BioRadProteaniefCell中文简易操作手册.docx
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BioRadProteaniefCell中文简易操作手册
PROTEANIEFCell
ReadyPrep2-DStarterKit
中文簡易操作手冊
汎泰儀器有限公司
一.IEFCell規格
輸入電源90–264VAC,47–63Hz
保險絲10A,250V,SLO-BLOW,3ABCeramicBody
電源線3-wire;grounded
電源輸出電壓50–10,000V,1Vincrements
電流0–2.4mA,0.01µAincrements
功率0–24Watts
設定時間00:
01–99:
00hours:
minutesor0–99,999volt-hours
聚焦盤材質Polycarbonate
可使用膠條大小7,11,17,18,24cm
容量12stripspertray
7cm17cm
電極長度64.5mm162mm
可使用膠條長度82.3mm181mm
Peltier平臺
聚焦盤容量一個24cm,18cm,17cm,11cmtray或兩個7cmtrays
溫度範圍10–25°C±0.5°C@max.ambientof30°C
15–25°C±0.5°C@max.ambientof35°C
水合/平衡盤
材質Polystyrene
容量12stripspertray
可容納膠條長度80mmfor7cmtray,186mmfor17cmtray
環境需求Forindooruseonly.
Foruseataltitudesupto2000meters.
Tobeoperatedbetween10°Cand35°Cambient.
Tobeoperatedwithamaximumrelativehumidity
or90%fortemperaturesupto35°C.
用電規範CE,EN61010-1
大小28（W）x30（D）x14（H）cm
重量12.5lb.（5.7kg）
使用介面Controlpanel12keyalpha-numerickeypadwith4soft-keysand
3functionkeys.Graphicsdisplay,4linesx21charactersProgrammableRehydrationandfocusingtime,platformtemperature,parameterscurrentlimitperIPGstrip,voltageandvoltagerampingtypeforeachstep.
VoltageRampingProfilesSlow,LinearorRapidProtocolcapacity3semi-programmable,pre-loadedmethods.10programmablemethodswithuptoten（10）steps.DatacollectionRS232serialportandoptionalthermalprinter
二.基本介紹
IEFCell正面圖
⏹Controlkeys
控制rehydration/Focusing程式開始,暫停及停止
開始
停止
暫停
⏹Alphanumerickeypad
EXIT:
回前一頁或跳出CE:
清除輸入文字
背面圖
FocusingTray（聚焦盤）Rehydration/EquilibrationTray（拋棄式水合盤）
■VotageRamping方法
三.藥品準備及樣品前處理
■ReadyPrep2-DStarterKit（163-2105）內容物
■配製所需Reagent
1.取Nanopurewater6.1ml加入Rehydration/SampleBuffer中形成A瓶
（可搖晃與隔水加熱以加速均勻混合）
2.取A瓶2ml加入E.coliProteinSample中（原有2.7mg）,此時會配置成1.35mg/ml
的Buffer形成B瓶=Sample
■加入聚焦盤的每一個well中所需Sample量
7cmIPGStrip
11cmIPGStrip
17cmIPGStrip
Minimumrehydrationvolume
Rehydrationstriptoagel
Thicknessof0.5mmandgel
Compositionof4%T/3%C
125ul
185ul
300ul
MaximumrehydrationvolumeIncreasedrehydrationvolumeallowsforlagerproteinsampleload,facilitatesentryoflargerprotein,
Andminimizesproteinsolubilityproblems
250ul
365ul
600ul
■準備上機
1.取ddH20先大略沖過FocusingTray,再用拭鏡紙擦乾Tray的每一個well與電極絲
（電極絲尤其要擦乾！
）
