技术规范标准炭疽防治技术规范.docx

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技术规范标准炭疽防治技术规范

十三、炭疽防治技术规范

炭疽（Anthrax）是由炭疽芽胞杆菌引起的一种人畜共患传染病。

世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。

为预防和控制炭疽，依据《中华人民共和国动物防疫法》和其它相关法律法规，制定本规范。

1适用范围

本规范规定了炭疽的诊断、疫情报告、疫情处理、防治措施和控制标准。

本规范适用于中华人民共和国境内一切从事动物饲养、经营及其产品的生产、经营的单位和个人，以及从事动物防疫活动的单位和个人。

2诊断

依据本病流行病学调查、临床症状，结合实验室诊断结果做出综合判定。

2.1流行特点

本病为人畜共患传染病，各种家畜、野生动物及人对本病都有不同程度的易感性。

草食动物最易感，其次是杂食动物，再次是肉食动物，家禽一般不感染。

人也易感。

患病动物和因炭疽而死亡的动物尸体以及污染的土壤、草地、水、饲料都是本病的主要传染源，炭疽芽胞对环境具有很强的抵抗力，其污染的土壤、水源及场地可形成持久的疫源地。

本病主要经消化道、呼吸道和皮肤感染。

本病呈地方性流行。

有一定的季节性，多发生在吸血昆虫多、雨水多、洪水泛滥的季节。

2.2临床症状

2.2.1本规范规定本病的潜伏期为20天。

2.2.2典型症状

本病主要呈急性经过，多以突然死亡、天然孔出血、尸僵不全为特征。

牛：

体温升高常达41℃以上，可视黏膜呈暗紫色，心动过速、呼吸困难。

呈慢性经过的病牛，在颈、胸前、肩胛、腹下或外阴部常见水肿；皮肤病灶温度增高，坚硬，有压痛，也可发生坏死，有时形成溃疡；颈部水肿常与咽炎和喉头水肿相伴发生，致使呼吸困难加重。

急性病例一般经24～36小时后死亡，亚急性病例一般经2～5天后死亡。

马：

体温升高，腹下、乳房、肩及咽喉部常见水肿。

舌炭疽多见呼吸困难、发绀；肠炭疽腹痛明显。

急性病例一般经24～36小时后死亡，有炭疽痈时，病程可达3～8天。

羊：

多表现为最急性（猝死）病症，摇摆、磨牙、抽搐，挣扎、突然倒毙，有的可见从天然孔流出带气泡的黑红色血液。

病程稍长者也只持续数小时后死亡。

猪：

多为局限性变化，呈慢性经过，临床症状不明显，常在宰后见病变。

犬和其它肉食动物临床症状不明显。

2.3病理变化

死亡患病动物可视黏膜发绀、出血。

血液呈暗紫红色，凝固不良，粘稠似煤焦油状。

皮下、肌间、咽喉等部位有浆液性渗出及出血。

淋巴结肿大、充血，切面潮红。

脾脏高度肿胀，达正常数倍，脾髓呈黑紫色。

严禁在非生物安全条件下进行疑似患病动物、患病动物的尸体剖检。

2.4实验室诊断

实验室病原学诊断必须在相应级别的生物安全实验室进行。

2.4.1病原鉴定

2.4.1.1样品采集、包装与运输

按照NY／T5612.1.2、4.1、5.1执行。

2.4.1.2病原学诊断

炭疽的病原分离及鉴定（见NY/T561）。

2.4.2血清学诊断

炭疽沉淀反应（见NY/T561）。

2.4.3分子生物学诊断

聚合酶链式反应（PCR）（见附件1）。

3疫情报告

3.1任何单位和个人发现患有本病或者疑似本病的动物，都应立即向当地动物防疫监督机构报告。

3.2当地动物防疫监督机构接到疫情报告后，按国家动物疫情报告管理的有关规定执行。

4疫情处理

依据本病流行病学调查、临床症状，结合实验室诊断做出的综合判定结果可做为疫情处理依据。

4.1当地动物防疫监督机构接到疑似炭疽疫情报告后，应及时派员到现场进行流行病学调查和临床检查，采集病料送符合规定的实验室诊断，并立即隔离疑似患病动物及同群动物，限制移动。

