乳酸测定方法的初步研究.docx
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乳酸测定方法的初步研究
乳酸测定方法初步研究
摘要
乳酸是重要的生化产品,广泛应用于食品、医药、环保等各领域,目前L-乳酸的主要生产方法为微生物发酵法。
近年来由于其可用于合成可降解塑料——聚乳酸的性质而受到众多的关注,具有广阔的市场前景。
本研究利用薄层色谱、EDTA和对羟基联苯法建立了乳酸的定性定量检测方法,并对实验条件范围进行了研究,结果如下:
1、得到了分离提纯精制L-乳酸的具体参数:
实验分别在55℃、60℃、65℃、70℃四个温度下直接用50%的稀硫酸酸解浓缩的乳酸钙溶液,用0.1%甲基紫溶液作为指示剂对粗L-乳酸进行了精制。
在此范围内均可得到纯度大于90%的乳酸,精制后的乳酸颜色清澈,对精制的乳酸进行第二次分子蒸馏得到了结晶乳酸。
采用分子蒸馏技术精制L-乳酸,在操作压力为0.1Pa,蒸馏温度为70℃效果最好,同时实验发现适宜的蒸馏温度应低于75℃。
2、确定了乳酸的薄层定性分析条件,实验结果表明,定性分析方法效果良好;方法简单,精确度高,显色稳定,重复性好,可应用于乳酸含量的测定。
3、确定了利用EDTA法测定乳酸的可行性。
在消除其他离子干扰的前提下,钙离子可迅速与乙二胺四乙酸二钠反应,以钙—经酸为指示剂,用EDTA标准溶液滴定,溶液成纯蓝色为滴定终点,用滴定消耗的EDTA体积和摩尔浓度可求得乳酸钙的含量。
4、在一定浓度范围内,乳酸含量与565nm处波长吸光度呈线性关系,因此,可以通过测定565nm处的吸光度来测定乳酸的含量。
通过实验证明此方法可行并且快速有效。
5、用DNS法测定残糖含量中。
以葡萄糖的浓度Y(mg/ml)对540nm分光光度值,进行线性回归,其回归方程为Y=1.4163X+0.0255,相关系数为0.9988。
为以后测定发酵液中残糖含量奠定了基础。
关键字:
L-乳酸,精制,测定,分离,含量
目录
前言-2-
第一章文献综述-2-
1.1乳酸的性质-2-
1.1.1乳酸的分子结构-2-
1.1.2乳酸的理化性质-3-
第二章乳酸测定方法研究-3-
2.1引言-3-
2.2发酵液中L-乳酸的分离精制-4-
2.2.1仪器与方法-4-
2.2.1.1仪器及试剂-4-
2.2.1.2实验方法-4-
2.2.1.3结果与讨论-5-
2.3同型、异型乳酸发酵的确定(薄层色谱)-6-
2.3.1仪器与方法-6-
2.3.1.1仪器及试剂-6-
2.3.1.2实验方法-6-
2.3.1.3结果与讨论-7-
2.4乳酸含量测定-8-
2.4.1EDTA滴定法确定乳酸含量仪器与方法-8-
2.4.1.1仪器及试剂-8-
2.4.1.2实验方法-9-
2.4.1.3结果与讨论-9-
2.4.2分光光度法标准曲线确定乳酸含量仪器与方法-9-
2.4.2.1仪器及试剂-9-
2.4.2.2实验方法-10-
2.4.2.3结果与讨论-10-
2.5残糖含量的确定(DNS法)-12-
2.5.1仪器与方法-12-
2.5.1.1仪器及试剂-12-
2.5.1.2实验方法-12-
2.5.1.3结果与讨论-12-
第三章结论-13-
