广州大学小鼠离体细胞培养实验报告.docx

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广州大学小鼠离体细胞培养实验报告

广州大学

综合设计性实验报告

学院生命科学学院

課程细胞生物学实验

实验项目实验六细胞培养

实验题目小白鼠肝细胞的原代培养

专业生物技术

年级、班别14级

姓名陈子禧

学号1414300004

任课教师陈鲲

完成日期2016年5月23日

[摘要]目的掌握小鼠肝细胞、表皮细胞的体外培养方法。

采用脱臼法处死小鼠，用植块培养法（用眼科剪把肝组织剪成小于1mm³大小的植块，接种于培养瓶中进行体外培养；并用单细胞培养法（酶解法）进行肝细胞以及表皮细胞的培养。

通过光镜观察细胞形态结果 成功地培养出肝细胞、表皮细胞。

肝细胞植块组在体外培养一个星期仍能够保持良好的生长状态。

结论 本实验成功地实现了肝细胞的体外培养方法，尤其在植块培养组中效果更为明显。

关键词原代培养小白鼠植块培养酶解法肝细胞表皮细胞

1前言

2实验原理

3实验用品

3.1试剂

3.1.1培养液

3.1.2Hank液

3.2仪器

3.3材料

4实验方法

4.1前期消毒灭菌

4.2实验步骤

5实验结果

5.1.图片展示

5.2.结果分析

5.3结果汇总

6结果分析与讨论

7参考文献

8致谢

1前言

目的了解肝细胞、表皮细胞原代细胞培养的基本方法及操作过程。

学习植块培养法、单细胞培养法（酶解法）、营养液的配制及酸碱度的调节。

初步掌握无菌操作方法。

意义：

细胞培养是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术。

当前，细胞培养技术广泛应用于分子生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学、细胞工程等领域，已发展成为一种重要的生物技术。

［1］方法：

采用肝组织块外植培养法通过无菌造作培养新生小鼠细胞。

结果：

运用这种方法成功地培养出原代肝细胞。

结论：

这种方法为广泛开展肝细胞原代培养奠定了基础。

2实验原理

原代细胞培养是指直接从动物体内获取的细胞、组织或器官，经体外培养后，直到第一次传代为止。

这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出所需的组织（或器官），用植块培养法，在人工培养下，使其不断地生长及繁殖。

细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严谨的实验技术。

在准备过程中我们要是细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：

一.是供给细胞存活所必须的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。

二.严格控制无菌条件。

3实验用品

3.1器材眼科剪（尖头、弯头）各一把、眼科镊（尖头）一把、培养皿一个、试管一支、（直、弯）吸管各一支、刻度吸管一支、吸管胶头三个、小烧杯一个、培养瓶一个等。

上述器材均须彻底清洗、烤干、包装好，9.9×104Pa（15磅）灭菌30min，备用。

此外，还有显微镜、酒精灯、酒精棉球、碘酒棉球、试管架、标记笔、恒温箱。

3.2试剂

3.2.1培养液RPMI-1640（2-3ml/培养瓶）,基础培养基80-90%、胎牛血清10-20%、双抗1-2%,主要提供生长因子和细胞因子。

抗菌素：

1万单位青、链霉素占1%。

3.2.2组织清洗液hanks液、PBS（Phosphate-BufferedSallines）

3.3材料小白鼠幼体2只

4实验方法

4.1前期准备工作

4.1.1对玻璃仪器进行清洗

（1）浸泡：

清水浸泡12小时

（2）刷洗：

清洁剂、毛刷刷洗，清洁剂清洗2次，自来水冲洗5次，烘箱50℃烘干（3）然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。

（4）刷洗、烘干：

12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。

（5）泡酸、清洗：

用清洁液（重铬酸钾120g：

浓硫酸200ml：

蒸馏水1000ml）浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗15次，最后蒸馏水冲洗3-5次和用双蒸水过3次。

（6）烘干、包装：

洗干净后先烘干，加脱脂棉，然后用纸包装。

（7）高压消毒：

包装好的器皿装入高压锅灭菌（8）烘干：

50℃烘箱进行烘干。

4.1.2对器械和无菌操作台进行消毒灭菌物理消毒灭菌法（紫外线：

进行30min照射，用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒的培养器皿；高压蒸气灭菌法：

121℃，20min；干烤：

160℃,2小时）；化学消毒灭菌法（75%酒精：

主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理）；1%新洁尔灭：

主要用于器械的浸泡及皮肤和操作室壁面的擦试消毒；抗生素：

用于培养液灭菌或预防培养物污染，如青霉素、庆大霉素等。

4.2实验步骤

6细胞原代培养

（1）用洗涤剂刷洗双手→自来水冲净→新洁尔灭浸泡→进入无菌操作室。

（2）操作前放入所需器具并进行30minUV灭菌，操作者于超净台内用酒精棉

消毒双手（切记：

严禁将培养液（含有血清、蛋白等）在UV下进行灭菌。

（3）打开试管、吸管胶头包装，将试管插（尽量斜插）入试管架.