对病死动物尸体，严禁进行开放式解剖检查，采样时必须按规定进行，防止病原污染环境，形成永久性疫源地。

4.2确诊为炭疽后，必须按下列要求处理。

4.2.1由所在地县级以上兽医主管部门划定疫点、疫区、受威胁区。

疫点：

指患病动物所在地点。

一般是指患病动物及同群动物所在畜场（户组）或其它有关屠宰、经营单位。

疫区：

指由疫点边缘外延3公里范围内的区域。

在实际划分疫区时，应考虑当地饲养环境和自然屏障（如河流、山脉等）以及气象因素，科学确定疫区范围。

受威胁区：

指疫区外延5公里范围内的区域。

4.2.2本病呈零星散发时，应对患病动物作无血扑杀处理，对同群动物立即进行强制免疫接种，并隔离观察20天。

对病死动物及排泄物、可能被污染饲料、污水等按附件2的要求进行无害化处理；对可能被污染的物品、交通工具、用具、动物舍进行严格彻底消毒（见附件2）。

疫区、受威胁区所有易感动物进行紧急免疫接种。

对病死动物尸体严禁进行开放式解剖检查，采样必须按规定进行，防止病原污染环境，形成永久性疫源地。

4.2.3本病呈暴发流行时（1个县10天内发现5头以上的患病动物），要报请同级人民政府对疫区实行封锁；人民政府在接到封锁报告后，应立即发布封锁令，并对疫区实施封锁。

疫点、疫区和受威胁区采取的处理措施如下：

4.2.3.1疫点

出入口必须设立消毒设施。

限制人、易感动物、车辆进出和动物产品及可能受污染的物品运出。

对疫点内动物舍、场地以及所有运载工具、饮水用具等必须进行严格彻底地消毒。

患病动物和同群动物全部进行无血扑杀处理。

其它易感动物紧急免疫接种。

对所有病死动物、被扑杀动物，以及排泄物和可能被污染的垫料、饲料等物品产品按附件2要求进行无害化处理。

动物尸体需要运送时，应使用防漏容器，须有明显标志，并在动物防疫监督机构的监督下实施。

4.2.3.2疫区：

交通要道建立动物防疫监督检查站，派专人监管动物及其产品的流动，对进出人员、车辆须进行消毒。

停止疫区内动物及其产品的交易、移动。

所有易感动物必须圈养，或在指定地点放养；对动物舍、道路等可能污染的场所进行消毒。

对疫区内的所有易感动物进行紧急免疫接种。

4.2.3.3受威胁区：

对受威胁区内的所有易感动物进行紧急免疫接种。

4.2.3.4进行疫源分析与流行病学调查

4.2.3.5封锁令的解除

最后1头患病动物死亡或患病动物和同群动物扑杀处理后20天内不再出现新的病例，进行终末消毒后，经动物防疫监督机构审验合格后，由当地兽医主管部门向原发布封锁令的机关申请发布解除封锁令。

