rAAV2-hEPO实验流程描述.doc

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rAAV2-hEPO包装实验流程简述

一、载体细胞株的建立

按GIBCO/BRL产品说明书提供的方法,用Lipofectamine2000将pSNAV-hEPO质粒转染六孔板中的BHK-21细胞，24h后,用800μg/mLG418选择培养。

待抗性克隆生长至孔底面积的二分之一左右时，用胰酶消化，继续用G418选择培养直至细胞长满，传代后换用不含G418的培养液。

将此混合细胞株命名为BHK/-hEPO。

二、rAAV2-hEPO的大规模制备

将rAAV2-hEPO的生产细胞株用转瓶（110mm×480mm,Wheaton公司产品）培养，细胞长满后（约为8×108个细胞）用HSV1-rc/DUL2感染（MOI为0.1）。

待48h细胞完全病变、容易脱落时，盖紧瓶盖剧烈振摇，将瓶壁上的细胞全部洗脱至培养液中，估算其体积，分装至500mL的三角烧瓶中，250mL/瓶，用于下一步纯化。

三、rAAV2-hEPO的纯化及纯度检测

纯化的步骤参见文献[1]。

总回收率=终产物的病毒颗粒数/起始物的病毒颗粒数。

按文献[2]方法灌制SDS-PAGE分离胶和积层胶,分离胶浓度为10％。

分别按每个加样孔加样15µg。

电泳完毕后用考马斯亮蓝染色，用相应的脱色液脱色直到显出低背景的、清晰的条带。

rAAV2-hEPO纯度的测定采用凝胶扫描图象分析系统进行。

四、rAAV2-hEPO的目的基因的PCR鉴定

取10ul重组rAAV2-hEPO载体病毒样品，煮沸5分钟，冰浴，取1ul作为模板，用特异扩增-hEPO的引物进行PCR鉴定，结果能够特异地扩增出目的基因条带，证明该重组腺相关病毒携带目的外源基因。

五、rAAV2-hEPO的滴度测定

用地高辛标记的CMV探针点杂交方法检测病毒液中rAAV2-hEPO的物理滴度（以病毒基因组数/mL，vg/ml表示）[3]。

将质粒pSNAV-hEPO准确定量，用稀释缓冲液以一系列稀释度稀释后点到尼龙膜上；待测的病毒液rAAV2-hEPO样品用DNaseI和RNase（终浓度均为1μg/mL）于37℃消化1h。

参照文献[3]提取rAAV2DNA,沸水浴5min变性之后置于冰浴中。

用试剂盒提供的稀释缓冲液以一定比列做系列稀释后点膜。

预杂交、杂交、洗膜、显色按BoehringerMannheim公司试剂盒说明书进行。

通过计算pSNAV-hEPO的拷贝数、再乘以与其杂交信号强度一致的病毒液样品的稀释倍数而得出rAAV2-hEPO的物理滴度。

参考文献：

1、吴小兵,董小岩,伍志坚,屈建国,侯云德.一种快速高效分离和纯化重组腺病毒伴随病毒载体的方法.科学通报.2000，45（19）：

2071-2075

2、J.萨姆布鲁克,E.F.弗里奇,T.曼尼阿蒂斯著.金冬雁,黎孟枫,译.分子克隆实验指南.北京:

科学出版社,1992

3、SynderRO,XiaoX,SamulskiRJ.Productionofrecombinantadeno-associatedviralvectors.In:

DracopoliN（ed）.CurrentProtocolsinHumanGenetics.JohnWiley:

NewYork,1996.12.1.1-12.1.20.

附件:

病毒滴度测定（以rAAV2/CMV-hFIX为例说明）

用DNA斑点杂交法，该法为目前通用的AAV滴度测定方法，以携带hFIX的质粒pSNAV1/CMV-hFIX定量后作为阳性来测定滴度。

实验条件：

杂交反应参照Roche公司地高辛DNA标记和检测试剂盒（Cat.No.1093657）说明书,有所改动。

1探针标记

1.1PCR方法探针标记

以pSNAV1/CMV-hFIX质粒DNA为模板，10×dNTP的组成为：

1mMdATP,1mMdGTP,1mMdCTP,0.65mMdTTP,0.35mMDIG-11-dUTP。

上游引物：

5’-TGAAGCYGCAGACACTCAGG-3’

下游引物：

5’-CTCTCCCAACACCATCACCT-3’

