雄性不育图位克隆.docx

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雄性不育图位克隆

（一）立项依据与研究内容：

1、 项目的立项依据

研究意义：

玉米雄性不育利用是提高种子质量的一条有效途径，在玉米的三种主要不育胞质类型中，C型胞质雄性不育具有不育性稳定、易恢复等突出优点在生产上得到了广泛应用，由于C型胞质雄性不育的恢复机理比较复杂，其不育和恢复的分子机理远不如T型和S型雄性不育研究深入，目前仍停留在经典遗传学的恢复机理和基因定位的研究水平上。

恢复基因的克隆及功能分析是阐明细胞质雄性不育恢复分子机理的主要手段，在玉米C型胞质雄性不育的两个主要恢复基因中，恢复基因Rf4可以恢复任何背景的C型不育系，在雄性不育利用过程中具有重要作用，因此对恢复基因Rf4进行克隆和功能分析可以在一定程度上阐明C型胞质雄性不育的恢复机理，为C型胞质雄性不育的利用提供理论基础；同时该研究可以为转座子标签法克隆玉米其它重要基因建立一套有效的技术平台，提高转座子标签法克隆玉米基因的效率。

国内外研究现状及分析：

在农作物重要的农艺性状中，细胞质雄性不育以其特殊的利用价值得到了育种学家和分子生物学家的广泛关注，而细胞质雄性不育及其育性恢复的分子机理则成为了生物学家关注的焦点。

尽管在多数植物中都存在细胞质雄性不育现象，截至目前只有水稻、玉米、拟蓝芥等少数生物的7个恢复基因被克隆（Rf2、Rf-PPR592、Rf1、Rf0、Rf-1、Rf1a、Rf1b）（Cuietal，1996；Bentolilaetal，2002；Kazamaetal，2003；Koizukaetal，2003；Akagietal，2004；Wangetal,2006）；这些恢复基因的克隆对阐明植物不同细胞质雄性不育类型中细胞质基因与核基因相互作用的分子机理起到了重要作用。

玉米是最早利用不育化进行种子生产的作物，目前发现的细胞质雄性不育类型有40余种，可分为C、S和T三种主要不育胞质类型（Becket，1971），S和C型又可以划分为不同的亚群，如C型有CI、CII、CIII三个亚群；其中T型胞质雄性不育的恢复由两对互补基因Rf1、Rf2控制，S型胞质性不育的恢复有一对基因Rf3控制，而C型胞质雄性不育的恢复比较复杂，多数研究认为其育性恢复存在两对重叠基因Rf4、Rf5（陈伟程等，1979；秦泰辰等，1986；汤继华等，2001），分别位于第8和第5染色体上（Sisco,1991；汤继华等，2001）。

我们在研究中发现恢复基因Rf5存在一个显性抑制基因Rf-I，该基因对恢复基因Rf4不具有抑制作用，即恢复基因Rf4可以恢复任何遗传背景的C型不育系，而恢复基因Rf5只能恢复不含抑制基因Rf-I的不育系，因此恢复基因Rf4在C型胞质雄性不育利用中具有重要作用。

随着玉米细胞质雄性不育基础理论和不育化制种技术研究的不断深入，以及我国大型种子企业的形成，玉米不育化制种技术的应用在我国得到迅速的发展。

在玉米的三种主要细胞质雄性不育类型中，目前生产上主要利用C型和S型两种不育胞质，尽管魏建昆等人（1986）报道在我国发现了玉米小斑病C小种，但后来的研究证明报道中的“C小种”只侵染C群的CI亚群，对CII、CIII亚群不存在专化侵染，而C型胞质具有不育性稳定、易恢复等突出优点，在种子生产中得到了广泛应用（李建生，2000）。

由于细胞质基因与核基因相互作用影响雄配子的发育（HansonandBentolila,2004），如果对恢复基因Rf4进行克隆和功能分析，就可以在一定程度上阐明C型胞质雄性不育恢复的分子机理，促进玉米不育化制种技术在生产上的应用。

20世纪90年代以来，分子生物学的发展以及基因组学的研究成果为植物基因的克隆提供了多种不同的策略，植物的许多重要基因如抗病、抗除草剂、抗逆、育性、优质以及植物发育相关的许多基因相继被克隆（www.gramene.org）。