4.2.4处理记录

对处理疫情的全过程必须做好完整的详细记录，建立档案。

5预防与控制

5.1环境控制

饲养、生产、经营场所和屠宰场必须符合《动物防疫条件审核管理办法》（农业部[2002]15号令）规定的动物防疫条件，建立严格的卫生（消毒）管理制度。

5.2免疫接种

5.2.1各省根据当地疫情流行情况，按农业部制定的免疫方案，确定免疫接种对象、范围。

5.2.2使用国家批准的炭疽疫苗，并按免疫程序进行适时免疫接种，建立免疫档案。

5.3检疫

5.3.1产地检疫

按GB16549和《动物检疫管理办法》实施检疫。

检出炭疽阳性动物时，按本规范4.2.2规定处理。

5.3.2屠宰检疫

按NY467和《动物检疫管理办法》对屠宰的动物实施检疫。

5.4消毒

对新老疫区进行经常性消毒，雨季要重点消毒。

皮张、毛等按照附件2实施消毒。

5.5人员防护

动物防疫检疫、实验室诊断及饲养场、畜产品及皮张加工企业工作人员要注意个人防护，参与疫情处理的有关人员，应穿防护服、戴口罩和手套，做好自身防护。

附件1

聚合酶链式反应（PCR）技术

1试剂

1.1消化液

1.1.11M三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）（pH8.0）

三羟甲基氨基甲烷12.11g

灭菌双蒸水80mL

浓盐酸调pH至8.0

灭菌双蒸水加至100mL

1.1.20.5M乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）

二水乙二铵四乙酸二钠18.61g

灭菌双蒸水80mL

氢氧化钠调pH至8.0

灭菌双蒸水加至100mL

1.1.320%十二烷基磺酸钠（SDS）溶液（pH7.2）

十二烷基磺酸钠20g

灭菌双蒸水80mL

浓盐酸调pH至7.2

灭菌双蒸水加至100mL

1.1.4消化液配制

1M三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）（pH8.0）2mL

0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）0.4mL

20%十二烷基磺酸钠溶液（pH7.2）5mL

5M氯化钠4mL

灭菌双蒸水加至200mL

1.2蛋白酶K溶液

蛋白酶K5g

灭菌双蒸水加至250mL

1.3酚/氯仿/异戊醇混合液

碱性酚25mL

氯仿24mL

异戊醇1mL

1.42.5mmol/LdNTP

dATP（100mmol/L）20µL

dTTP（100mmol/L）20µL

dGTP（100mmol/L）20µL

dCTP（100mmol/L）20µL

灭菌双蒸水加至800µL

1.58pmol/µLPCR引物

上游引物ATXU（2OD）加入701µl灭菌双蒸水溶解，下游引物ATXD（2OD）加入697µL灭菌双蒸水溶解，分别取ATXU、ATXD溶液各300µL，混匀即为8pmol/µL扩增引物。

1.60.5单位TaqDNA聚合酶

5单位TaqDNA聚合酶1µL

灭菌双蒸水加至10µL

现用现配。

1.710×PCR缓冲液

1.7.11mol/L三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）（pH9.0）

三羟基甲基氨基甲烷15.8g

灭菌双蒸水80mL

浓盐酸调pH至9.0

灭菌双蒸水加至100mL

1.7.210倍PCR缓冲液

1mol/L三羟基甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）（pH9.0）1mL

氯化钾0.373g

曲拉通X-1000.1mL

灭菌双蒸水加至100mL

1.8溴化乙锭（EB）溶液

溴化乙锭0.2g

灭菌双蒸水加至20mL

1.9电泳缓冲液（50倍）

1.9.10.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0）

二水乙二铵四乙酸二钠18.61g

灭菌双蒸水80mL

氢氧化钠调pH至8.0

灭菌双蒸水加至100mL

1.9.2TAE电泳缓冲液（50倍）

三羟基甲基氨基甲烷（Tris）242g

冰乙酸57.1mlL

0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠溶液（pH8.0）100mL

灭菌双蒸水加至1000mL

用时用灭菌双蒸水稀释使用

1.101.5％琼脂糖凝胶

琼脂糖3g

TAE电泳缓冲液（50倍）4mL

灭菌双蒸水196mL

微波炉中完全融化，加溴化乙锭（EB）溶液20µL。

1.11上样缓冲液

溴酚蓝0.2g，加双蒸水10mL过夜溶解。

50g蔗糖加入50ml水溶解后，移入已溶解的溴酚蓝溶液中，摇匀定容至100mL。

1.12其它试剂

异丙醇（分析纯）

70%乙醇

15mmoL/L氯化镁

灭菌双蒸水

2器材

2.1仪器

分析天平、高速离心机、真空干燥器、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、液氮或-70℃冰箱、微波炉、组织研磨器、-20℃冰箱、可调移液器（2µL、20µL、200µL、1000µL）。