2.以7cm為例,取Sample125ul,平均置入FocusingTray的每一個well中,
儘量將sample注入兩邊電極以內的位置
（可將Tray稍微墊高,使注入的溶液可以緊靠每一well的下緣）
3.取Wicks二片，使用二次水潤濕，置於兩個電極上方，小心不要有氣泡產生
（※a.因為E.coliProteinSample已經非常純，故可以省略此步驟
b.放wicks目的：
可吸附雜質及鹽類,避免污染物損壞電極和影響實驗）
（rehydration步驟前放置wicks）
→此為實驗進行過程中，無pause的步驟，
即rehydration步驟（12hr）結束後，機器直接進入Focusing步驟。
直到S4-HoldStep結束。
（rehydration後,於focusing前放入wicks）
→此為實驗過程進行時，有pause的步驟，
即rehydration步驟（12hr）結束後，機器會先pause，
使用者可在此時放入wicks後，再按run，機器才會繼續進行Focusing反應。
直到S4-HoldStep結束。
4.帶上手套,使用兩支原廠專用鑷子,小心夾住膠條兩側,迅速撕去strip膠條上的保護膜,將IPGStripGel之面朝下,緩慢放入FocusingTray中。
（注意事項：
a.使用ReadyPrep2-DStarterKit請選擇pH4-7的strip
b.勿讓手直接碰觸到膠條，因為手溫會影響膠條
c.注意不要有氣泡產生，因為氣泡會影響聚焦的結果
d.請留意Tray&Strip的正負極放置方向）
5.最後取1ml之礦物油，平均加在Strip上，注意一定要完全覆蓋整個Strip，以防止Buffer之蒸發而乾掉燒焦
StripLength7cm11cm17cm
MineralOil1ml1.5ml2.5ml
6.將上蓋蓋好，將tray置於IEFCell上之正確位置（留意正負極擺放位置）。
四、PROTEANIEFCell操作步驟
■預設程式（PresetMethod）
打開IEFCell背部電源,可見到下列畫面,按下預設之程式（PRESETMETHOD）
依指示完成設定，依strip長度，選擇Focuingstep。
（7cm為例）
→↗LinearΔV
→REHYDRATION:
yes
GELLENGTH:
07
→REHYDRATIONSTEP:
active50V
→INSERTPAUSEAFTERREHYDRATIOIN:
NO
→S1250V15min
S24000V
2hr（即2hr後會從250V拉到4000V）
→S34000V
20000VHOURS
（即達到4000V之後，會使S3的時間換算累積到20000V*Hr）
→S4500V/HOLD:
yes
→ENTER#OFGELS:
2
→PRESS
TOSTART
■自行設定方法（NEWMETHOD）
■一般設定方法步驟
R（Rehydration）：
水合反應,Active50V,12hr,目的是將rehydractionbuffer及sample混合
並吸入IPGStrip膠條中
S1（ConditionStep）：
設定250V,15mins,其作用在於移去鹽類離子及污染物
S2（VoltageReagent）：
建議使用線性模式（Linear）將電壓提升到FocusingVoltage
S3-FinalFocusing：
此步驟為真正等電聚焦設定,其設定之設定值如下:
VoltageIPGStrip累積V*hr數值
4000V7cm20000V*hr
8000V11cm40000V*hr
10000V17cm60000~80000V*hr
S4-HoldStep：
設定500V,以避免過度反應
（※當反應完成後即可進行平衡反應以便做2nddimensionSDS-PAGE分析）
■平衡buffer配置&strip平衡
7cmIPGStrip
11cmIPGStrip
17cmIPGStrip
EquilibrationbufferI
2.5ML
4ML
6ML
EquilibrationbufferII
2.5ML
4ML
6ML
1.取13.35ml30%GlycerolSolution加入EquilibrationbufferI瓶中形成C瓶（=BufferI）
2.準備適當之容器，將Strip取出後，先以“背膠面”在濾紙上稍做滴油的動作，再把Strip過ddH2O一至兩次，把底部的水及礦物油使用濾紙大致去除，然後將膠條面朝上放在拋棄式水合盤中，注入C瓶2.5ml之BufferI，於shaker中進行搖晃20分鐘。
（此為平衡一的部分）
3.取13.35ml30%GlycerolSolution與0.5克的Iodoacetamide加入EquilibrationbufferII瓶中形成D瓶（=BufferII）
（※可先取5mlGlycerol加入Iodoacetamide中，溶解後倒入EquilibrationbufferII瓶中，再將剩下的8.35mlGlycerol加入EquilibrationbufferII瓶中）
