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细菌生物膜技术

“生物膜技术”：

关于微生物膜研究的一项多学科的综述

EstherKarunakaran·JoyMukherjee

BharathiRamalingam·CatherineA.Biggs

摘要人们对生物膜形成的研究不是一个新的现象。

生物膜的普遍存在及其意义和各种形成过程鼓励人在这个领域已经长达四十年的广泛研究。

在这篇评论当中，我们强调来自不同学科的技术。

我们用这些技术已经成功地描述了细胞外、细胞膜以及细胞内部的成分。

这些成分对了解生物膜的形成起着很重要的作用。

为了减少对研究生物膜的复杂性，以前的研究者通常采用带有学科性质的具体方法单独地去研究生物膜的不同组成成分。

最近有些研究主张综合不同的技术对生物膜得到更加全面的认识，但是这种方法一直处于初期阶段。

为了获得对生物膜形成过程全面的认识以及确切地阐述有效的生物膜控制方法，在接下来的十年里研究人员应该意识到对生物膜的研究（换就话说，生物膜技术逐渐形成一门独立学科），以及多学科综合研究在这一领域的重要性。

关键词生物膜生物膜技术细胞外的细胞内的多学科的细胞膜

引言

在自然界，细菌以本身彼此粘连形成的组织或者以细胞膜粘连而形成固着的组织而存在。

这种组织对所处环境的变化能够做出反应以及能够适应环境的变化，或者像多细胞组织一样执行特殊任务（Costertonetal.1999,O’Tooleetal.2000;Hall-StoodleyandStoodley2002）。

细菌的生物膜是指细胞和细胞外界聚合物接界以及细胞彼此之间粘结成的膜结构。

细胞膜是细胞在生长过程中细胞与细胞表面、细胞与细胞之间的联系的介质（DaveyandO’Toole2000,O’Tooleetal.2000）。

细菌聚集是一种彼此之间相互联系的微生物形成一种稳定的多细胞簇现象（Marshall1976）。

因此这中聚合物也能成为生物膜，其表面物质很少被定义（DaveyandO’Toole2000）。

细菌能形成多细胞组织的能力使它们彼此之间相互依附在一起，或者使它们形成一层膜。

而细菌的这种行为在多种学科以及生物技术、环境和医药工程等方面的应用起着重大的作用，这对现代社会既有积极的作用也有消极的作用。

在污水处理过程中不同聚合物的生成是微生物组织的重要应用，如活动的沉淀絮状物（BiggsandLant2000）、好氧型或厌氧型小颗粒（Adavetal.2008;Skiadasetal.2003）。

微生物组织能提高分开治理水污染的效果。

在酿造工艺中，酵母菌组织对整个酿造过程也有着积极的影响（Baueretal.2010）。

生物膜在生物治理技术（Cohen2002）和微生物燃料电池技术（Erableetal.2010）上得到积极的应用。

在这些例子中，聚合物在悬浮液中成功地的生成，或者细菌附着成膜结构使生物膜技术更加具有实用意义。

然而，相反的地，细菌的聚集和生物膜对工业过程和人类的健康都起着决定性的作用。

例如，每年全球与处理生物污染有关的过程工程的花费多达几亿英镑（RiedewaldandSexton2006）以及大约65%的医源性感染与表面附着的微生物有关（Reschetal.2005）。

人们对生物形成的研究不是一种新的现象。

人们对生物膜最早的报告应追溯到80年以前（Henrici1933,Zobell1943）。

人们在40年以前就发现生物膜在环境中普遍存在（Costerton2007）。

因此，自从20世纪70年代开始，人们对生物膜和基于生物膜的技术的兴趣稳定的增加。

实际上，在对特别以生物膜为标题的文章进行搜索中，我们发现从2000年到2010年期间人们已经发表了5100篇文章，并且逐年稳定地上升（见图1）（WebofScience（wok.mimas.ac.uk）ScienceCitationIndexExpanded,accessed15/03/11）。