2.2耗材

眼科剪、眼科镊、称量纸、20mL一次性注射器、1.5mL灭菌离心管、0.2mL薄壁PCR管、琼脂糖、500mL量筒、500mL锥形瓶、吸头（10µL、200µL、1000µL）、灭菌双蒸水。

2.3引物设计

根据GenBank上已发表的炭疽杆菌POX1质粒序列，设计并合成了以下两条引物：

ATXU：

5’-AGAATGTATCACCAGAGGC-3’ATXD：

5’-GTTGTAGATTGGAGC

CGTC-3’，此对引物扩增片段为394bp。

2.4样品的采集与处理

2.4.1样品的采集

病死或扑杀的动物取肝脏或脾；待检的活动物，用注射器取血5～10mL，2～8℃保存，送实验室检测。

2.4.2样品的处理

每份样品分别处理。

2.4.2.1组织样品处理

称取待检病料0.2g，置研磨器中剪碎并研磨，加入2mL消化液继续研磨。

取已研磨好的待检病料上清100µL加入1.5mL灭菌离心管中，再加入500µL消化液和10µL蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中4～16h。

2.4.2.2待检菌的处理

取培养获得的菌落，重悬于生理盐水中。

取其悬液100µL加入1.5mL灭菌离心管中，再加入500µL消化液和10µL蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中过夜。

2.4.2.3全血样品处理

待血凝后取上清放于离心管中，4℃8000g离心5分钟，取上清100µL，加入500µL消化液和10µL蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中过夜。

2.4.2.4阳性对照处理

取培养的炭疽杆菌，重悬于生理盐水中。

取其悬液100µL，置1.5mL灭菌离心管中，加入500µL消化液和10µL蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中过夜。

2.4.2.5阴性对照处理

取灭菌双蒸水100µL，置1.5mL灭菌离心管中，加入500µL消化液10µl蛋白酶K溶液，混匀后，置55℃水浴中过夜。

2.5DNA模板的提取

2.5.1取出已处理的样品及阴、阳对照，加入600µL酚/氯仿/异戊醇混合液，用力颠倒10次混匀，12000g离心10分钟。

2.5.2取上清置1.5mL灭菌离心管中，加入等体积异丙醇，混匀，置液氮中3分钟。

取出样品管，室温融化，15000rpm离心15分钟。

2.5.3弃上清，沿管壁缓缓滴入1ml70%乙醇，轻轻旋转洗一次后倒掉，将离心管倒扣于吸水纸上1分钟，真空抽干15分钟（以无乙醇味为准）。

2.5.4取出样品管，用50µL灭菌双蒸水溶解沉淀，作为模板备用。

2.6PCR扩增

总体积20µl，取灭菌双蒸水8µl,2.5mmol/LdNTP、8pmol/µL扩增引物、15mmol/L氯化镁、10×PCR缓冲液、0.5单位TaqDNA聚合酶各2µL，2µL模板DNA。