3.1结论-13-
参考文献-13-
致谢-14-
前言
乳酸是重要的生化产品,广泛应用于食品、医药、环保等各领域,目前L-乳酸的主要生产方法为微生物发酵法。
乳酸发酵液的成分复杂,并且因原料和发酵工艺不同而各不相同。
除乳酸外,发酵液中还包括菌体、残糖、蛋白质、色素、胶体、有机杂酸、无机盐等多种杂质,因此从乳酸发酵液中提取乳酸是比较困难的。
要得到精制乳酸就必须对其进行再加工,除去其中含有的有机物杂质。
在国际上食品级的乳酸价格在52美分/磅,而精制的乳酸价格在1美元/磅,两者的价格差很大。
本文围绕上述问题进行了一系列的研究。
首先,进行了细菌乳酸发酵的提纯分离精制的研究,特别是温度对提纯过程的影响,其次,利用薄层色谱法、EDTA法、DNS法、分光光度法进行了对发酵液中乳酸测定研究,为实验室规模分析和制备高纯L-乳酸的工艺的提供了实验和理论依据。
第一章文献综述
1.1乳酸的性质
1.1.1乳酸的分子结构
乳酸,英文名Lacticacid,学名为α-羟基丙酸(α-hydroxypropanoicacid),分子式为C2H5OCOOH,分子量90.08,是一种天然存在的有机酸,广泛存在于人体、动物、植物和微生物中。
乳酸分子内含有一个不对称的C原子,因此具有旋光性,从而具有D-型和L-型两种构型。
L-乳酸为右旋,D-乳酸是左旋的,DL-乳酸为消旋性,其结构式如下:
1.1.2乳酸的理化性质
乳酸异构体的理化性质如表1-1所示:
表1-1乳酸异构体的理化性质
乳酸易与水互溶,很不容易结晶出来。
乳酸浓度达60%以上有很强的吸湿性,商品乳酸通常为60%溶液,药典级的乳酸含量为85.0%~90.0%,食品级的乳酸含量为80%以上。
通常乳酸为无色透明或浅黄色糖浆状的粘性液,几乎无臭或微带有脂肪酸臭,味酸。
与水、乙醇、乙醚、丙二醇、甘油、丙酮混溶,它几乎不溶于氯仿、石油醚、二硫化碳和苯,相对密度1.249,沸点122℃(2KPa),常压沸点190℃。
在67~133Pa的真空条件下反复分馏,可以得到高纯度的乳酸,进而获得单斜晶体的结晶乳酸。
但乳酸属热敏性物质,为保证乳酸无明显的分解,蒸馏温度不能超过130℃。
由于乳酸含有一个羟基和一个羧基,因此它可以参与许多反应。
如氧化反应、还原反应、缩合反应和酯化反应等。
第二章乳酸测定方法研究
2.1引言
乳酸易与水互溶,很不容易结晶出来。
乳酸浓度达60%以上有很强的吸湿性,商品乳酸通常为60%溶液,药典级的乳酸含量为85.0%~90.0%,食品级的乳酸含量为80%以上通常乳酸为无色透明或浅黄色糖浆状的粘性液,几乎无臭或微带有脂肪酸臭,味酸。
与水、乙醇、乙醚、丙二醇、甘油、丙酮混溶,它几乎不溶于氯仿、石油醚、二硫化碳和苯,相对密度1.249,沸点122℃(2KPa),常压沸点190℃。
由于乳酸含有一个羟基和一个羧基,因此它可以参与许多反应。
如氧化反应、还原反应、缩合反应和酯化反应等
目前,国外主要是以细菌为主,开展L-乳酸的发酵生产和研究,原因在于细菌厌氧发酵可大规模降低能耗,减少乳酸的生产成本。
乳酸细菌发酵机理如图所示。
细菌乳酸发酵代谢途径图解
A----同型乳酸发酵B----异型乳酸发酵C----混合酸乳酸发酵
2.2发酵液中L-乳酸的分离精制