（4）取出需用的吸管（直、弯吸管各一支，刻度吸管一支）套上胶头，将试管

插入相应的试管中。

（5）打开培养皿以及解剖工具手持端的包装。

（6）在小组其他成员已打开腹腔的基础上切取小鼠肝脏组织块,并迅速取出肝

脏并将其放入Hanks液中进行漂洗2次.移入小烧杯中。

并同时剪取表皮组织进行Hanks液漂洗2次。

（注意:

整个取材过程中,都要保持肝脏的湿润,随时给肝脏块滴加一些培养液或者平衡盐溶液，防止细胞脱水死亡）

（7）接种与培养过程—植块培养

A将拟培养的肝组织用眼科剪剪成约1mm³大小的植块，用hanks液适当漂洗，弃hanks液，加少量培养液；将表皮组织稍微剪碎后放置胰蛋白酶中酶解3至5min，吸去上清液并立即加入培养液3至4ml，并轻柔吹打得上清液。

B取2培养瓶，在培养瓶的上面做好标志（在瓶侧注明班、组别、姓名、材料名称等信息）。

C用培养液湿润的吸管小心吸取肝脏植块,轻轻吹出到培养瓶的培养瓶面内,按照一定的间隔和形式用弯吸管将植块排列好。

D翻转肝植块组培养瓶（培养面在上方），加入4ml的培养液；直接将表皮细胞组的上清液吸至培养瓶中。

E将培养皿加盖封口,送入37度恒温箱内,静置（加入的培养液不浸泡植块，不从瓶口流出）。

F若干小时后（长短视各人操作而异），待植块充分贴壁后，翻转培养瓶使植块浸于培养液中且不漂浮。

G观察至于37度培养的细胞，需逐日进行观察，主要观察：

（1）培养长与培养液颜色的变化，如培养液变为紫红色，一般细胞生长不好。

可能是瓶塞未盖紧或营养液pH过高。

（3）培养液若变为桔红色，一般表示细胞生长良好。

经过1～2天培养后，若细胞生长情况较差或培养液变红了，则可换一次营养液。

换液时也要注意无菌操作（若经过1～2天培养后,若细胞生长情况较差或培养液变红,则需换液。

酶解法与植块法有所区别，①植块组：

从37摄氏度培养箱中取出培养瓶，于超净工作台内吸去全部旧培养液用平衡盐溶液轻缓漂洗培养物1～2次,弃平衡盐溶液，加入与换液前相同的量的培养液，放回原来的培养箱继续培养②酶解法：

将旧的培养液吸出约1/2再重新加入等量培养液。

每日观察结果用文字记录，换液也需记录，在整个培养过程的不同阶段（最少在前、中、后阶段）置倒置显微镜下观察细胞生长情况并拍照记录。

*备注：

每次取培养瓶时用酒精喷洒手掌及手臂，另外旋紧瓶口取出，再喷洒酒精，由于我们操作严谨，所以直至换液后正常生长期内未出现严重污染。

（中期换液一次）

5实验结果

5.2.结果分析

形态学观察结果 4.11日分离的肝细胞，在培养3h后即能够充分贴壁生长并在第三天已经开始观察到新生组织。

用酶解法处理的表皮细胞，前期生长不够理想但到第10天开始观察到新生细胞。

（1）阶段一：

肝细胞在生长期（24～48h），直至第三天（4.13日），间隔接近48小时，细胞状态较好（如图一所示），且生长的细胞越来越多，细胞开始在植块的边缘生长，形成一圈透明状的新生细胞；

表皮细胞可能由于我们经验不足，酶解时间稍长，需要更多时间进行细胞分裂增殖，故第二天仅能观察到碎屑，（如图二所示），但在第三天开始观察到部分细胞集团，未能肯定地确定是增殖细胞。

（如图三所示）【此观察时期为第一周，第2-3天】

（2）阶段二：

肝细胞生长第七天，已能在超过组织植块的范围下观察到单层生长的肝细胞，且较为明显（如图四所示）；另外表皮细胞能观察到较多碎屑，且夹杂着部分圆形小型影像，推测可能为新生表皮细胞（如图五所示）【此观察时期为第一周，第7天】。

（3）阶段三：

表皮细胞生长的第十一天（图六），表皮细胞已经较为明显，尽管夹杂在细胞碎屑之中但明显能分辨出闪亮、形体较小、而且呈圆形的新生表皮细胞；肝细胞生长第十一天（图七），图七植块周围有少量的细胞贴壁生长，其中有些透明状的是气泡,但明显观察到大量圆形闪亮黄色透明状细胞，中间带有细胞集团，但体积较小，推测可能为碎屑【此观察时期为第二周，第11天】