混匀，作好标记，加入矿物油20µL覆盖（有热盖的自动DNA热循环仪不用加矿物油）。

扩增条件为94℃3分钟后，94℃30s，58℃30s，72℃30s循环35次，72℃延伸5分钟。

2.7电泳

将PCR扩增产物15µL混合3µL上样缓冲液，点样于1.5%琼脂糖凝胶孔中，以5V/cm电压于1×TAE缓冲液中电泳，紫外凝胶成像仪下观察结果。

2.8结果判定

在阳性对照出现394bp扩增带、阴性对照无带出现（引物带除外）时，试验结果成立。

被检样品出现394bp扩增带为炭疽杆菌阳性，否则为阴性。

附件2

无害化处理

1炭疽动物尸体处理

应结合远离人们生活、水源等因素考虑，因地制宜，就地焚烧。

如需移动尸体，先用5％福尔马林消毒尸体表面，然后搬运，并将原放置尸地及尸体天然孔出血及渗出物用5%福尔马林浸渍消毒数次，在搬运过程中避免污染沿途路段。

焚烧时将尸体垫起，用油或木柴焚烧，要求燃烧彻底。

无条件进行焚烧处理时，也可按规定进行深埋处理。

2粪肥、垫料、饲料的处理

被污染的粪肥、垫料、饲料等，应混以适量干碎草，在远离建筑物和易燃品处堆积彻底焚烧，然后取样检验，确认无害后，方可用作肥料。

3房屋、厩舍处理

开放式房屋、厩舍可用5%福尔马林喷洒消毒三遍，每次浸渍2小时。

也可用20％漂白粉液喷雾，200mL/m2作用2小时。

对砖墙、土墙、地面污染严重处，在离开易燃品条件下，亦可先用酒精或汽油喷灯地毯式喷烧一遍，然后再用5％福尔马林喷洒消毒三遍。

对可密闭房屋及室内橱柜、用具消毒，可用福尔马林熏蒸。

在室温18℃条件下，对每25～30m3空间，用10％浓甲醛液（内含37％甲醛气体）约4000mL，用电煮锅蒸4小时。

蒸前先将门窗关闭，通风孔隙用高粘胶纸封严，工作人员戴专用防毒面具操作。

密封8～12小时后，打开门窗换气，然后使用。

熏蒸消毒效果测定，可用浸有炭疽弱毒菌芽孢的纸片，放在含组氨酸的琼脂平皿上，待熏后取出置37℃培养24小时，如无细菌生长即认为消毒有效。

也可选择其它消毒液进行喷洒消毒，如4％戊二醛（pH8.0～8.5）2小时浸洗、5％甲醛（约15％福尔马林）2小时、3％H2O22小时或过氧乙酸2小时。

其中，H2O2和过氧乙酸不宜用于有血液存在的环境消毒；过氧乙酸不宜用于金属器械消毒。

4泥浆、粪汤处理

猪、牛等动物死亡污染的泥浆、粪汤，可用20％漂白粉液1份（处理物2份），作用2小时；或甲醛溶液50～100ml/m3比例加入，每天搅拌1～2次，消毒4天，即可撒到野外或田里，或掩埋处理（即作深埋处理）。

5污水处理

按水容量加入甲醛溶液，使其含甲醛液量达到5％，处理10小时；或用3％过氧乙酸处理4小时；或用氯胺或液态氯加入污水，于pH4.0时加入有效氯量为4mg/L，30分钟可杀灭芽孢，一般加氯后作用2小时流放一次。

6土壤处理

炭疽动物倒毙处的土壤消毒，可用5％甲醛溶液500mL/m2消毒三次，每次2小时，间隔1小时。

亦可用氯胺或10％漂白粉乳剂浸渍2小时，处理2次，间隔1小时。

亦可先用酒精或柴油喷灯喷烧污染土地表面，然后再用5％甲醛溶液或漂白粉乳剂浸渍消毒。

7衣物、工具及其它器具处理

耐高温的衣物、工具、器具等可用高压蒸汽灭菌器在121℃高压蒸汽灭菌1小时；不耐高温的器具可用甲醛熏蒸，或用5％甲醛溶液浸渍消毒。

运输工具、家具可用10％漂白粉液或1％过氧乙酸喷雾或擦拭，作用1～2小时。

凡无使用价值的严重污染物品可用火彻底焚毁消毒。

8皮、毛处理

皮毛、猪鬃、马尾的消毒，采用97～98％的环氧乙烷、2％的CO2、1％的十二氟混合液体，加热后输入消毒容器内，经48小时渗透消毒，启开容器换气，检测消毒效果。

但须注意，环氧乙烷的熔点很低（＜0℃），在空气中浓度超过3％，遇明火即易燃烧发生爆炸，必须低温保存运输，使用时应注意安全。

骨、角、蹄在制作肥料或其它原料前，均应彻底消毒。

如采用121℃高压蒸汽灭菌；或5％甲醛溶液浸泡；或用火焚烧。