有几种方法已经被应用于研究细菌细胞与细胞之间、细胞与细胞膜之间的联系。

在这篇评论中，我们强调关键技术（如显微镜学、光谱学、遗传学和蛋白质组学）的应用和从不同的学科（如表面和高分子科学、微生物学、生物化学）中找到能够描述生物膜的细胞外、细胞表面以及细胞内的组成成份。

这样在提高生物膜的研究方面，多学科扮演着重要的角色，提倡把“生物膜技术”本身发展成为一门学科。

尽管在对生物膜的研究中存在着潜在的限制，但是这篇评论还是强调这领域将来有着重于多学科共同研究的潜力。

细胞外的环境是关键：

细胞外面在发生什么事？

形成生物膜的细胞的当前环境中存在稠密的蛋白质，大部分研究都是把了解这些生物膜中的蛋白质之间的联系作为研究的对象。

细胞外聚合物形成占生物膜容量的90%以上的基质并且是是微生物的主要来源（FlemmingandWingender2010）。

虽然EPS的各种成份，如蛋白质、糖类，DNA和膜囊已经被证实（Flemmingetal.2007），由于一组未知的大分子存在于细菌细胞外，EPS被称为细胞的保护伞1992）。

细胞外蛋白质的形成需要消耗大量新陈代谢的产物；因此，EPS的存在对生物膜的形成和维持是至关重要的。

通过细菌附着而产生的EPS确实已经被誉为生物性的标记（Stoodleyetal.2002）；在稳定的基质中生成的EPS成分之间的相互作用机制至今仍是一个丰富的研究领域。

在过去的几十年里，人们承担的研究集中对这些生物聚合物的粘附和粘性特征的了解。

在研究EPS的成分方面，人们使用的分析技术大体上分为两种：

无损技术和从以损坏的生物膜中提取EPS成分技术。

激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）技术是目前应用最普遍、无损伤技术，它是被用来显示生物膜中各种EPS成分的时间分辨堆积。

在应用这项技术中，通过增加荧光探针EPS中的不同成分都能被肉眼识别。

例如使用贴有异硫氰酸盐标签的荧光素对蛋白质的定位，使用荧光增白剂或刀豆凝集素对糖类的定位。

使用蓝色核酸荧光染料标记的核酸通过激光共聚焦扫描显微镜能被显现（formoredetailsofthespecificprobesforeachcom-ponent,pleaserefertoAdavetal.2010）。

激光共聚焦扫描显微镜对人们了解微观领域中生物膜的空间组织和形成过程扮演着重要的角色（Lawrenceetal.2007）。

傅里叶变化红外光谱学是另外一种显示生物膜中EPS成分的时间分辨堆积的无损技术。

在这项技术中，各种与EPS相关的官能团的堆积以及EPS聚合物构象的转变由在总反射系数衰减的晶体上直接生长的生物膜显现出来（Delilleetal.2007;Quilèsetal.2010）。

，也可以由喜欢在像不锈钢或塑料方面表面生长的生物膜显现出来（Pinketal.2005;Boschetal.2006;Cheungetal.2007;Ojedaetal.2008）。

傅里叶变化红外光谱学显微镜有助于对生物膜的微观分析，包括EPS模型。

尽管通过CLMS比通过傅里叶变化红外光谱学反射显微镜更能详细的观测EPS的空间分布，但是FTIR一直能够提供有关EPS中官能团的有用信息，这些官能团在维持生物膜生长起到依附和黏着的作用（Geogheganetal.2008）。

从断裂的生物膜中提取的EPS的傅里叶变化红外光学图谱已经绘制完成（EboigbodinandBiggs2008;Tapiaetal.2009;Liangetal.2010;KarunakaranandBiggs2011）。