4.平衡一做好後，將Strip取出，再以“背膠面”在濾紙上滴乾殘餘的BufferI，然後將膠條面朝上放在拋棄式水合盤中的另一個well中，注入D瓶2.5ml之BufferII，再於shaker中進行搖晃20分鐘。
（此為平衡二的部分）
5.完成後將Strip取出，即完成Strip平衡之程序。
再將Strip置於SDS-PAGE膠片上進行2ndDimensionAnalysis。
（若當天不打算進行2nddimension，則IPGstrip可在IEF結束之後，先不必進行平衡反應，而將Strip放在拋棄式水合盤中連同Lid，至於-80℃冰箱中保存。
）
五、2-DSDS-PAGE電泳分析
■鑄膠（7cm使用Mini-PROTEANⅢ;17cm使用PROTEANIIXL,1.5mm）
1.以7cm為例，先將1.5mmSpacerPlates&ShortPlates用酒精擦拭乾淨，
將大、小玻璃置入注膠架時，底部必須在同一平面，再將玻璃架於注膠台上
2.配置10%之SDS-PolyacrylamideGel
7cm17cm
a.取一支50c.c.離心管
b.加入30%Acrylamide/Bis29:
1Solution（161-0156）6.7ml39.6ml
c.加入1.5M（pH=8.8）之Tris-HCl（161-0798）5.0ml30ml
d.加入10%SDSsolution（161-0416）0.2ml1.2ml
e.加入10%APSsolution（161-0700）0.2ml1.2ml
f.加入TEMEDsolution（161-0800）0.008ml0.048ml
g.加入ddH2O加水到所需量加水到所需量
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2片Gel共計溶液20ml120ml
3.將溶液加入大、小玻璃夾縫中，Load入的溶液高度約從玻璃上緣算起0.5-1.0cm，
於上層加入75or95%之酒精壓平（若不使用酒精，亦可放置1.5mmPrep/2-DComb），
小心不要有氣泡產生（若需加入標準品可在一小濾紙上滴上standard，同樣放入Gel上即可）
4.大約等待1-3hr後，膠片即凝結完成，再往下進行電泳部分。
（可放至4℃冰箱中幫助凝膠）
■跑電泳（RunSDS-PAGE）
1.先將OverlayAgarose（此為lowmelting）用微波爐預熱使其溶化，置於一旁冷卻後，稍後可以封膠使用。
2.gel凝結後，先將酒精層倒出來並儘量以拭鏡紙吸乾，再換水層加入該空隙中，（此步驟是為了讓strip放入玻璃片時能夠迅速滑到定位）。
3.將Strip”膠面朝前”小心放入膠片之上緣空隙中，使其與gel面接觸，此時要特別小心：
strip與gel的接觸面處絕對不可以有氣泡產生，然後將水層倒出來。
4.再取一些溶化好的LowmeltingAgarose加滿整片膠片的上緣，即完成封膠之步驟，等到Agarose凝固後，strip也固定不再移動，方可跑電泳。
（可放至4℃冰箱中幫助Agarose凝固）
5.跑膠用之緩衝溶液為1X之Tris/Glycine/SDS之RunningBuffer（可使用10X之Tris/Glycine/SDS161-0732做10倍稀釋），加入電泳槽內之緩衝溶液原則上外部Buffer量要超過膠片玻璃之下緣三分之一，而上層Buffer量要蓋過白金絲之高度。
6.蓋上電泳槽上蓋，插上電源，固定電壓100V跑90分鐘即完成SDS-PAGE之程序。
（17cm設定條件：
16mA/gelfor30min,then24mA/gelfor~5hr）
7.完成後，要小心取下膠片〈可於水中完成此動作〉，然後將膠片置於容器中，即可準備進行染色之動作。
■染色與退染（Stain&Destain）
方法
（一）
1.將膠片置於適當之容器中，倒入CoomassieBrilliantBlueR-250Stain的溶液，
量的多寡以蓋過整個膠片為主。
2.染色進行約30分鐘。
（依照當時的染劑新鮮程度來稍做調整）
3.染色後，將膠片取出，置於退染之溶液中（50%水+10%AceticAcid+40%Methanol），
退染至肉眼可見膠片之結果為主。
方法
（二）
1.將膠片置於適當之容器中，倒入Bio-RadBio-SafeCoomassieStain的溶液，
量的多寡以蓋過整個膠片為主。
2.染色進行約30分鐘（依照當時的染劑新鮮程度來稍做調整）
3.染色後，將膠片取出，直接置於水中做退染的動作，退染至肉眼可見膠片之結果為主，
約2-3小時後可以看到結果。
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※依照以上之步驟，即可完成2-DGel之膠體實驗，而後可依個人之後續研究以及運用，搭配其他儀器或方法，作更詳細之實驗步驟。
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六、故障排除與附件
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