分选管路。

●样本采用未标记、FITC与PE标记的标准微球，FSC-SSC图上，圈单个微球群体为门1，FL1-FL2图上圈FITC阳性群体为蒽，设分选门G3=R1ANDR2。

●分选至3支BSA包被的50mL锥型管中。

离心300g5分钟。

弃上清，流0.5ml液体，重新悬浮细胞。

用此样本获取一个分选后数据资料。

●用先前的获取窗口或文件获取分选后的细胞，存储一个数据文件。

重新定义FSC&SSC,FL1&FL2两个获取窗口为分析窗口，设为NOGATE。

载入分选后数据资料至两窗口。

做两窗口的门内统计。

比较%Gated与%TotalforG3（两者数值应一致）。

%Gated应在95%以上。

分选样本的纯度与样本处理技术密切相关。

6、结束分选

结束分选的方法

选择

结果

获取控制窗口

AcquisitionControlWindow

分选设置窗口SortSetupWindow

获取与存储窗口Acquisition&StorageWindow

点击Pause，Abort

分选结束

Setup前打

分选计数板设到0

分选继续，但不存储数据

Setup前无

分选计数板设到0

设定获取细胞数

达到设定细胞数时分选停止，存储了一个数据文件

Setup前无

分选计数板设到0

设定获取细胞数或获取时间

达到设定细胞数或时间时分选停止，如果希望用时间标准，可以将获取细胞数设大，即在到达细胞数标准前到达时间标准。

存储了一个数据文件

Setup前打

设定分选计数板

达到设定细胞数时分选停止，无数据文件存储

Setup前无

设定分选计数板

设定获取细胞数

达到设定细胞数时分选停止，存储了一个数据文件

Setup前无

设定分选计数板

设定获取细胞数或获取时间

达到设定细胞数或时间时分选停止，如果希望用时间标准，可以将获取细胞数设大，分选计数设为0，即在到达细胞数标准前到达时间标准。

存储了一个数据文件

6.7FACSCalibur无菌分选

FACSCalibur可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。

1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。

●3L70%乙醇（乙醇用无菌蒸馏水配制）

●5L无菌PBS

2、在干净的鞘液筒中加入3L70%乙醇（注意按无菌技术操作）。

3、盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗涤。

4、安好鞘液筒，用一小瓶乙醇冲洗收集管接口处。

5、在收集管接口处安装3支收集管。

6、放上一支装有70%乙醇的进样管。

7、设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。

8、从Acquiremenu选择SortSetup。

9、在SortGate菜单中选择步骤７设定的分选门。

10、按液流控制键RUN。

11、点击AcquisitionControl菜单中Acquire。

在Setup方框中打叉。

12、跑乙醇直至3支收集管注满。

13、点击Pause，Abort，断开鞘液筒。

14、重复上述步骤直至乙醇跑完。

15、在鞘液筒中加入500mL无菌PBS，振摇鞘液筒，倒掉PBS，反复操作直至洗净桶内壁残余乙醇。

16、在鞘液筒中加入3L无菌PBS，盖紧盖子。

17、安好鞘液筒。

18、在收集管接口处安装3支新的收集管。

19、放上一支装有无菌PBS的进样管。

20、点击AcquisitionControl菜单中Acquire。

21、跑PBS约10分钟以洗净管路中的乙醇。

第一支收集管（最左）中收集15mLPBS后取下，使PBS由左至右流入下一收集管。

重复操作至3个管都收集了15mLPBS为止。

22、点击Pause，Abort。

23、应用无菌技术，用无菌PBS/4%BSA缓冲液包被50mL锥型管。

24、将包被好的锥型管安置于收集接口。

25、按前述分选步骤分选样本。

注意：

无菌分选时机器所在的房间最好为无菌间，如不能达到，可以在房间内安装紫外灯，使用紫外线消毒。

操作人员应穿着无菌衣，戴口罩、帽子操作。

上样前可以以酒精喷雾消毒进样针周围。

6.8分选细胞浓缩系统

6.8.1系统简介

细胞浓缩系统是FACSCalibur或FACSort流式细胞仪的附件，用来收集和浓缩被分选的细胞。

这是一个完整的独立的系统包括一个可移动的浓缩器和一个废液罐。

（见下图所示）

通过将细胞浓缩系统连接在细胞仪的收集部位，你可直接将细胞分选到细胞培养嵌入物或者是浓缩器中的滤膜上。

这个系统还配有废液罐，可以收集从分选细胞悬液中溢出的多余的鞘液。

细胞浓缩系统的供气管路和分选管路都连接在细胞仪第三个（即最右边）收集端口的位置，因此，配有细胞浓缩系统的流式细胞仪既可以将细胞分选至浓缩器，也可分选至其它两个收集端口。

*注意：

BDIS并无检验过该系统对细胞的活性有无影响，因此，不建议用户用细胞浓缩系统来回收有活性的细胞。

1.控制面板

控制面板安装在细胞仪的收集部分，如图所示。

系统开关，气压按钮和气压调节悬钮都位

于这个面板上。

ConcentratorON/OFFbutton

这个按钮控制着细胞浓缩系统的开关，一旦打开，流式细胞仪将自动分选细胞到细胞浓缩系统而不是收集管，这时气压显示屏的灯亮，并显示000。

PressureON/OFFbutton

这个按钮控制着浓缩器气压的开关，在打开气压之前，你必须确认系统的开关已经打开。

一旦气压打开，显示屏会显示在000和999之间的某一个数字。

PressureADJUSTknob

这个悬钮允许你调节浓缩器内的气压，增大气压也就增大了液流通过滤膜或细胞培养嵌入物的速度。

显示屏显示的是外加在调节气流的阀门上的电压的大小。

Sort-LinePurgeButton

位于控制面板下方的一个按钮，用于自动清洗分选管路。

2.

浓缩器

这个可移动的容器分成上下两个部分，通过细胞培养嵌入物或滤膜支持物隔开。

被分选的细胞流经分选管路被沉积在培养基或是滤膜支持物中。

空气被过滤后通过气管导入容器的上层，以起到加压的作用；容器的下层用来收集通过滤膜的鞘液，一条废液管引导鞘液至废液罐，如图所示。

容器底部安装了一块磁铁以确保该容器稳固地放置在细胞浓缩系

统的基座上或是仪器的收集部位。

3．废液罐

这个1升的容器用来收集从被分选的细胞悬液中溢出的鞘液（如图），这部分鞘液通过滤膜，沉积到浓缩器的下部，然后被输出到废液罐，而洁净的空气最后则由一个0.22-um的滤器中逸出。

记住，每次在你给细胞仪的鞘液罐添加鞘液时，同时倒空废液罐。

6.8.2细胞培养基嵌入物和滤膜的制备

从浓缩器中回收细胞可通过两种途径：

在滤器支持物中插入滤膜或是使用细胞培养基嵌入物。

细胞培养基嵌入物在使用前需