啤酒酵母选育.docx

啤酒酵母选育.docx

《啤酒酵母选育.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《啤酒酵母选育.docx（9页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

啤酒酵母选育

啤酒酵母选育项目

紫外诱变及其突变株的性能测试

1材料与方法

1.1材料

菌种：

四铃啤酒酵母

仪器：

分光光度计、恒温振荡器、水浴锅、离心机、显微镜、蒸馏装置、分析天平。

培养基：

麦芽汁培养基，麦芽汁固体培养基。

（麦芽汁由四铃啤酒厂提供）

1.2试验方法

1.2.1酵母菌的活化

取菌种接种至装有麦芽汁液体培养基的锥形瓶130r/min振荡培养，于28℃恒温培养箱培养14h，得到正常生长阶段的酿酒酵母菌悬液。

然后接种于斜面麦芽汁固体培养基上，采用28℃恒温培养14h，得到完全活化的正常生长的酵母菌。

1.2.2酿酒酵母菌对数生长期的测定

1.2.2.1菌悬液的制备

取1OmL菌液离心收集菌体，洗涤2次后，菌体悬浮于1OmL生理盐水中，制得菌悬液。

取活化的菌悬液各1mL接种于36支含9mL的麦芽汁液体培养基中，摇匀，130r/min振荡培养，每隔2h取试管3个，放入冰箱，全部培养结束用722型分光光度计于波长600nm处测各管菌液的吸光度值，以空白的麦芽汁培养液为对比，根据所得数据做出酿酒酵母菌的生长曲线。

（此图视为参考）

1.2.3紫外线诱变试验

用麦芽汁液体培养基将处于对数生长期的菌悬液稀释，使菌种的浓度达到lx106个／mL。

（此处菌悬液浓度的确定采用三种方法：

1.显微镜直接计数法;2.平板菌落计数法；3.光电比浊计数法）

备注：

平板直接计数法：

如果过少菌液不易涂布开，过多则在涂布完后或在培养时菌液仍会在平板表面流动，不易形成单菌落，且培养周期长，耗时多，工作量大，但是也是我们的强项，可以锻炼大一的动手能力。

2：

显微镜直接计数法：

比较直观，我们可以直接显微观察，多人工作计数。

耗时较短，且工作量较小，并且我系其他实验组采用此方法计数，可供参考。

3：

光电比浊法：

虽然绘制标准曲线要求较高，但是工作量较小，且一次绘制好标准曲线好后，以后可以用，准确率较高。

比较三种方法，我倾向于第一种和第三种，二者相比较，可以校正方案。

实验步骤：

打开30W紫外灯预热30min，使其功率达到稳定。

1取斜面菌苔一环于2OmL麦汁中混匀，28℃活化培养14h。

2取4mL培养液以3000r/min的速度离心15min，弃上清液加入4mL生理盐水洗涤，在电磁振荡仪上震荡10min左右，重复2次，制成5mL悬液，用血球计数板在显微镜下直接计数，调整细胞浓度。

3取诱变前的1mL菌悬液进行适当稀释，分离出3个合适的稀释度倾注琼脂平板，约为10-3、10-4、10-5，每一个梯度3个平板，每一个平板加0.2mL菌液，进行培养后平板计数法，作为对照。

4取菌悬液5mL移入无菌培养皿中，加入一无菌磁力转子，置于磁力搅拌器上。

530W紫外灯下30cm处照射，调整照射时间。

本次预设为0，30，45，60，90，120，180，600.（单位s）

6取一定稀释梯度的紫外照射菌液0.1（视具体情况而定）用无菌涂布棒涂布均匀，每组做三个平行线培养记录菌落数，计算各照射时间下的致死率。

（选在75%-80%）。

致死率=未经照射菌落数-紫外照射菌落数

未经紫外照射菌落数

7挑取平板上生长迅速菌落比较大的菌株进行斜面培养，然后重复1-5，再重复第5步，挑取平板上生长迅速、菌落比较大的菌株进行斜面培养，连续进行5次，

28℃培养20h左右，计算其突变率和致死率。

（上述时间等数字视为参考数值）

1.2.3.1初筛

诱变后挑选在麦芽汁固体培养基上生长良好，菌落呈中等大小、乳白色、表面光滑和边缘整齐的菌落移接斜面供复筛。

1.2.3.2复筛

供复筛的菌株进行500ml三角瓶低温发酵，测定发酵液中的双乙酰含量并以此作为复筛的标准。

同时测定发酵液中双乙酰含量最低的几株酵母的其它性能。

双乙酰含量测定：

初筛获得的菌株经500ml三角瓶内装300ml120Bx麦芽汁发酵8d后，测定发酵液中的双乙酰含量，选择发酵液中双乙酰含量低的菌株进行二次发酵，将双乙酰含量明显降低的4株菌分别编号为FB-E1、FB-E2、FB-E3和FB-E4。

