液相色谱法在环境样品检测中的应用.docx
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液相色谱法在环境样品检测中的应用
液相色谱法在环境样品检测中的应用
1、液相色谱法的原理与分类
液相色谱法的分离机理是基于混合物中各组分对两相亲和力的差别。
根据固定相的不同，液相色谱分为液固色谱、液液色谱和键合相色谱。
应用最广的是以硅胶为填料的液固色谱和以微硅胶为基质的键合相色谱。
根据固定相的形式，液相色谱法可以分为柱色谱法、纸色谱法及薄层色谱法。
按吸附力可分为吸附色谱、分配色谱、离子交换色谱和凝胶渗透色谱。
近年来，在液相柱色谱系统中加上高压液流系统，使流动相在高压下快速流动，以提高分离效果，因此出现了高效（又称高压）液相色谱法。
①液固吸附色谱。
高效液相色谱中的一种，是基于物质吸附作用的不同而实现分离。
其固定相是一些具有吸附活性的物质如硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等。
②液液分配色谱法。
基于被测物质在固定相和流动相之间的相对溶解度的差异，通过溶质在两相之间进行分配以实现分离。
根据固定相与流动相的极性不同，分为正相色谱和反相色谱。
前者是用硅胶或极性键合相为固定相，非极性溶剂为流动相；后者是硅胶为基质的烷基键合相为固定相，极性溶剂为流动相，适用于非极性化合物的分离。
③离子交换色谱法。
基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子对离子交换基具有不同的亲和力而实现分离。
薄壳型离子交换树脂柱效高，主要用来分离简单的混合物；多孔性树脂进样容量大，主要用来分离复杂混合物。
④凝胶渗透色谱法。
又称为尺寸排阻色谱法 。
1959年首先用于生物化学领域。
以溶剂为流动相，多孔填料（如多孔硅胶、多孔玻璃）或多孔交联高分子凝胶为分离介质的液相色谱法。
当混合物溶液入凝胶色谱柱后，流经多孔凝胶时，体积比多孔凝胶孔隙大的分子不能渗透到凝胶孔隙里去而从凝胶颗粒间隙中流过，较早地被冲洗出柱外，而小分子可渗透到凝胶孔隙里面去，较晚地被冲洗出来，混合物经过凝胶色谱柱后就按其分子大小顺序先后由柱中流出达到分离的目的。
用凝胶渗透色谱的优点是：
分离不需要梯度冲洗装置；同样大小的柱能接受比通常液相色谱大得多的试样量；试样在柱中稀释少，因而容易检测；组分的保留时间可提供分子尺寸信息；色谱柱寿命长。
它的缺点是：
不能分离分子尺寸相同的混合物，色谱柱的分离度低；峰容量小；可能有其他保留机理起作用时引起干扰。
凝胶渗透色谱法为测定高聚物分子量和分子量分布提供了一个有效的方法，此外还可用来分离齐聚物、单体和聚合物添加剂等。
⑤离子色谱法。
采用柱色谱技术的一种高效液相色谱法，样品展开方式采用洗脱法。
根据不同的分离方式，离子色谱可以分为高效离子色谱、离子排斥色谱和流动相离子色谱3类。
高效离子色谱法使用低容量的离子交换树脂，分离机理主要是离子交换。
离子排斥色谱法用高容量的树脂，分离机理主要是利用离子排斥原理。
流动相离子色谱用不含离子交换基团的多孔树脂，分离机理主要是基于吸附和离子对的形成。
离子色谱仪由淋洗液贮存器、泵、进样阀、分离柱、抑制柱、电导检导器和数据处理单元等组成。
离子色谱仪最重要的部件是分离柱，装有离子交换树脂。
抑制柱是抑制型离子色谱仪的关键部件，其作用是将淋洗液转变成低电导部分，以降低来自淋洗液的背景电导，同时将样品离子转变成其相应的酸或碱，以增加其电导。
分离阴离子，抑制柱填充强酸性阳离子交换树脂；分离阳离子，抑制柱填充强碱性阴离子交换树脂。
检测器分通用型检测器与专用型检测器。
前者如电导检测器，对检测池中所有离子都有响应；后者如紫外-可见分光光度计，对离子具有选择性响应。
离子色谱法具有快速、灵敏、选择性好和同时测定多组分的优点。
尤其对于阴离子的测定，离子色谱的出现是分析化学中的一项突破性的新进展。
离子色谱法主要用于测定各种离子含量，广泛应用于水、纸浆和漂白液、食品分析、生物体液、钢铁和环境分析等各个领域。
高效液相色谱
∙
高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography,HPLC）是指流动相为液体的技术。
早期的液相色谱（经典液相色谱）是将小体积的试液注入色谱柱上部，然后用洗脱液（流动相）洗脱。
这种经典色谱法，流动相依靠自身的重力穿过色谱柱，柱效差（固定相颗粒不能太小），分离时间很长。
实验室最常用的P230高效液相色谱仪
色谱分析法是分析化学中获得广泛应用的一个重要分支，是一个具有强大生命力的分离分析技术。
与经典液相色谱法与气相色谱法比较,高效液相色谱法具有以下优点：
1．分离效能高
2．选择性高
3．检测灵敏度高
4．分析速度快
高效液相色谱-简介
高效液相色谱（highperformanceliquidchromatography,HPLC）是指流动相为液体的技术。
早期的液相色谱（经典液相色谱）是将小体积的试液注入色谱柱上部，然后用洗脱液（流动相）洗脱。
这种经典色谱法，流动相依靠自身的重力穿过色谱柱，柱效差（固定相颗粒不能太小），分离时间很长。