2.2.1仪器与方法
2.2.1.1仪器及试剂
分子蒸馏装置、水浴锅、离心机、旋转蒸发仪
50%稀硫酸溶液、0.1%甲基紫溶液
2.2.1.2实验方法
乳酸发酵液的成分复杂,除乳酸外,发酵液中还包括菌体、残糖、蛋白质、色素、其他有机酸和无机盐等多种杂质。
这些杂质来源于发酵的原料、未消耗的营养盐或发酵的中间副产物。
从乳酸含量约10%-20%成分复杂的发酵液中提取高纯度的乳酸是比较复杂的工艺,方法主要有:
钙盐法、萃取法、吸附法、膜法、普通蒸馏法、分子蒸馏法等
1乳酸的参数
L-乳酸的熔点:
52.8-54.0℃,分子量:
90.08。
外消旋DL乳酸的熔点为16.8℃,沸点为122℃(14mmHg),相对密度1.249.与水完全互溶,不易结晶。
60%以上浓度的乳酸溶液有很强的吸湿性,乳酸能随热水蒸气挥发,常压蒸馏则分解,浓缩至质量分数为50%时部分转变成乳酸酐,含量为80%-90%乳酸产品一般含有10%-15%乳酸酐。
2实验流程简述
发酵液的主要成分是乳酸钙,实验采用乳酸钙直接酸解工艺制备粗乳酸,酸解所得的粗乳酸直接用旋转蒸发仪浓缩到几乎无水的状态,再将该浓缩乳酸加入分子蒸馏设备进行精制。
3实验具体步骤
(1)取出成熟发酵液及时升温至90-100℃,并同时加入石灰乳碱化处理,将pH调至9.5-10(不可再高,否则残糖与氨基酸易发生褐色反应),搅匀后,静止4-6h,使菌体等悬浮物沉降下来,该澄清过程应保温55℃。
(2)将上清液倒出,再趁热过滤下部含较多沉淀的液体,将两部分液体合并,得到乳酸钙溶液。
(3)将得到的乳酸钙溶液加到旋转蒸发仪中,在温度为70℃,真空度为0.2个大气压条件下浓缩脱水,当乳酸钙的浓度达到25%-28%时停止。
(4)控制温度为70℃左右,直接用50%的稀硫酸酸解浓缩的乳酸钙溶液。
用0.1%甲基紫溶液作为指示剂,早点板上检测酸解终点,刚好酸解完全时呈菊黄色,乳酸钙过量呈紫色,稀硫酸过量成绿色。
硫酸过量可以相应地补加适量的Ca(oH)2,酸解完全静止1-2h使CaSO4充分析出。
(5)再经减压抽滤,除去CaSO4滤渣,得到粗的L-乳酸溶液再经旋转蒸发器浓缩脱水(温度70℃,真空度0.2个大气压),尽可能脱去水分。
(6)最后将抽滤浓缩的L-乳酸加入到分子蒸馏设备中进行L-乳酸精制(设定条件为:
操作压力为0.1Pa,蒸发温度为55-70℃,转子速率120r/min,进料速率为90ml/h)
2.2.1.3结果与讨论
实验分别在55℃、60℃、65℃、70℃四个温度下对粗L-乳酸进行了精制。
在此范围内均可得到纯度大于90%的乳酸,精制后的乳酸颜色清澈,对精制的乳酸进行第二次分子蒸馏得到了结晶乳酸。
采用分子蒸馏技术精制L-乳酸,在操作压力为0.1Pa,蒸馏温度为70℃效果最好,同时实验发现适宜的蒸馏温度应低于75℃,可以避免重组分堵塞设备造成设备清洗困难。
采用分子蒸馏技术精制L-乳酸,原料可以是未经脱色处理的含水量较少的粗乳酸,直接用分子蒸馏方法进行蒸馏就可得到各种浓度需要的L-乳酸产品。
需要注意的是粗乳酸中糖含量应尽可能的降低,含糖过高时料液会粘在蒸发面上使整流操作无法进行。
2.3同型、异型乳酸发酵的确定(薄层色谱)
2.3.1仪器与方法
