天然药物有效成分提取分离技术研.docx
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天然药物有效成分提取分离技术研
天然药物有效成分提取分离技术
中草药以植物药为主,而植物都是由复杂的化学成分所组成。
其中主要有纤维素、叶绿素、单糖、低聚糖和淀粉、蛋白质和酶、油脂和蜡、树脂、树胶、鞣质及无机盐等.其中，许多物质对植物机体生命活动来说不可缺少，称为一次代谢产物。
一般认为它们在药用上是无效成分或杂质.而另外一些化学成分如：
生物碱、黄酮、蒽醌、香豆素、木脂素、有机酸、氨基酸、萜类、苷类等对维持植物生命活动来说不起重要作用，称为二次代谢产物，这些物质在植物体内虽含量很少,多则百之几，少则百万分之几,甚至更少。
但它们往往具有较强的生理活性，其中有些已应用于临床，我们称之为有效成分。
当然有效成分与无效成分的划分是相对的，如天花粉的引产有效成分是蛋白质，香茹中的多糖对实验动物肿瘤有显著的抑制作用.
在进行中草药成分提取前，应注意对所用材料的原植物品种的鉴定并留样备查。
同时要系统查阅文献，以充分了解，利用前人的经验.
中草药有效成分的提取分离一般有下面两种情况:
第一、从植物中提取已知的有效成分或已知的化学结构类型者。
如从甘草中提取甘草酸、麻黄中提取麻黄素；三棵针中提取黄连素等（提取有效成分）。
或从植物中提取某类成分如总生物碱、总酸性成分。
如从银杏叶中提取总黄酮;从大黄中提取总蒽醌（提取有效部位）。
工作程序比较简单.一般先查阅有关资料，特别是工业生产的方法,搜集比较该种或该类成分的各种提取方法，再根据具体条件加以选用.（注意先重复该方法,得到产品后，再结合生产实际,不断改进工艺,达到大生产要求）。
第二、从中草药中寻找未知有效成分或有效部位时，情况比较复杂.只能根据预先确定的目标，在临床或药理试验配合下，经不同溶剂提取，以确定有效部位。
然后再逐步划分，追踪有效成分最集中的部位，最后分得有效成分。
一、中草药有效成分的提取
对中草药化学成分的提取，通常是利用适当的溶剂或适当的方法将植物中的化学成分从植物中抽提出来。
常用的方法有溶剂法、水蒸汽蒸馏法和升华法等。
其中后两种方法的应用范围十分有限。
现分别介绍如下：
（一）溶剂提取法
1、溶剂提取法的原理：
溶剂提取法是根据中草药中各种成分在溶剂中的溶解性质，选用对活性成分溶解度大，对不需要溶出的成分溶解度小的溶剂,而将有效成分从药材组织内溶解出来的方法。
根据“相似者相溶”的经验规律，中药化学成分可通过结构去估计它们的性质，亲脂性的中药成分易溶于亲脂性溶剂,难溶于亲水性溶剂。
反之,亲水性成分则易溶于亲水性溶剂。
据此,可选择适当溶剂从中药中提取所需成分。
常见溶剂的亲水性或亲脂性的强弱顺序表示如下：
石油醚、苯、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、乙醇、甲醇
1、水提取法
水是一种强杉性溶剂。
中草药中亲水性成分如无机盐、糖类、鞣质、氨基酸、蛋白质、有机酸盐、生物碱盐和苷类等都能被水溶出.游离生物碱可与酸生成盐而溶于水,因而可用酸水提取。
有机酸、黄酮、蒽醌、内酯香豆素和酚类成分可与碱成盐而溶于水,可用碱水提取。
提取方法可分为水煎、水浸和水渗鹿三种。
例:
①从三棵针中提取小檗碱；②从槐米中提取芦丁；③从甘草中提取甘草酸等。
2、醇类溶剂提取法
大多数中草药成分都可用醇（EtOH，MeOH）或含水、含酸的醇来提取。
以乙醇最为常用，由于醇类溶剂兼有亲水性的醇羟基和亲脂性的烷基,因此，具有溶解度范围大，适用范围广的特点.除了强亲水性蛋白质、多糖、无机盐；强亲脂性叶绿素、油酯、脂溶性色素、蜡等成分外，其他成分都可用醇来提取。
在实验室和工业生产中,该方法使用最为普遍.