反应体系：

10×Buffer5µl

10×dNTP1µl

上游引物1µl

下游引物：

1µl

Taq酶班1µl

pSNAV-1/CMV-hFIX质粒DNA100ng

补ddH2O至总体积为50µl

反应条件

94℃，300s；

94℃，30s；58℃，60s；72℃，60s；--30cycles

72℃，300s。

1.2探针的回收

向50μlPCR反应溶液中加入5μl4mol/LLiCl和150μl预冷的无水乙醇，置于-70℃30min或-20℃2h。

于4℃以12000rpm离心10min，沉淀用70%乙醇洗涤。

DNA探针用20μlpH8.0的TE缓冲液重悬。

置-20℃保存备用。

2滴度测定样品处理

取待检样品10μl，加入2μl10×DNaseI缓冲液、7μlddH2O、1μlDNaseI，至总体积20μl。

37℃孵育1h。

以去除重组病毒溶液中残留的外源核酸对滴度测定带来的干扰，确保滴度测定中的Probe只与AAV病毒在煮沸后释放的重组DNA进行杂交反应。

3阳性对照质粒的处理

将阳性对照质粒用TE（pH8.0）稀释，使之浓度分别为10.4ng/μl，7.8ng/μl，5.2ng/μl，2.6ng/μl，1.3ng/μl，0.65ng/μl。

4将样品和系列稀释的对照质粒于100℃煮沸10min，立即置于冰水中。

5将变性后的样品和系列稀释的对照质粒各取1μl点于尼龙膜上，120℃烤膜30min。

6预杂交按100cm2膜用20～40ml预杂交溶液，预杂交时使溶液处于流动状态。

预杂交液组成：

5×SSC

1%（W/V）封阻试剂（管11）

0.1%（W/V）N-十二烷酰肌氨酸钠

0.02%（W/V）SDS

膜放入塑料袋，灌入预杂交液，排除气体后密封，在68℃预杂交4~5h。

7杂交：

按100cm2膜用10ml杂交液，杂交时偶尔摇动杂交袋，使里面的溶液重新分配。

杂交液组成：

5×SSC

1%（W/V）封阻试剂（管11）

0.1%（W/V）N-十二烷酰肌氨酸钠

0.02%（W/V）SDS

新变性探针DNA（150ng/ml）

杂交液取代预杂交液，替换间膜不能干，成功的替换应是膜与塑料袋间形成一层杂交液膜。

于68℃杂交过夜（16～20h）。

8洗膜：

按100cm2膜用250ml洗膜液计算。

在室温下用2×SSC/0.1%（W/V）SDS溶液漂洗，5min，2次。

在68℃条件下用0.1×SSC/0.1%SDS溶液漂洗，15min，2次。

9免疫测定

9.1配制溶液

缓冲液1：

顺丁烯二酸（100mmol/L）；NaCl（150mmol/L）；pH7.5（20℃）

缓冲液2：

1%（W/V）封阻试剂（管11），配制于缓冲液1中（封阻试剂不会快速溶解,因此应预早1h前配制此溶液，将试剂溶于50～70℃，此溶液保持混浊）。

缓冲液3：

Tris-HCl（100mmol/L）；NaCl（100mmol/L）；pH9.5（20℃）。

缓冲液4：

Tris-HCl（10mmol/l）；EDTA（1mmol/L）；pH8.0（20℃）

显色溶液：

新鲜配制，在10ml缓冲液3中，加45μlNBT溶液（管9）和35μlX-磷酸盐缓冲液（管10）。

9.2显色过程

9.2.1膜在缓冲液1中短暂洗涤（1~5min）。

9.2.2在100ml缓冲液2中保温30min。

9.2.3再用缓冲液1短暂洗涤。

9.2.4用缓冲液2稀释抗体结合物（管8）至150U/L（1:

5000）；稀释后的抗体结合物在4℃只能稳定12h。

9.2.5膜在20ml稀释的抗体结合物溶液中保温30min。

9.2.6用100ml缓冲液1洗膜，以除去未结合的抗体结合物，15min，2次。

9.2.7膜在缓冲液3中平衡2min。

9.2.8.在黑暗条件下，膜与10ml显色溶液放入塑料袋内密封或放入合适的盒子内，几分钟内开始出现颜色,一般显色反应在1天后全部完成。

当颜色显影时，不可振荡或搅拌。

9.2.9当要求的点或带已被检测时，可用50ml缓冲液4洗膜5min以终止反应。

9.2.10拍照。

10rAAV-2/hFIX滴度计算方法

10.1计算质粒（pSNAV-1/CMV-hFIX）的分子量

MW=2×质粒长度（碱基数）×碱基平均分子量

=2×8062（7015+1047）×320

=5.16×106

10.2计算固定质量质粒对应的拷贝数

如8.6ngpSNAV-1/hFIX的拷贝数=8.6×10-9×6.02×1023/5.16×106

=10×108

质粒质量（ng）拷贝数

8.610×108

6.457.5×108

4.35.0×108

2.162.5×108

1.081.25×108

0.540.625×108

10.3根据杂交信号，确定rAAV-2/hFIX滴度。

rAAV-2/CMV-hFIX滴度（v.g./ml）=对应的拷贝数×2×稀释倍数。