2.3.1.1仪器及试剂
离心机、分液漏斗、减压蒸馏装置、硅胶板、展开槽
硫酸、乙醚、甲醇、乙醇、双蒸水、乙酸乙酯、氨水、甲酸、乙酸、氯仿、丙酮
2.3.1.2实验方法
①乳酸发酵液预处理及标准品溶液的配制
乳酸发酵液预处理:
各样品先用0.5mol/L硫酸调节pH至2,离心除去沉淀后,用10ml蒸馏水分两次洗沉淀,洗液归并入离心所得上层清夜中,将清液移至分液漏斗中,用乙醚提取乳酸,每次用量与清液体积相等,提取四次。
然后放置于减压蒸馏上,使乙醚挥发完后,用10ml乙醇来溶解,作为供试液。
标准品溶液配制:
用双蒸水稀释88%的分析纯乳酸配制得浓度为20g/L的乳酸标准溶液,用0.45um滤膜过滤,置于冰箱中备用。
②展开剂的选择
展开剂一般现用现配,选择合适的量器把各组成溶剂移入分液漏斗,剧烈震荡,使混合液充分混合。
根据研究对象的极性,本文选择的展开剂主要有以下几种:
展开剂1乙酸乙酯—2.5%氨水(95:
5,v/v)
展开剂2氯仿—乙酸乙酯—甲酸(5:
4:
1,v/v/v)
展开剂3乙酸乙酯—乙酸—水(50:
12:
10,v/v/v)
展开剂4氯仿—丙酮—甲醇—冰醋酸(7:
1:
1.5:
0.5,v/v/v/v)
③点样
在薄层板上距底端约0.5cm处划出点样线(原线),再用铅笔每隔约0.5cm作一圆点,标记为点样处。
用玻璃制的毛细管吸取适量样液点样,若样品为水溶液,需边点样边加热干燥,防止斑点扩散,样点直径控制在2~3mm范围内,勿损伤薄层表面。
④展开
展开前先将适量混合均匀的展开剂倒入层析缸,密闭15~30分钟,用凡士林封口,使溶剂蒸汽饱和。
将上样后的薄层板放入层析缸中,采用直立上行一次展开或二次展开,展距约为3cm时,取出放于通风橱晾干。
⑤显色方法的选择
显色方法10.5%溴酚蓝酒精溶液喷雾后于105℃烘箱烘10分钟左右,显色
显色方法2碘蒸汽显色
2.3.1.3结果与讨论
1)吸附剂的选择
薄层色谱简写作TLC(ThinLayerChromatography),它是在吸附色谱的基础上发展起来的,包括有吸附、分配、离子交换、透析等作用,既有物理作用,兼有某些化学作用,并不是一种单一的机制。
但对不同的色谱方法来说,总有一种占主要地位;移动相是液体,固定相是固体时,吸附和解吸附占主要地位;移动相和固定相都是液体的薄层色谱,则分配规律占主导地位。
实践证明,不论是水溶性的糖、氨基酸或脂溶性的脂肪油、挥发油等都可以在吸附薄层上展开。
吸附薄层常用的吸附剂有硅胶、氧化铝和聚酰胺等。
硅胶略带酸性,适用于分离酸性及中性的物质,氧化铝带碱性,适用于碱性物质和中性物质的分离。
聚酰胺只对黄酮等某几类化合物分离效果较好。
故本文选用硅胶作为吸附剂。
(2)展开剂的选择
①溶剂系统的选择
在吸附层析中,当所用吸附剂已定,则对同一化合物的解吸能力与展开剂的极性有关。
展开剂一般是2~3种低沸点有机溶剂组成的多元溶剂系统。
展开剂选择的基本原则是:
能溶解待测组分;能使待测组分与杂质分开,达到基线分离;使待测组分斑点集中;使待测组分的Rf值(即比移值,表示物质在薄层色谱图谱上的相对位置)在0.3~0.85之间,比移值的计算方法为:
Rf=OS/OF
其中,OS为从原点到斑点中心的距离,OF为原点到展开剂前沿的距离。