将在一节进一步讨论的拉曼光谱和表面增强拉曼光谱的使用已经应用于对EPS模型的分析（Ivlevaetal.2009）。

尽管无损技术在原位显现技术中被使用，更多共同采用的策略是去分析从不可避免蜕变的生物膜中获得的EPS。

从对蛋白质和糖类总量的比色测定以及蛋白质与多糖的数量比计算的结果得出，通常起着支配作用的蛋白质成分导致絮状物和生物膜的稳定而不是糖类（Shengetal.2010）。

详细的生物化学分析显示多糖成分既能包括同聚多糖，例如沙门氏鼠伤寒菌内的细胞质膜（Zogajetal.2001），也能包括充满的杂聚多糖，例如铜绿假单胞菌内的聚阴离子状的藻酸（EvansandLinker1973;Wozniaketal.2003），大肠杆菌内的结肠酸（Daneseetal.2000），黄色葡萄球菌细胞内附着的多糖（Götz2002）。

目前的了解证实含有像二价阳离子（例如Ca2+、Mg2+）的无机物的细胞外多聚物与金属元素之间的作用集中在一个面上，这个面影响絮状物和生物膜的物理性质以及加强了它们的化学稳定性（Biggsetal.2001;Geogheganetal.2008;Körstgensetal.2001）。

生物膜外的蛋白质扮演大量新陈代谢的角色。

人们就生物膜内的蛋白质成分的重要性产生了一个观点，这个观点是EPS基质可能起着有效的外消化系统的作用（FlemmingandWingender2010）。

多糖基质内的胞外酶非流动性的生物化学意义在铜绿假单胞生物膜内的残余硅酸盐中的脂肪酶的保留的案例被证实（Mayeretal.1999）。

生物膜中像肽酶、多糖酶和磷酸酯酶等酶的活性已经被证实。

这些酶提高了周围环境中的营养物质的生物利用率（Romanietal.2008;NeuandLawrence2009）。

蛋白质成分与EPS中的多聚糖之间的相互作用也能具有结构意义，例如，枯草芽孢杆菌生物膜中塔莎的分泌蛋白和胞外多聚糖（Brandaetal.2006）。

通常，人们认为糖结合肽、外援凝集素的产生对生物膜结构的完整性起着重要的作用（NeuandLawrence2009）。

近来致力于对EPS的蛋白成分的详细的生物化学分析的工作也能对研究维持枯草芽孢杆菌生物膜稳定结构的糖结合肽作出一点小贡献（KarunakaranandBiggs2011）。

基质中聚合物之间通过静电引力作用、范德华力相互作用、极性相互作用以及影响生物膜稳定的氢键作的物理作用的概念也已经被旋转粘度计表明（Mayeretal.1999）。

通过称作为聚合物架桥絮凝过程，人们也已经发现EPS分子在克服细菌与其表面之间的静电排斥中扮演着重要的角色。

因此，保证了细菌与其表面坚定的、不可逆的附着（NeuandMarshall1990;KarunakaranandBiggs2011）。

这样研究的结果已经激励人们去研究新的能减少生物黏着的新表面涂层（Yuanetal.2009;Khooetal.2009）。

除了物理化学特性之外，人们已经详细地研究了几种微生物的EPS在基因水平上的生长过程的微控。

例如，枯草芽孢杆菌中构成胞外多聚糖的基质是通过在一个单独的操纵子上编码的基因（eps操纵子）以及一个胞外蛋白塔莎产生的（Kearnsetal.2005）。

参与生产和加工塔莎的胞外聚合物操纵子和基因已经被证实是在几种转录调节剂控制下发挥作用的（Kearnsetal.2005）。

在适当地删除突变体过程中，生物膜形成和成熟的减少可以通过肉眼观察被证实（Kearnsetal.2005）。

最近，EPS产生的转录控制也已经被证实发生在枯草芽孢杆菌中（IrnovandWinkler2010）。

同样，人们一直在研究通过细胞内循环诊断一磷酸盐水平对EPS产生进行控制（JenalandMalone2006）。

一项对枯草芽孢杆菌组成的生物体的胞外蛋白的广泛研究表明多效性调节剂PlcR在调节胞外蛋白的生长过程起着重要作用（Goharetal.2002;Goharetal.2008;Oosthuizenetal.2002）。