目前基因克隆已成为当前植物学研究的前沿和热点领域，经过20多年的发展，形成了一些有效的植物基因克隆方法，如功能克隆、PCR扩增克隆、转座子或T-DNA标签法、图位克隆以及mRNA差别显示等，其中图位克隆和转座子标签或T-DNA插入是植物基因克隆的常用方法。

由于在玉米的基因组中存在大量的重复序列并且基因组序列分析尚未完成，利用图位克隆玉米基因比较困难，目前转座子标签法是玉米基因克隆的一种有效方法。

转座子的概念是McClintock（1951）在研究玉米籽粒花斑现象的遗传中提出来的，它是指生物染色体上一段可以移动的DNA序列，可从一个基因位点转移到另一个基因位点，当转座子插入到某个功能基因内部或临近位点时，就会使插入位置的基因失活并诱导产生突变型。

由转座子引起的突变可用转座子DNA为探针，从突变株的基因组文库中钓取含该转座子的DNA片断，获得含有部分突变株DNA序列的克隆，然后以该DNA序列为探针，筛选野生型植株的基因组文库，最终得到完整的目标基因（Fedoroffetal，1984）。

自Fedoroff等（1984）首次利用转座子标签从玉米中克隆到Bz1基因以来，利用转座子标签法已经分离出了Hm1、Hm2、A1、Bz2、Kn1、C1、Su1、O2、Rf2等一系列重要的玉米基因。

目前世界范围有8个主要课题组在利用转座子标签进行玉米突变体库的构建和基因克隆工作（http:

//bti.cornell.edu;http:

//mbclserver.rutgers.edu;http:

//choroplast.uoregon.edu;http:

//www.cerealsDB.UK.net/maize.htm;http:

//mtm.cshl.org/;http:

//www.endosperm.org;http:

//gremlin3.zool.iastate.edu/），其中有2个课题组利用Ac/Ds双因子转座子，6个课题组在利用Mu转座子。

Ac/Ds双转座子系统产生的突变体比较稳定，利于突变体的遗传分析和目标基因的分离鉴定，但其发生转座的频率较低，每个基因每世代插入突变的概率为大约10－6左右（Walbot,2000）；其中60％的转座发生Ac/Ds的位点附近（DoonerandBelachew,1989；Greenblatt,1984），并且多数转座发生在Ac/Ds位点的10cM以内，因此Ac/Ds转座子是构建某一特定染色体区段的突变库一种有效方法（Kolkmanetal,2005）。

比较而言，Mu转座子家族在基因组中的拷贝数较高，通常可以达到几十到几百个拷贝，因而发生插入突变的频率相对较高（10-3－10-5），比Ac/Ds系统发生转座的频率大约高100倍左右（Walbot,1992），是一种比较理想的获得目标基因突变体的方法，如Scanlon等（1994）利用Mu转座子获得了63个玉米籽粒发育的突变体，Clark和Sheridan（1991）获得了51胚乳特异的Mu转座子突变体，目前在玉米基因组中已经发现了21819多个玉米不同发育阶段及产量相关性状的Mu转座子突变体（www.maizegdb.org）。

但是在不同背景的玉米材料中均可能存在一定拷贝的Mu转座子，因此在利用Mu转座子标签法克隆玉米基因的过程中存在材料本身背景的影响。

在目前已知的玉米恢复基因中，Roger等（1996）利用Mu转座子插入的方法在123500单株中发现了4株恢复基因Rf1的突变体rf1-m；Cui等（1996）利用Mu转座子插入的方法在178300个单株的群体中获得6株恢复基因Rf2的突变体rf2-m，并从构建的cDNA文库中分离到2.2kbRf2基因的cDNA片段，该cDNA为乙醛脱氢酶基因（ALDH）。

玉米恢复基因Rf2的克隆为玉米其它恢复基因的克隆提供了成功的范例。

由于传统的转座子标签克隆基因的方法程序繁琐且工作量大（Fedoroffetal,1984），因此如何对传统的转座子标签法克隆基因的程序进行改良，减少试验环节，克服材料自身Mu转座子背景的影响，建立一套简单有效的获得突变体及目标基因部分DNA序列的方法，是提高转座子标签克隆基因效率的关键。