70年代初期发展起来的高效液相色谱法，克服了经典液相色谱法柱效低，分离时间很长的缺点。
成为一种高效、快速的分离技术。
高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9´107Pa）;色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。
高压泵将贮液罐的流动相经进样器送入色谱柱中，然后从检测器的出口流出，这时整个系统就被流动相充满。
当欲分离样品从进样器进入时，流经进样器的流动相将其带入色谱柱中进行分离，分离后不同组分依先后顺序进入检测器，记录仪将进入检测器的信号记录下来，得到液相色谱图。
HPLC流程示意
高效液相色谱-发展历史
1960年代，由于气相色谱对高沸点有机物分析的局限性，为了分离蛋白质、核酸等不易气化的大分子物质，气相色谱的理论和方法被重新引入经典液相色谱。
1960年代末科克兰（Kirkland）、哈伯、荷瓦斯（Horvath）、莆黑斯、里普斯克等人开发了世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。
高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱，提高色谱柱的塔板数，以高压驱动流动相，使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成。
工科学生最常使用的液相色谱的参考书籍
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
在此后的时间里，高效液相色谱成为最为常用的分离和检测手段，在有机化学、生物化学、医学、药物开发与检测、化工、食品科学、环境监测、商检和法检等方面都有广泛的应用。
高效液相色谱同时还极大的刺激了固定相材料、检测技术、数据处理技术以及色谱理论的发展。
1960年代前，使用的填充粒大于100μm，提高柱效面临着困境，后来的研究人员便采用微粒固定相来突破着一瓶颈。
科克兰、荷瓦斯制备成功薄壳型固定相，这种在固定相在玻璃微球表面具有多孔薄壳，实现了高速传质，为高效液相色谱技术的发展奠定了稳固的基础。
随着填料粒径的降低，更高的柱效也得以实现。
1960年代研制出气动放大泵、注射泵及低流量往复式柱塞泵，但后者的脉冲信号很大，难以满足高效液相色谱的要求。
1970年代，往复式双柱塞恒流泵，解决了这一问题。
1970年代后科克兰制备出全多孔球形硅胶，平均粒径只有7μm，具有极好的柱效，并逐渐取代了无定形微粒硅胶。
之后又制造出的键合固定相使柱的稳定性大为提高，多次使用成为可能。
1970年后，适合分离生物大分子的填料又成为研究的热点。
1980年后，改善分离的选择性成为色谱工作者的主要问题，人们越来越认识到改变流动相的组成事提高选择性的关键。
高效液相色谱-特点
1．高压：
液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。
一般可达150～350×105Pa。
2.高速：
流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。
高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h。
3.高效：
近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。
4.高灵敏度：
高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。
如荧光检测器灵敏度可达10-11g。
另外，用样量小，一般几个微升。
5.适应范围宽：
气相色谱法与高效液相色谱法的比较：
气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。
而高效液相色谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样挥发性的限制。
对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75%～80%）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。
据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70～80%。
高效液相色谱-主要类型
1、吸附色谱（AdsorptionChromatography）
2、分配色谱（PartitionChromatography）
3、离子色谱（IonChromatography）
4、体积排阻色谱（SizeExclusionChromatography）
5、亲和色谱（AffinityChromatography）
特点比较
吸附色谱
分配色谱
离子色谱
体积排阻色谱
亲和色谱
固定相
全多孔固体吸附剂
固定液载带在固相基体上
高效微粒离子交换剂
具有不同孔径的多孔性凝胶
多种不同性能的配位体键联在固相基体上
流动相
不同极性有机溶剂
不同极性有机溶剂和水