最终，人们对生物膜期望的作用，例如对环境消毒（FlemmingandWingender

2010）、不期望的作用，例如表面生物依附和对热交换器壁的隔离，直接与基质成分吸附性有关。

生物膜胞外酶的稳定和集中有助生物膜作为对生物异源物和组织蛋白降解的强大集团的功能（FlemmingandWingender2010）。

另一方面，由生物膜金属蛋白结合而成的不断增加的金属离子对表面的微生物腐蚀起着很大的作用（NeuandLawrence2009）。

EPS聚合物的依数性（Keidingetal.2001）能降解阻碍热量传递的热交换器壁并且能降低工业生产效率（FlemmingandWingender2001）。

尽管对生物膜的外部环境（例如EPS）的研究有来自像显微镜学、光谱学、生物化学、表面科学和遗传学的纳米技术（见图2）并且成功地为研究团体提供了丰富的信息，很少产生限制。

没有意识到提取技术的限制和生物膜中EPS成分的完整恢复存在着挑战。

基质聚合物容易受到细胞新陈代谢的影响，从而能够改变稳固生物膜的物理力。

因此，当用于补充对细菌细胞表面和胞外多聚物的物理作用的了解的时候，对与细胞新陈代谢的增殖相结合的胞外多聚物的研究能够对生物膜中EPS的相互作用、调节和控制有更好集中的了解。

是关于表面吗？

胶质物和生物膜的联合

依附在培养基中的共同体是生物膜的最简单的形式。

因此，对用于生物膜形成的培养基的要求吸引了不少从事多聚物和表面科学研究的人们去研究可能促进或者阻碍生物膜形成的培养基的特性。

类似于胶体粒子的细菌细胞的大表面积与体积之比形成了Derjaguin,Landau,VerweyandOverbeek（DLVO）理论，这个理论支配着胶体粒子粘附成表面并且适用于新型细菌粘附在底层（Bosetal.1999）。

DLVO理论把胶体对表面的依着力解释为长程力作用的的结果，例如静电力的作用和粒子和表面之间的里夫施茨—范德华力（Poortingaetal.2002）。

细菌和胶体的类似突出了描述细菌细胞表面以及在培养基的特征的重要性。

因此，大量使用来自胶体或表面科学的丰富的技术，一些研究组已经发现了与胶体的稳定和依着力有关的细菌细胞的特性。

根据DLVO理论，胶体粒子的稳定性受两个因素的影响：

（1）疏水性，

（2）表面电荷。

用胶体科学的方法去研究细菌依着和生物膜的形成，因此，在这个领域，研究集中在描述细菌细胞表面的这两个特性是不罕见的。

Busscher和Weerkamp（1987）认为在细菌依着方面疏水性能从接触区脱水，能够使脱水的部分直接通过短程作用相互影响（BusscherandWeerkamp1987）。

对干细菌接触角的测量（VanLoosdrechtetal.1987a）是一种决定细菌表面疏水性的常用的方法。

这种方法比用微生物粘附的碳氢化合物的含量测量法（Rosenbergetal.1980）、疏水作用色谱法（RoettgerandLadisch1989）、两相分配试验和使用硫酸铵的盐聚集试验（Rozgonyietal.1985）之类的方法更为常用。

VanLoosdrechtetal.（1987a）报道细胞表面疏水性和细胞对疏水基粘附性之间线性正相关。

VanderMeietal.（1998）也曾用过接触角测量法去研究许多不同种类的细菌的细胞表面脱水性，并且断定表面疏水性对每个菌株是唯一的和依赖于菌株的生长期和生长率。