在国家十五“863”重大专项的资助下，课题组明确了玉米C型胞质雄性不育的恢复有两对重叠恢复基因Rf4和Rf5控制，发现恢复基因Rf5存在一个显性抑制基因Rf-I，该基因对恢复基因Rf4不具有抑制作用，即恢复基因Rf4可以恢复任何一种遗传背景的C型胞质雄性不育系，在C型胞质不育利用中具有重要作用；转育了我国玉米生产上骨干自交系87-1的Rf4单基因恢复系，实现了豫玉22号不育化制种技术的大规模应用；利用Mu转座子插入的方法获得了恢复基因Rf4的2株突变体rf4-m，确定了恢复基因Rf4插入突变的概率，建立了利用改良AFLP方法获得插入突变体目标侧翼序列的技术体系。

本项目拟通过已有的材料与技术平台对恢复基因Rf4进行克隆，在一定程度上阐明玉米C型胞质雄性不育恢复的分子机理，为C型胞质雄性不育的利用提供理论依据；同时可以根据恢复基因Rf4的序列设计基因内标记，利用分子标记辅助选择的方法进行恢复系的选育，促使C型胞质雄性不育在生产上的应用。

这一工作如果获得资助还将是以前工作的有益延伸和补充。

2、项目的研究内容、研究目标,以及拟解决的关键问题。

研究内容：

根据Mu7转座子材料的基因型与玉米C型胞质雄性不育的恢复系Cms-C87-1（Rf4Rf4）或不育系Cms-C87-1（rf4rf4）进行杂交，通过转座子插入突变筛选恢复基因Rf4的突变体rf4-m；建立转座子插入突变体目标基因特异片断克隆的改良AFLP方法，克隆恢复基因Rf4的侧翼序列；进而通过含有目标基因野生型BAC文库的筛选及亚克隆文库的构建与序列分析，对恢复基因Rf4进行克隆。

（1）转座子插入突变体目标基因侧翼序列克隆技术体系的建立

利用限制性内切酶MspI对Cms-C87-1（Rf4Rf4）、Mu7及rf4-m的植株DNA进行酶切，根据Mu7的序列设计特异引物与AFLP引物相结合，筛选rf4-m特异的AFLP标记，通过对特异扩增片断的克隆及序列分析，获得候选基因Rf4的侧翼序列，建立Mu转座子插入突变体目标基因侧翼序列克隆的技术体系。

（2）玉米C型胞质雄性不育恢复基因Rf4的克隆

根据利用转座子标签获得的候选基因Rf4的侧翼序列设计特异PCR引物，筛选含有恢复基因Rf4的BAC文库，获得含有目标基因的克隆，通过亚克隆文库的构建、筛选及序列分析，对候选基因Rf4进行克隆。

研究目标：

（1）建立玉米转座子插入突变体快速克隆候选基因的技术体系；

（2）克隆玉米C型胞质雄性不育恢复主基因Rf4。

拟解决的关键问题：

在利用Mu转座子插入突变体克隆目标基因的过程中，恢复基因Rf4插入突变体的筛选鉴定以及如何克服材料本身Mu转座子背景的影响，快速获得插入突变体目标基因的侧翼序列是本项目拟解决的关键问题。

3、   拟采取的研究方案及可行性分析

试验方法：

根据Mu7转座子材料中是否含有恢复基因Rf4，以转座子材料Mu7作父本与C型不育胞质的恢复系Cms-C87-1（Rf4Rf4）或不育系Cms-C87-1（rf4rf4）进行杂交，通过田间育性筛选获得恢复基因Rf4的突变体rf4-m；利用玉米细胞质雄性不育的特异细胞质鉴定引物对突变体的细胞质类型进行鉴定，采用改良的AFLP方法筛选rf4-m特异的AFLP标记；通过对rf4-m特异扩增片断的序列分析，获得恢复基因Rf4和Mu7的部分序列，分别设计特定引物对Cms-C87-1（Rf4Rf4）和Mu7转座子进行扩增，对获得的恢复基因Rf4的部分序列进行验证；利用恢复基因Rf4部分序列的PCR引物进行BAC文库的筛选，获得含有目标基因的BAC文库，进一步通过亚克隆文库的构建、筛选及序列分析，对恢复基因Rf4进行克隆。