不同pH值的缓冲溶液
有机溶剂或一定pH值的缓冲溶液
不同pH值的缓冲溶液，可加入改性剂
分离原理
吸附与解吸
溶解与挥发
可逆性的离子交换
多孔凝胶的渗透或过滤
具有锁匙结构络合物的可逆性离解
高效液相色谱-分离原理
根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型：
1．液—液分配色谱法（Liquid-liquidPartitionChromatography）及化学键合相色谱（ChemicallyBondedPhaseChromatography）
流动相和固定相都是液体。
流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。
当试样进入色谱柱，溶质在两相间进行分配。
达到平衡时，服从于下式：
高效液相色谱计算公式
式中，cs—溶质在固定相中浓度；cm--溶质在流动相中的浓度；Vs—固定相的体积；Vm—流动相的体积。
LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留值大；但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。
a.正相液—液分配色谱法（NormalPhaseliquidChromatography）:
流动相的极性小于固定液的极性。
b.反相液—液分配色谱法（ReversePhaseliquidChromatography）:
流动相的极性大于固定液的极性。
c.液—液分配色谱法的缺点：
尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过色谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。
上世纪70年代末发展的化学键合固定相（见后），可克服上述缺点。
现在应用很广泛（70~80%）。
2．液—固色谱法
流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。
这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。
其作用机制是：
当试样进入色谱柱时，溶质分子（X）和溶剂分子（S）对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附（未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S），可表示如下：
XmnSa======XanSm
式中：
Xm--流动相中的溶质分子；Sa--固定相中的溶剂分子；Xa--固定相中的溶质分子；Sm--流动相中的溶剂分子。
当吸附竞争反应达平衡时：
K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]
式中：
K为吸附平衡常数。
[讨论：
K越大，保留值越大。
]
3．离子交换色谱法（Ion-exchangeChromatography）
IEC是以离子交换剂作为固定相。
IEC是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。
以阴离子交换剂为例，其交换过程可表示如下：
X-（溶剂中）（树脂-R4NCl-）===（树脂-R4NX-）Cl-（溶剂中）
当交换达平衡时：
KX=[-R4NX-][Cl-]/[-R4NCl-][X-]
分配系数为：
DX=[-R4NX-]/[X-]=KX[-R4NCl-]/[Cl-]
[讨论：
DX与保留值的关系]
凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。
4．离子对色谱法（IonPairChromatography）
离子对色谱法是将一种（或多种）与溶质分子电荷相反的离子（称为对离子或反离子）加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。
其原理可用下式表示：
X水相Y-水相===XY-有机相
式中：
X水相--流动相中待分离的有机离子（也可是阳离子）；Y-水相--流动相中带相反电荷的离子对（如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等）；XY---形成的离子对化合物。
当达平衡时：
KXY=[XY-]有机相/[X]水相[Y-]水相
离子交换色谱柱
根据定义，分配系数为：
DX=[XY-]有机相/[X]水相=KXY[Y-]水相
[讨论：
DX与保留值的关系]
离子对色谱法（特别是反相）发解决了以往难以分离的混合物的分离问题，诸如酸、碱和离子、非离子混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、生物碱以及药物等分离。
5．离子色谱法（IonChromatography）
用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。