这个结论表明控制细菌细胞之间的粘附的潜在相互作用力不是常量并且能够改变对生物活性的依赖。

Allisonetal.（1990a,b）也曾发现细胞表面疏水性和生物膜之间的联系，即疏水性的下降导致铜绿假单胞生物膜菌和大肠杆菌生物膜的释放。

VanLoosdrechtetal.（1987b）认识到当细菌的表面电荷也能被包括在粘附模型中，对细菌粘附力的精确预测诗可以做到的。

细菌细胞表面的电荷通常由测量电脉迁移率和推断ζ电位所决定（Wilsonetal.2001;HongandBrown2008），它们是水溶液和接到细菌细胞上流体静电层之间界面的电势（Klodzinskaetal.2010）。

人们已经发现像细胞表面疏水性一样，细胞表面的电荷因不同生长阶段（Eboigbodinetal.2005;Walkeretal.2005）、细胞代谢（HongandBrown2010）以及基因的差异（Eboigbodinetal.2006）的生物活性不同而不同。

细胞表面的电荷的变化决定了细胞聚集的能力（Marshall1976;Rijnaartsetal.1995;Eboigbodinetal.2007）。

采用譬如接触角和电泳迁移迁移的技术能测定细菌群体的平均胶体性质。

然而细菌细胞表面的独特生物成分导致这些胶体性质的原因，这些独特生物成分的反过来能控制导致粘附性的相互作用类型（Marshall1976;Rijnaartsetal.1995;Torimuraetal.1999;Eboigbodinetal.2006;HongandBrown2008;Ojedaetal.2008）。

因此，人们在生物膜研究领域已经取得了使用分析化学技术方面的进展。

例如，使用红外和拉曼光谱学技术（Mukherjeeetal.2011）以及最先进的X射线光电子光谱学技术（Yalaetal.2010）描述相互黏着的生物细胞的表面化学性质。

红外光谱学技术在微生物领域应用了40多年（Heberetal.1952;Norris1959）。

FTIR（傅里叶变换红外光谱学）被广泛应用微生物生态学研究和生物膜研究（如Boschetal.2006;Ojedaetal.2008;Mukherjeeetal.2011）。

如前面提到的，使用FTIR为了生物膜的研究去描述化学官能团的有点是生物膜可以被无损地、直接地、在线地和实时地观察。

由于生物膜代表着一个极其复杂的系统，许多不同的信号产生于胞外聚合物、细胞膜和细胞质的分子振动，它们可以对整体的RTIR光谱也有影响。

RTIR光谱能够显示生物大分子的特征函数以及生物膜样品和它们的浮游生物配对物的比较。

这些浮游生物配对物往往会显示与多糖和蛋白质相关的相关的官能团的变化（SchmittandFlemming1998;Boschetal.2006;Ojedaetal.2008;Mukherjeeetal.2011）。

使用FTIR的主要缺点是样品在分析之前是干燥的。

拉曼光谱学技术也能为样品的的化学成分提供信息，但是必须在水和环境中。

因此，它比FTIR有优势并且从而被广泛地用于生物分析（studyoftissues,biofluidsandbacterialcells）（BeierandBerger2009;Wagneretal.2009;Carmonaetal.1997;Choo-Smithetal.2001）。

拉曼光谱学技术和表面增强拉曼光谱技术的应用已经能够分析水合生物膜样品，包括EPS的成分（HudsonandChumanov2009,Ivlevaetal.2009）以及嵌入在EPS内的微观组织（Andrewsetal.2010;Schwartzetal.2009）。

CLMS与拉曼光谱学的联合使用已经能够对不同种类的自由生长的生物膜的形成进行原位比较（例如，野生型铜绿假单胞菌和它的突变体（Sandtetal.2009））以及能够区分不同种类的生长在生物膜上细菌（例如，血链球菌和突变链球菌之间（Beieretal.2010））CLMS与拉曼光谱学在水合环境下联合使用对描述多种物种生物膜的表面有了很好的保证。