结果见表1

表1发酵液中双乙酰含量的比较

菌株FBFB-E1FB-E2FB-E3FB-E4

双乙酰含量（mg/L）0.12330.07060.09260.07760.0870

降低率（%）042.724.937.129.4

（此处绘制表格样式视为参考）

双乙酰代谢的控制：

1.降低前驱物质α-乙酰乳酸的生产量

措施：

改良酵母菌种

提高麦汁中α-氨基氮含量，可以抑制合成酶的活性

2加速双乙酰的还原

措施：

提高酵母的细胞密度（增大酵母菌的接种量）

提高还原温度（封罐后高温还原）

限制后期酵母的出芽率（封罐）

国标中对于啤酒中双乙酰的量的要求

二级啤酒：

0.2mg/L一级啤酒：

0.13mg/L

方法：

国标GB4927-2001检测

培养条件：

恒温12度发酵栓培养8d后检测发酵液中双乙酰的含量。

原理：

双乙酰的测定方法采用比色法。

邻苯二胺比色法是连二酮类都能发生显色反应的方法，所以，此法测得之值为双乙酰与戊二酮的总量，结果偏高。

但此法快速简便。

用蒸汽将双乙酰从样品中蒸馏出来，加邻苯二胺，形成2，3—二甲基喹喔琳，其盐酸盐在335nm波长下有一最大吸收峰，可进行定量测定。

1仪器：

带有加热套管的双乙酰蒸馏器，蒸汽发生瓶（2000mL或3000mL）或者锥形瓶，平底烧瓶，容量瓶25mL

2试剂和溶液

盐酸溶液（4moL/L），邻苯二铵溶液：

10g/L（称取邻苯二铵0.1g用盐酸溶液溶解并定容至10mL摇匀，放于阴暗处，注意此溶液即用即配）

消泡剂

3实验步骤

（1）把双乙酰蒸馏器安装好，把夹套蒸馏器下端的排气夹子打开。

（2）将内装2.5mL蒸馏水的容量瓶（或量筒）放于冷凝器下，使出口尖端浸没在水面下，外加冰水冷却。

（3）加热蒸汽发生器至沸，通汽加热夹套，备用。

（4）于100mL量筒中加入2~4滴消泡剂，再注入5℃左右未除气啤酒100mL。

（5）待夹套蒸馏器下端冒大汽时，打开进样口瓶塞，将啤酒迅速注入蒸馏器内，再用约10mL蒸馏水冲洗量筒，同时倒入，迅速盖好进样口塞子，用水封口。

（6）待夹套蒸馏器下端再次冒大汽时，将排气夹子夹住，开始蒸馏，到馏出液接近25mL时取下容量瓶，用水定容至25mL，摇匀（蒸馏应在3分钟内完成）。

（7）分别吸取馏出液10mL于两支比色管中。

一管作为样品管加入0.5mL邻苯二胺溶液，另一管不加作空白，充分摇匀后，同时置于暗处放置20-30分钟，然后于样品管中加2mL4N盐酸溶液，于空白管中加2.5mL4N盐酸溶掖，混匀。

（8）在335nm波长处，用1cm比色皿以空白作对照测定样品吸光度。

（9）计算：

双乙酰（mg／L）＝A335×2.4（用20mm石英比色皿时，吸光度与双乙酰的换算系数）

注：

若用20mm的石英比色皿则换算系数则为1.2

1.2.4不同菌株的发酵性能测试（CO2失重法）

将发酵摇瓶置于26度恒温环境中，每天称重1次（直至日失重小于0.5g为止），因每瓶用于发酵的麦芽汁体积相同，所以只需计算发酵后单位时间内CO2的释放量，发酵6d，以CO2产生量为纵坐标，发酵时间为横坐标，绘制C02产生量曲线。

1.2.6不同菌株发酵发酵液中残留总糖含量测定

从8个发酵后的发酵瓶中各取0.2mL发酵液并稀释500倍，用硫酸-苯酚法测定发酵液中残留总糖的含量。

附录：

硫酸-苯酚法

1）葡萄糖标准液的配制

准确称取干燥恒重的葡萄糖20mg，蒸馏水准确定容500mL得到0.04mg/L的葡萄糖液。

2）试剂

1）浓硫酸：

分析纯，95.5%

2）80%苯酚：

80克苯酚（分析纯重蒸馏试剂）加20克水使之溶解，可置冰箱中避光长期储存。

3）6%苯酚：

临用前以80%苯酚配制。

（每次测定均需现配）

4）15%三氯乙酸（15%TCA）：

15克TCA加85克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

5）5%三氯乙酸（5%TCA）：

25克TCA加475克水使之溶解，可置冰箱中长期储存。

6）6mol/L氢氧化钠：

120克分析纯氢氧化钠溶于500ml水。

7）6mol/L盐酸

表1标准曲线的制作步骤

管号012345678

葡萄糖0.00.40.60.81.01.21.41.61.8

蒸馏水2.01.61.41.21.00.80.60.40.2

苯酚液1.01.01.01.01.01.01.01.01.0

浓硫酸5.05.05.05.05.05.05.05.05.0

取8支干净的具塞试管按表2方法操作,摇匀后放置5min,置沸水浴中加热15min,取出迅速冷却至室温,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处测定吸光度。