本文所选择的四种展开剂实验结果如下:
展开剂1:
展开后薄层板上成一条直线,说明其分离度不够;
展开剂2:
各斑点仍留在原线,说明极性太弱;
展开剂3:
未形成斑点,成为和溶剂前沿几乎平行的一条带,说明极性太强;
展开剂4:
各发酵液样品基本都能分离出大小合适的斑点,其中较大的斑点Rf值与88%纯度的乳酸分析纯Rf保持一致。
②氯仿—丙酮—甲醇—冰醋酸展开剂组分配比的研究
根据实验结果,氯仿—丙酮—甲醇—冰醋酸基本能达到分离的要求,但是还存在少许拖尾现象,这可能是由于冰醋酸加入量偏少的原因,冰醋酸在此展开系统中的作用主要是减少拖尾现象,因此,本文适当提高了氯仿—丙酮—甲醇—冰醋酸展开剂中冰醋酸的含量,对以下的不同配比作了研究:
配比二氯仿—丙酮—甲醇—冰醋酸(7:
1:
1.5:
0.5)
配比二氯仿—丙酮—甲醇—冰醋酸(7:
1:
1.5:
0.8)
配比三氯仿—丙酮—甲醇—冰醋酸(7:
1:
1.5:
1.0)
结果表明,配比二的综合效果最好,配比一中冰醋酸含量较低,非极性溶剂所占比重较大,而待测物质乳酸极性强,两者之间作用力较弱,导致拖尾现象,层析效果差;配比三中冰醋酸含量较多,容易脱酸不彻底,使乳酸显色受到影响。
所以,氯仿—丙酮—甲醇—冰醋酸体积为7:
1:
1.5:
0.8是最佳展开剂配比。
③显色条件的选择
薄层色谱的定位方法有物理检出法、化学检出法、生物与酶检出法、放射显影法。
由于乳酸分子内没有共轭的发色基团,不适合用紫外线显色,而乳酸呈酸性,可考虑采用pH指示剂溴酚蓝;元素碘是一种非破坏性显色剂,能检出大量的化合物,且价廉易得,显色迅速、灵敏,故本文对指示剂溴酚蓝和碘显色两种方法进行了研究。
结果表明,溴酚蓝显色反应很灵敏,但在配制溴酚蓝酒精溶液时应将溶液pH值调到溶液刚好呈兰紫色,否则显色反应不灵敏;操作时喷雾应均匀适度,量小显色不清楚,量大则可能溶解乳酸,使斑点扩大;高温显色时须控制好时间,溴酚蓝遇酸显色为化学变化,长时间高温会使有色物质分解,造成乳酸斑点无法辨认,影响分析效果。
用碘显色材料易得、操作简单,碘显色后在酸斑点存在的位置为黄色或无色,无色可能是因为乳酸分子中的双键的存在,使得两种物质发生了不可逆的加成反应,使显色效果不明显。
为方便操作,在后续的研究中都采用碘蒸气作为显色剂。
按照以上所确定的薄层层析分析条件,取乳酸发酵液样品进行薄层分析,结果如图2.1。
由图2.1可知,发酵液中以乳酸产物为主。
123123
1—乳酸发酵液A2—乳酸发酵液B3—乳酸标准品
溴酚蓝显色效果碘蒸气显色效果
综上所诉,确定了乳酸的薄层层析定性分析条件,以薄层层析硅胶为固定相,氯仿—丙酮—甲醇—冰醋酸(7:
1:
1.5:
0.8)为展开剂,0.5%溴酚蓝酒精溶液喷雾显色或碘蒸气显色都得到了良好的分析效果,但碘蒸气法更简单明显。
2.4乳酸含量测定
2.4.1EDTA滴定法确定乳酸含量仪器与方法
2.4.1.1仪器及试剂
氢氧化钠(分析纯)溶液:
20%(m/v)
三乙醇胺(分析纯)1:
1水溶液
钙混合指示剂:
钙一轻酸指示剂1克与99克氯化钠(GB1266一77,分析纯)混匀研细,棕色瓶保存
盐酸轻胺(HG3一967一76):
分析纯