关于细菌细胞表面的分子成分的化学信息能通过在原子级上使用X射线光电子光谱学技术（XPS）获取（Rouxhetetal.1994;vanderMeietal.2000）。

各种原子（例如，碳原子、氧原子、氮原子和磷原子）的组成百分比以及它们在细胞表面的键合环境都通使用XPS分析出来。

一些研究已经集中在将细胞表面成分的原子比例与细菌和酵母菌的细胞表面的物理化学性能联系在一起（Hamadietal.2008;Ahimouetal.2007;vanderMeietal.2000;Amoryetal.1988）。

某些研究已经使用XPS来分析环境样（Pastuszkaetal.2005）本或者分析在改变培养条件的情况下细胞表面的改变（DufrêneandRouxhet1996;Herbenetal.1990）。

上面提及到的研究目前仅仅在浮游细菌上完成，但是对建立理化特性的技术与XPS之间的相关性极为有用，这里用的用的细胞是在分析之需要冻干。

几乎非常少的研究试图将XPS分析与附着成面的浮游细胞的细胞表面物理化学性质联系在一起（Cercaetal.2005;Dufreneetal.1996;Denyeretal.1990;Mozesetal.1989）。

在这些研究中，XPS分析已经可能对细胞表面分子进行识别，包括对初始粘附的表面进行识别。

Cercaetal.（2005）意识到初始粘附与随后生物膜的生长一直不存在相关联系并且断定细胞表面附着的高分子介质可能与介导细胞–细胞的相互作用不同。

同时XPS在识别细胞表面高分子成分的变化方面存在着潜力，将来的研究应该集中在将表面附着细胞和浮游细胞进行比较从而了解生物膜形成过程中的生理变化与细胞表面变化的相关性。

联合分析化学和用于描述细菌描述表面特性的胶体方法的应用已经鼓励多学科的研究活动（见图3）。

然而影响细胞表面的特殊生物分子的细胞内的活动（例如基因表达调节）与导致附着的化学功能团的观察到的变化之间的联系需要将来去调查研究。

就表面蛋白（见下一节）而言，这是值得更多关注的，但是通过特定的化学分析将细胞表面的特殊指纹与导致高分子（它是形成指纹的原因）产生的生物机制连接在一起目前没有看到。

图3

此外，最近Mukherjeeetal.（2011）、Karunakaran和Biggs（2011）已经表明附着细胞与自由浮动细胞的细胞表面特性存在差别。

因此，当推断或预测由生物膜的形成和维持引起的相互作用时，细菌的胶体特性应该进一步把这些变化考虑进去。

细胞内的活动怎样呢？

毕竟它也是生物学过程

在微生物学家的带领下，人们对识别基因和蛋白质生物学的基础环境的适应策略如生物膜形成的广泛研究在近几十年里已经完成。

现在被人们广泛接受的是有生物膜的细胞生理学与自由浮动浮游增长方式的细胞生理学是截然不同的。

基因组测序技术和如通过芯片对基因组进行分析技术的利用性能使得生物膜研究领域超越更多传统的基于显微镜的微生物学并且能够对细胞代谢进行详细的分析。

DNA芯片技术已经被用于识别大肠杆菌生物膜的一些现在比较适用的整个基因表达研究的整个基因表达谱（seeareviewbyWood2009）。

有关铜绿假单胞菌生物膜DNA芯片的研究已经表明少量的基因被差异性表达（Stoodleyetal.2002;

Whiteleyetal.2001）。

对附着、自动聚集以及一些新的基因簇的基因编码倾向于对对生物膜细胞的高度表达或者诱导后过渡到生物膜生长（Schembrietal.2003）。

与基因芯片检测技术平行，转录分析技术已经被用于研究生物膜的形成。

这项技术被用于研究生物膜生成过程中的生理机能、表型、运动、代谢活性