技术路线及实验手段：

（1）Mu7转座子的基因型鉴定

利用不育胞质背景的恢复系Cms-C87-1（Rf4Rf4）和不育系Cms-C87-1（rf4rf4）作母本分别与Mu7转座子材料杂交，对F1植株进行育性鉴定。

如果杂交组合Cms-C87-1（Rf4Rf4）×Mu7表现可育，而Cms-C87-1（rf4rf4）×Mu7表现不育，证明转座子材料Mu7中不含有恢复基因Rf4，则利用Cms-C87-1（Rf4Rf4）×Mu7进行恢复基因Rf4插入突变体的筛选；如果杂交组合Cms-C87-1（Rf4Rf4）×Mu7表现可育，而Cms-C87-1（rf4rf4）×Mu7同样表现可育，说明转座子Mu7中含有恢复基因Rf4，则利用Cms-C87-1（rf4rf4）×Mu7进行恢复基因Rf4插入突变体的筛选。

（2）恢复基因Rf4突变体rf4-m的筛选与鉴定

根据转座子材料Mu7的基因型，选择恢复系Cms-C87-1（Rf4Rf4）或不育系Cms-C87-1（rf4rf4）作母本与Mu7进行杂交，利用含有Mu7转座子的种子进行田间育性鉴定，在田间筛选不育的突变体，采用玉米细胞质特异引物对不育突变体进行胞质类型的鉴定，获得恢复基因Rf4的突变体rf4-m。

（3）候选基因Rf4的克隆

可行性分析：

（1）试验方法：

转座子标签法是克隆玉米基因的一种有效途径，目前已知的玉米许多重要基因多数是通过转座子标签法获得的，其中玉米T型胞质雄性不育的恢复基因Rf2就是通过Mu转座子标签法进行克隆的。

本项目所选择的性状简单，易于田间鉴定，可以在田间进行大规模的突变体筛选工作，因此该项目在试验方法上是可行的。

（2）试验的关键技术：

AFLP是分子生物学一种常用的技术体系，利用已知基因的部分序列引物与AFLP引物相结合对AFLP方法进行改良，已经克隆了植物抗病基因家族的一系列基因。

课题组根据Mu7转座子的序列引物与AFLP引物相结合，建立玉米转座子插入突变体目标基因侧翼序列克隆的技术体系，可以克服材料本身Mu转座子背景的影响，快速有效的获得插入突变体目标基因的侧翼序列；并利用该方法获得了两个苗期黄叶插入突变体和一个矮秆插入突变的侧翼片断，通过序列分析在玉米数据库中找到了相应基因的全长cDNA。

该项技术体系的建立为恢复基因Rf4的克隆提供了技术保障。

（3）材料：

课题组长期从事玉米C型胞质雄性不育恢复机理的研究工作，鉴定并转育了单基因Rf4的恢复系Cms-C87-1（Rf4Rf4）；从华中农业大学引进了高频转座子材料Mu7，该材料是构建玉米突变体库和基因克隆的一种理想材料，课题组利用该材料已经获得了两个恢复基因Rf4的插入突变体rf4-m。

该项目在试验材料具有资源优势。

（4）研究目标：

本研究的主要研究目的是对恢复基因Rf4进行克隆，课题组在试验材料的准备、试验方法的建立等方面做了大量的前期工作，获得了两株恢复基因Rf4的突变体rf4-m，建立了相应的技术体系，以上工作基础可以保证研究目标的实现。

4、本项目的特色与创新之处。

（1）方法的特色与创新：

本项目建立了一套利用转座子插入突变候选基因克隆的技术体系，与传统转座子标签克隆基因的方法相比，利用改良的AFLP方法可以克服材料自身背景的影响，快速获得目标基因的部分序列，提高试验的效率，降低试验的成本。