乙二胺四乙酸二钠(GB1401一78)标准溶液,0.05mol/l
2.4.1.2实验方法
乳酸钙可在热水中迅速溶解,并离解成钙离子和乳酸离子,而磷酸氢钙和石灰等钙离子不溶于水,在消除其他离子干扰的前提下,钙离子可迅速与乙二胺四乙酸二钠反应,以钙—经酸为指示剂,用EDTA标准溶液滴定,溶液成纯蓝色为滴定终点,用滴定消耗的EDTA体积和摩尔浓度可求得乳酸钙的含量。
称取样品1克(准确至0.0002克)于100ml杯中,加水80ml,在电炉上加热至近沸,继续加热5分钟(小心不要溶液溢出),冷却,定
容100ml,待溶液澄清后(或过滤),吸取上清液(滤液)10ml于锥形瓶中,加三乙醇胺10ml、蒸馏水50ml、氢氧化钠溶液10ml、0.5克盐酸轻胺摇匀后,再加钙混合指示剂少许,立即用乙二胺四乙酸二钠标准溶液滴定,溶液呈现纯蓝色为滴定终点。
2.4.1.3结果与讨论
乳酸钙(%)=
乳酸浓度(g/L)=90.08×C×V
v一滴定所消耗乙二胺四乙酸二钠标准溶液体积(ml)
C一乙二胺四乙酸二钠溶液浓度(mol/l)
M一称样重量(g)
0.2182一每毫摩尔分子乳酸钙的克数
90.08一乳酸的摩尔质量
V2一定容的样液体积(ml)
V1一吸取液的体积(ml)
每个试样取两个平行样测定,以其算术平均值作为结果。
当乳酸钙含量在25%以上,允许相对偏差为1%;乳酸钙含量在10%—25%,
允许相对偏差为2%;乳酸钙含量在10%以下,允许相对偏差为3%。
2.4.2分光光度法标准曲线确定乳酸含量仪器与方法
2.4.2.1仪器及试剂
UV-2100型紫外分光光度计、UV-240紫外可见扫描仪、振荡器、水浴锅、离心机、
无水乳酸锂、对羟基联苯、钨酸钠、硫酸铜、氢氧化钙、浓硫酸均为分析纯试剂;
钨酸溶液:
0.667M硫酸及10%(W/V)钨酸钠溶液等体积混合,现配现用
20%(W/V)硫酸铜:
称取硫酸铜20g,加蒸馏水定容至100ml。
1.5%对羟基联苯溶液:
称取对羟基联苯1.5g溶于0.125mol/L氢氧化钠100ml中(配时加热助溶,溶后为澄清液体)。
贮于棕色瓶中,保存于4度冰箱,可使用一个月。
乳酸标准储存液(0.5mg/ml):
精确称取五水乳酸锂53.25mg,溶于50ml蒸馏水中,加0.5M硫酸10ml,后加蒸馏水定容至100ml。
混匀后保存于4度冰箱。
2.4.2.2实验方法
①发酵样品预处理
取适量发酵液样品5000r/min离心10min,以除去菌体和碳酸钙沉淀,吸取上清液0.5ml置于洁净离心管中,加入等体积1mol/L硫酸,静置约二十分钟后10000r/m离心十分钟,以除去硫酸钙。
取上清液适当稀释,吸取稀释液2.00ml于洁净离心管中,加入2.00ml钨酸溶液,混匀,室温静置至溶液出现明显絮状物出现(约45min),10000r/m离心10min,取上清置于10ml洁净离心管中,60℃水浴保温0.5h,冷却待用。
②最大吸收波长的确定
ⅰ精确吸取5ml待测液于具塞试管中,加入0.1g氢氧化钙,混匀,然后加入0.2ml20%硫酸铜,迅速混匀,沸水浴3min,水浴冷却,3000r/m离心5min,取上清液0.5ml入比色管中。
ⅱ加入6ml浓硫酸,混匀,沸水浴加热5min,取出后冰水浴冷却。