以电导检测器为通用检测器，为消除流动相中强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设置了抑制柱。
试样组分在
离子色谱仪流程示意
分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。
以阴离子交换树脂（R-OH）作固定相，分离阴离子（如Br-）为例。
当待测阴离子Br-随流动相（NaOH）进入色谱柱时，发生如下交换反应（洗脱反应为交换反应的逆过程）：
抑制柱上发生的反应：
R-HNaOH-===R-NaH2O
R-HNaBr-===R-NaHBr-
可见，通过抑制柱将洗脱液转变成了电导值很小的水，消除了本底电导的影响；试样阴离子Br-则被转化成了相应的酸HBr-，可用电导法灵敏的检测。
离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法。
也可用于阳离子分析。
6．空间排阻色谱法（StericExclusionChromatography）
空间排阻色谱法以凝胶（gel）为固定相。
它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。
溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离，而是按分子大小进行分离。
分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。
试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。
在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。
高效液相色谱-固定相
一、液—液色谱法及离子对色谱法固定相
与GLC类似，LLC的固定相也是在担体上涂渍一层固定液构成，或使用化学键合相。
1．担体
所用的担体可分为如下几类：
（1）全多孔型担体：
a.HPLC早期使用的担体与GC类似，是颗粒均匀的多孔球体，如有氧化铝、氧化硅、硅藻土等制成的Φ»100μm全多孔型担体。
其缺点是：
填料的不规则性和较宽的粒度范围会导致填充不易均匀，柱效低；填料孔径分布不一，并存在“裂隙”在填料深孔中形成滞留液体（液坑），溶质分子在深孔中扩散和传质慢，使色谱峰变宽，柱效下降。
担体图示
b.HPLC在20世纪70年代初开始使用Φ〈10μm全多孔型担体，它是由nm级的硅胶微粒堆积而成Φ为5μm或稍大的全多孔小球。
其优点是：
颗粒小而均匀，传质快（距离短），柱效高。
（2）表层多孔型担体（薄壳型微珠担体）：
它是直径为30～40μm的实心核（玻璃微珠），表层上附有一层厚度约为1～2μm多孔表面（多孔硅胶）。
其优点是：
孔穴浅（固定相仅为表面的一薄层），传质速度快，易于填充均匀，柱效高。
其缺点是：
柱子容量低、需要配用高灵敏检测器。
这种担体目前应用较为普遍。
2．固定液
液—液色谱流动相和固定相都是液体，因此要求两相要互不相溶。
在液-液色谱中常用的固定也只有极性不同的几种，如β，β'-氧二丙腈、聚已二醇-400和角鲨烷等。
3．化学键合固定相：
将固定液机械的涂在担体表面上构成的这种固定相，在实际使用时存在不少缺点，20世纪60年末发展起来了一种新型的固定相---化学键合固定相。
即用化学反应的方法通过化学键把有机分子结合到担体表面。
根据在硅胶表面（具有≡Si－OH基团）的化学反应不同，键合固定相可分为：
硅氧碳键型（≡Si－O－C）；硅氧硅碳键型（≡Si－O－Si－C）硅碳键型（≡Si－C）和硅氮键型（≡Si－N）四种类型。
化学键合固定相反应
化学键合固定相具有如下一些特点：
ⅰ.表面没有液坑，比一般液体固定相传质快得多；
ⅱ.无固定液流失，增加了色谱柱的稳定性和寿命；
ⅲ.可以键合不同官能团，能灵活地改变选择性，应用于多种色谱类型及样品的分析；
ⅳ.有利于梯度洗提，也有利于配用灵敏的检测器和馏分的收集。
化学键合固定相应用
二、液－固吸附色谱法固定相
采用的吸附剂有硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等，仍可分为全多孔性和薄壳型两种，其特点如前所述。
硅胶
三、离子交换色谱法固定相
1.薄膜型离子交换树脂:
即以薄壳玻璃珠为担体，在它的表面涂约1%的离子交换树脂而成。
2.离子交换键合固定相:
用化学反应将离子交换基团键合在惰性担体（如微粒硅胶）表面。
树脂类别：
（1）阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）；
（2）阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）。
四、排阻色谱法固定相
1.软质凝胶：
如交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶等，适用于水为流动相，在常压下使用。
2.半硬质凝胶：
如苯乙烯－二乙烯基苯交联共聚凝胶（交联聚苯乙烯凝胶），是应用最多的有机凝胶，适用于非极性有机溶剂。
3.硬质凝胶：
如多孔硅胶、多孔玻璃等，多孔硅胶是用得较多的无机凝胶。