该技术体系的建立可以为利用转座子标签法克隆玉米其它重要基因提供一条快速有效的方法。

（2）理论与应用上的特色与创新

由于恢复基因Rf4可以恢复任何一种遗传背景的C型不育系，在玉米不育化技术利用中具有重要作用，恢复基因Rf4的克隆及其功能分析将有助于阐明玉米C型不育细胞质基因和核基因相互作用的分子机理，为玉米C型胞质雄性不育的利用提供理论依据；同时可以根据恢复基因Rf4的序列设计基因内标记，利用分子标记辅助选择提高恢复系的选育效率，加速玉米不育化制种技术的利用进程。

5、年度研究计划及预期研究结果

年度研究计划：

2007年度：

（1）在前期研究的基础上，课题组已经证明转座子材料Mu7中不含有恢复基因Rf4。

因此利用Cms-C87-1（Rf4Rf4）与Mu7杂交，通过对9-10万株含有Mu7转座子的Cms-C87-1（Rf4Rf4）×Mu7的F1代单株进行田间鉴定，再获得5-8个恢复基因Rf4的插入突变体rf4-m，并利用细胞质特异引物进行验证。

（2）利用改良的AFLP标记对Cms-C87-1（Rf4Rf4）、rf4-m、Mu7植株DNA进行筛选，获得不同单株突变体rf4-m特异的AFLP标记。

2008年度：

（1）对不同单株突变体rf4-m特异标记的扩增产物进行克隆及序列分析；同时利用获得的恢复基因Rf4和Mu7的部分序列分别设计引物，通过对Cms-C87-1（Rf4Rf4）和转座子材料Mu7的植株DNA进行扩增，对获得的恢复基因Rf4的部分序列进行验证；

（2）利用恢复基因Rf4的特异引物进行野生型BAC文库的筛选。

2009年度：

（1）恢复基因Rf4亚克隆文库的构建、筛选及序列分析；

（2）对玉米C型胞质雄性不育恢复基因Rf4进行克隆。

预期研究结果：

（1）对玉米C型胞质雄性不育恢复基因Rf4进行克隆；

（2）建立一套转座子标签法快速克隆玉米候选基因的技术体系；

（3）发表论文2－3篇（其中SCI论文1－2篇），培养研究生2－3个。

（二）研究基础与工作条件

1、工作基础

课题组从上个世纪70年代开始从事玉米C型胞质雄性不育基础理论及应用研究，提出C型胞质不育的恢复存在两对重叠基因Rf4、Rf5控制，明确了玉米C型不育小孢子败育的细胞学机理，利用分子标记对恢复基因Rf4和Rf5进行了定位，证明恢复基因Rf5存在一个显性抑制基因Rf-I，该基因对恢复基因Rf4不具有抑制作用，即恢复基因Rf4可以恢复任何一种遗传背景的C型不育系；发现玉米C型胞质雄性不育的恢复在不同核背景下存在一定差异；针对我国出现了玉米小斑病C小种的报道，与河北农科院合作，发现报道的“C小种”只侵染C群的CI亚群，而对CII、CIII亚群不具有专化性侵染作用，解决了玉米C型胞质雄性不育利用的关键难题；筛选出育性稳定、抗病性强、易恢复的Es型不育胞质，选育出不育性稳定的Es胞质综3不育系及强恢复系87-1，成功的实现了豫玉22号的“三系”配套，并在生产上大面积推广应用。

课题组利用Mu7转座子发现了175个玉米不同性状的插入突变体，获得了2个玉米C型胞质雄性不育恢复基因Rf4的插入突变体rf4-m，并利用特定的不育胞质引物对突变体的胞质类型进行了鉴定，证明该材料为核基因发生了插入突变。

同时利用改良的AFLP方法，建立了一套利用转座子标签法快速分离目标基因侧翼序列的技术体系。

课题组为本项目做了以下前期工作：

1）明确了玉米C型胞质雄性不育的恢复机理，证明恢复基因Rf4可以恢复任何一种遗传背景的C型不育系，是C型胞质雄性不育的一个重要恢复基因，在玉米不育化制种具有重要作用；

2）证明了转座子材料Mu7中不含有恢复基因Rf4；

3）证实了恢复基因Rf4的插入突变频率在1×104左右，并获得了2株恢复基因Rf4的插入突变体rf4-m；

4）对现有转座子标签克隆的方法进行了改良，建立了一套利用改良AFLP方法获得插入突变体候选基因侧翼片断的技术体系；