（4）阶段四：

终止实验停止培养，细胞生长第14天，肝脏植块组周围有雪花状微生物生长，另外表皮细胞组也已经无明显增殖细胞，较多不透光的细胞碎屑出现，故停止实验（如图八所示）。

【此观察时期为第三周，第14天】

5.3结果汇总：

本次实验结果较为成功。

肝细胞在培养第11天观察培养效果最佳，而表皮细胞同样在11天观察到增殖效果。

但植块法在培养时长上比酶解法占优势，增殖速率较快且结果明显便于观察。

其中我们实验共分为三个阶段

阶段一：

第一周，第2-3天（其中进行过一次换液）

本阶段肝细胞已能观察到增殖效果，而表皮细胞仍然停留于原始状态。

阶段二：

第一周，第7天

本阶段肝细胞的增殖效果已经十分明显，能观察到单层的新生细胞。

而表皮细胞的效果并不明显。

阶段三：

第二周，第十一天

肝细胞以及表皮细胞的增殖效果都达到最佳，最易于观察。

阶段四：

肝细胞植块组已经出现微生物污染，表皮细胞有死亡迹象，终止实验。

5.1.图片展示

图一:

第三天（48h）小白鼠肝组织的生长情况图二:

第二天小白鼠表皮细胞的生长情况

图解：

图解

对比第一天接入后观察的植块，植块边缘透光度提高第二天的效果与第一天移入细胞液的效果相似，

在缩小放大倍数和增大光圈后可以观察得更为明显。

无明显细胞分裂增殖效果，移入培养箱继续观察。

所以基本上可以确认有新生肝细胞生成。

（拍摄时间：

2016/4/1316:

30）（拍摄时间：

2016/4/1210:

50）

图三：

第三天小白鼠表皮细胞生长情况图四：

第七天小白鼠肝细胞生长情况

图解：

图解：

出现部分集团状的表皮细胞，如图D1、D2、D3区域。

肝细胞已经较为明显，可以观察到白色圈包括着新生

呈闪亮状态的肝细胞。

（拍摄时间：

2016/4/13）（拍摄时间：

2016/4.17）

图五.第七天小白鼠表皮细胞生长情况图六.第十一天小白鼠表皮细胞生长情况

图解：

图解：

较多碎屑夹杂着部分圆形小型影像，推测为新生表皮细胞表皮细胞已经较为明显，尽管夹杂在细胞碎屑之中但明显能分辨出闪亮、形体较小、而且呈圆形的新生表皮细胞。

（拍摄时间：

2016/4/17）（拍摄时间：

2016/4/21）

图七.第十一天小白鼠肝细胞生长情况图八.第十四天小白鼠表皮细胞生长情况

金黄色透亮的圆形新生肝细胞，为总培养时期中最佳的状态已经生成部分细胞废物，且含大量不透明死亡细胞碎屑。

由此可以判断植块法培养肝脏细胞基本成功。

（拍摄时间：

2016/4/21）（拍摄时间：

2016/4/25）

6结果分析与讨论

本实验用肝组织块外植培养法成功地培养出肝细胞，并利用单细胞培养法（酶解法）成功培养出表皮细胞。

肝细胞植块培养法操作简单、肝组织易于贴壁、生长力好。

这种方法也不需要摸索条件，容易成功且效率高易于观察。

但通过本次实验我们探索到使用这种方法时要注意子组织块应尽量剪切均匀，约1mm³左右。

组织块过大，组织块中央的细胞不能得到充足的营养，不能完全游离出来。

组织块相互距离以0.5cm为宜，在组织块植入的最初1～2天内，需保持绝对静置培养，以利于肝细胞贴壁，避免组织块漂浮。

而酶解法的技术含量和要求较高，尽管实验结果未如理想但仍为成功。

酶解法要求酶解时间和取液量多少的把握程度较高，我们小组未有经验但经过学习和重复操作，通过学习，我们感觉在酶解法中取得的收益更多。

细胞培养是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术，它为细胞学、遗传学、病毒学、免疫学的研究和应用做出了重要贡献。

细胞培养是指从体内组织取出细胞摹拟体内出现环境，在无菌、适当温度及酸碱度和一定营养条件下，生长繁殖，并维持其结构和功能的一种培养技术。

细胞培养的培养物为单个细胞或细胞群。

[2]

所以我们通过本次实验过程能掌握一定的实验技能和操作方法。

以细胞培养作为打基础的手段更好地为以后的生物道路铺垫。

7参考文献

[1]杨汉民.细胞生物学实验.第二版.北京:

高等教育出版社，1997.

[2]甘露,张志辉,吕美娜等.细胞培养技术.中国组织工程研究与临床康复,2008,29（12）:

573-574

8致谢

感谢理论课及实验课指导老师陈鲲给予我们的指导与帮助，同时也对实验员的准备工作和讲解表示感谢。

十分荣幸地能与我的组员吴咏诗、张玮恩、林益坤进行合作，在愉快的分工协作当中感谢我们每一个人的付出。

最后谢谢对我们本次实验给予帮助的所有人。

学生：

陈子禧

2016/5/23