化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。
近年来发展起来的可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。
用它固定相，色谱柱易填充均匀；柱压、流动相流速、pH值或离子强度对分离的影响小，适用于较高流速下操作。
高效液相色谱-流动相
在气相色谱中，载气是惰性的（与组分分子之间的作用力可忽略不计），常用的只有三四种，他们的性质差异也不大，所以要提高柱子的选择性，只要选择合适的固定相即可。
但在液相色谱中，当固定相选定后，流动相的种类、配比能显著的影响分离效果，因此，流动相的选择也非常重要。
选择流动相（又称为：
淋洗液，洗脱剂）时应注意下列几个因素。
（1）流动相纯度：
防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。
（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。
如在液-液色谱中，流动相应与固定液互不相溶，否则，会使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。
（3）对试样要有适宜的溶解度：
试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。
（4）溶剂的粘度小些为好：
否则，会降低试样组分的扩散系数，造成传质速率缓慢，柱效下降。
（5）应与检测器相匹配：
例如，当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。
在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。
例如，采用正相液-液分配分离时：
首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。
也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。
常用溶剂的极性顺序：
水（最大）>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮> 二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油（最小）。
除此之外，在选择溶剂时，溶剂的极性是最重要的依据，有时还需要采用二元或多元组合溶剂作为流动相，以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。
选择时要参阅有关手册，并通过实验确定。
高效液相色谱-高效液相色谱仪
HPLC的出现不过三十多年的时间，但这种分离分析技术的发展十分迅猛，目前应用也十分广泛。
其仪器结构和流程也多种多样。
典型的高效液相色谱仪结构和流程可用下列方框图表示（SeeFig.3-4）。
高效液相色谱仪一般都具备贮液器、高压泵、梯度洗提装置（用双泵）、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。
一起主要组成
1、高压泵
HPLC使用的色谱柱是很细的（1~6mm），所用固定相的粒度也非常小（几μm到几十μm），所以流动相在柱中流动受到的阻力很大，在常压下，流动相流速十分缓慢，柱效低且费时。
为了达到快速、高效分离，必须给流动相施加很大的压力，以加快其在柱中的流动速度。
为此，须用高压泵进行高压输液。
高压、高速是高效液相色谱的特点之一。
HPLC使用的高压泵应满足下列条件：
a.流量恒定，无脉动，并有较大的调节范围（一般为1~10mL/min）；
b.能抗溶剂腐蚀；
往复式柱塞泵
c.有较高的输液压力；对一般分离，60×105Pa的压力就满足了，对高效分离，要求达到150~300×105Pa。
（1）.往复式柱塞泵
当柱塞推入缸体时，泵头出口（上部）的单向阀打开，同时，流动相进入的单向阀（下部）关闭，这时就输出少量的流体。
反之，当柱塞向外拉时，流动相入口的单向阀打开，出口的单向阀同时关闭，一定量的流动相就由其储液器吸入缸体中。
这种泵的特点是不受整个色谱体系中其余部分阻力稍有变化的影响，连续供给恒定体积的流动相。
（2）气动放大泵
气动放大泵
其工作原理是：
压力为p1的低压气体推动大面积（SA）活塞A，则在小面积（SB）活塞B输出压力增大至p2的液体。
压力增大的倍数取决于A和B两活塞的面积比，如果A与B的面积之比为50:
1，则压力为5×Pa的气体就可得到压力为250×Pa的输出液体。
这是一种恒压泵。
2、梯度洗提
类似于GC中的程序升温。
已成为现代高效液相色谱中部缺少的部分。
梯度洗提，就是载液中含有两种（或更多）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果。
梯度洗提可以分为两种：
a.低压梯度（也叫外梯度）：
在常压下，预先按一定程序将两种或多种不同极性的溶剂混合
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