ⅲ加入1.5%对羟基联苯溶液0.1ml,充分混摇,静置30min。
ⅳ置于沸水浴中加热90s,冰水浴冷却,在400~700nm波长范围内进行扫描,蒸馏水为空白做参比液,确定最大吸收波长。
③最佳显色条件的确定
以氢氧化钙、硫酸铜、浓硫酸、对羟基联苯溶液用量,静置显色时间,最后加热显色时间作为考察因素,采用正交设计选择最佳显色条件。
④乳酸标准曲线的制作
用0.5mg/ml乳酸标准液,与发酵液同样预处理后,取0、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.40、0.45、0.50、0.55、0.60、0.70、0.80、1.00ml处理液分别置于15支预先编好号的试管,各加水补足体积至5ml,按第三步中所确定的最佳显色条件操作,分别测定吸光度。
以乳酸含量为横坐标,吸光度值为纵坐标,作出标准曲线。
2.4.2.3结果与讨论
在乳酸发酵的过程中乳酸通常以乳酸钙的形式存在,通过去除发酵液中的葡萄糖和蛋白质,并加入适当浓度硫酸酸化,钙离子转化成难溶的硫酸钙沉淀,使溶解度不高的乳酸钙全部转变为乳酸。
乳酸在铜离子的催化下,与浓硫酸作用生成乙醛,乙醛能与对羟基联苯作用生成在565nm处有特征吸收的紫色物质。
在一定浓度范围内,乳酸含量与565nm处波长吸光度呈线性关系,因此,可以通过测定565nm处的吸光度来测定乳酸的含量。
(1)最大吸收波长的确定
乳酸发酵液样品显色后,扫描结果见图2.2,表明,最大吸收波长为565nm。
最大吸收波长的确定
(2)最佳显色条件的选择
结果表明,氢氧化钙和浓硫酸的加入量对显色反应影响显著,其余因素的作用不显著,最佳显色条件为A2B3C2D1E1F3,即氢氧化钙0.05
g,20%硫酸铜0.8ml,浓硫酸6ml,对羟基联苯0.125ml,静置时间15min,加热显色时间5min。
(3)乳酸标准曲线的制备
乳酸标准应用液浓度在10~80μg/ml范围内与吸光度值基本呈线性关系,当浓度大于等于60μg/ml时吸光度值大于1,考虑到仪器误差的因素,故制备标准曲线时浓度范围取在15、20、25、30、35、40、45、50μg/ml,得到如图2.4的乳酸标准曲线,求得标准曲线回归方程为A=0.0189C-0.0808(A为吸光度值,C为乳酸浓度,n=8),r=0.9989,在15~50μg/ml范围内呈良好线性关系。
乳酸标准应用液浓度与吸光度值之间的关系
乳酸标准曲线
本实验对发酵液进行预处理,排除蛋白质和葡萄糖的干扰,使测定结果更接近真实值;优化了显色条件,使测定时操作简便,精确度高,显色稳定,准确度高,适合于发酵液中乳酸含量的测定。
2.5残糖含量的确定(DNS法)
2.5.1仪器与方法
2.5.1.1仪器及试剂
UV-2100型紫外分光光度计、振荡器、水浴锅、离心机、
3,5-二硝基水杨酸
2.5.1.2实验方法
在碱性条件下,还原糖与3,5-二硝基水杨酸共热,3,5-二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸(棕红色物质),还原糖则被氧化成糖酸及其它产物。
在一定范围内,还原糖的量与棕红色物质颜色深浅的程度量呈一定的比例关系,在