以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。

1．制作标准曲线：

准确称取标准葡聚糖（或葡萄糖）20mg于500ml容量瓶中，加水至刻度，分别吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8,各以蒸馏水补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却，室温放置20分钟以后于490nm测光密度，以2.0ml水按同样显色操作为空白，横坐标为多糖微克数，纵坐标为光密度值，得标准曲线。

2．样品含量测定：

①取样品1克（湿样）加1mL15%TCA（三氯醋酸）溶液研磨，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液于10毫升离心管中，再加少许5％TCA溶液研磨，倒上清液，重复3次。

最后一次将残渣一起到入离心管。

注意：

总的溶液不要超出10毫升。

（既不要超出离心管的容量）。

②离心，转速3000转/分钟，共三次。

第一次15分钟，取上清液。

后两次各5分钟取上清液到25毫升锥形比色管中。

最后滤液保持18毫升左右。

③水浴，在向比色管中加入2毫升6mol/L盐酸之后摇匀，在96℃水浴锅中水浴2小时。

④定容取样。

水浴后，用流水冷却后加入2毫升6mol/L氢氧化钠摇匀。

定容至25毫升的容量瓶中。

吸取0.2ml的样品液，以蒸馏补至2.0ml，然后加入6%苯酚1.0ml及浓硫酸5.0ml,摇匀冷却室温放置20分钟以后于490nm测光密度。

每次测定取双样对照。

以标准曲线计算多糖含量。

1.2.7不同菌株产酒精能力（酒精度）测试

快速氧化法

乙醇在酸性条件下,经过量的、一定浓度的重铬酸钾作用，氧化生成醋酸。

再将剩余的的重铬酸钾经硫代硫酸钠还原。

由反应过程中，通过消耗的硫代硫酸钠的量计算酒精含量。

试剂：

重铬酸钾溶液、硝酸溶液、碱性碘化钾溶液、淀粉溶液、硫代硫酸钠标准溶液

方法：

在蒸馏器的接收瓶中，加入10.00ml重铬酸钾溶液和25ml硝酸溶液。

并将空气冷凝器的出口插入此溶液中。

在蒸馏瓶中加入12ml水和1.00ml试样。

接好装置，迅速加热至沸，并继续煮沸3分钟，蒸馏即告完成。

在接受瓶中，加入300ml水、10ml碱性碘化钾溶液及10ml淀粉溶液，在电磁搅拌器搅拌下，用硫代硫酸钠标准溶液滴定至淡青色的淀粉终点。

通过如下公式计算酒精含量。

酒精（%，V/V）=（20.00-0.6575V）/Vs

式中V——硫代硫酸钠标准溶液滴定量

Vs——试样取样量

方法二：

2.2蒸馏—密度瓶法

2.2.1仪器

全玻璃蒸馏器（500mL）、恒温水浴（精度±0.1℃）、容量瓶（100mL）、移液管（100ml）分析天平（感量0.1mg）、天平（感量0.1g）、25ml附温度计密度瓶

2.2.2操作方法

用100mL容量瓶准确量取试样100ml，置于蒸馏瓶中，用50ml水分三次冲洗容量瓶，洗液并入蒸馏瓶中，加玻璃珠数粒，装上蛇型冷凝管，用原100ml容量瓶接收馏出液（外加冰浴）,缓缓加热蒸馏，收集约96ml馏出液（蒸馏应在30-60分钟内完成），取下容量瓶，调温到20℃，补水定容，混匀。

用25mL附温度计密度瓶测试样馏出液20℃的相对密度，根据相对密度查表，得到试样馏出液的酒精度（%，V/V），即为试样的酒精度。

2.3蒸馏装置

2.3.2试剂

重铬酸钾溶液、优级纯无水乙醇

2.4操作方法

2.4.1标准曲线的制备

吸取1ml无水乙醇于100ml容量瓶中，稀释至刻度，混匀。

分别吸取此稀释液0、1、2、3、4、5、6、7ml于50ml容量瓶中，各加15.0ml重铬酸钾溶液，加水至刻度，混匀。

此标准系列相当于试样中含有0.0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00（V/V）的酒精。

以空白标准作参比，在波长610nm，用1cm比色皿测定其余各标准的吸光度。

用吸光度对酒精浓度作图，绘标准曲线。