提取方法：
冷提、回流提取
3、亲脂性有机溶剂提取
一般适用于挥发油、油酯、叶绿素、植物甾醇、萜类、游离生物碱及苷元等弱极性成分的提取。
例:
①从穿地龙中提取薯蓣皂苷元（用溶剂汽油）;②萝芙木根中提取利血平（苯为溶剂）。
提取方法:
回流提取;连续提取。
4、二氧化碳超临界萃取。
5、利用膨缩原理提取
6、超声提取
（二）水蒸汽蒸馏法
该法只适用于具有挥发性、能随水蒸汽蒸馏而不被破坏,与水一发生反应，而且难学或不溶于水的成分的提取。
中草药中的挥发油及某些挥发性成分能用水蒸汽蒸馏法得到。
但应用范围有限。
例：
麻黄碱、菸碱、槟榔碱、牡丹酚、大蒜素的提取。
（三）升华法
固体物质受热直接气化,遇冷后又凝固为固体化合物称为升华。
中草药中有一些成分具有升华的性质，可利用升华法直接自中草药中提取出来.如:
樟木可樟脑；茶叶中咖啡碱；大黄中游离羟基蒽醌的提取。
二、中草药有效成分的分离和精制
1、结晶和重结晶
结晶法是分离和精制固体成分的重要方法之一,是利用混合物中各成分在溶剂中的溶解度不同达到分离的方法。
一般来说,从不是结晶状物质处理得到结晶状物质,这一步叫结晶。
从比较不纯的结晶用结晶方法精制到较纯的结晶，称重结晶.采用结晶法首先要注意结晶的条件（如选择合适的溶剂、合适的温度和时间、有效成分在欲结晶的混合物中的含量等）。
其中最主要的是选择合适的溶剂.该溶剂对欲纯化的成分热时溶解度大，冷时溶解度小，而对杂质则冷热都不溶或冷热都易溶。
其次是有效成分在待结晶的混合物中的含量,一般说含量愈高愈容易结晶，有的化合物要比较单纯时才能得到结晶。
因此，必须注意中药的粗提物先用其它方法尽量除去杂质后,再采用此法.
2、沉淀法
①溶剂沉淀法：
在溶液中加入另一种溶剂以改变混合溶剂的极性，使一部分物质沉淀析出，从而实现分离的方法.常见的有a。
在药材浓缩水提取液中加入数倍量高浓度乙醇（水提醇沉法），以沉淀除去糖类、蛋白质、果胶、无机盐等水溶性杂质；从中草药中提取多糖类成分也可采用此法。
b。
醇提水沉法：
在浓缩乙醇提取液中加入数倍量水稀释，放置以沉淀除去树脂、果胶、粘液质、叶绿素等水不溶性杂质.C。
醇/醚法或醇/丙酮法：
该法主要用于沉淀皂苷类成分，而将脂溶性的树脂等类杂质留在母液中，一般将粗皂苷溶于少量醇中，然后逐滴加入乙醚或丙酮，摇均,皂苷即析出.
②酸碱沉淀法:
对酸性、碱性或两性有机化合物来说，可通过加入酸、碱以调节溶液的pH值,改变分子的存在状态（游离型或解离型），从而改变溶解度而实现分离。
a.酸提取碱沉淀法：
主要用于生物碱的分离精制,含生物碱的药材用酸性水提出后，加碱调至碱性生物碱即可沉淀析出。
b.碱提取酸沉淀法：
主要适用于黄酮、蒽醌及其它酚酸性成分的分离和精制。
③金属盐沉淀法：
常用铅盐（中性和碱性醋酸铅）、钡盐、钙盐、铜盐等。
例中性皂苷和酸性皂苷的分离可用铅盐法，向混合皂苷的水溶液或醇溶液中先加入中性醋酸铅则酸性皂苷形成铅盐沉淀,而中性皂苷则留于溶液中，据此，可将两者分开。
另外，在粗制皂苷的水溶液中加入碳酸铜溶液，搅拌，可使鞣质、色素等杂质沉出除去.
④试剂沉淀法:
分离生物碱尤其是水溶性生物碱常加入苦味酸、苦酮酸、雷氏铵盐等生物碱沉淀试剂，生成的生物碱盐通过复分解反应或加入无机盐处理又得到原来的生物碱。
胆甾醇试剂常用于沉淀甾体皂苷，从而与三萜皂苷分开。
3、pH梯度萃取法：
将被分离物质溶解在与水不相溶的有机溶剂中，用碱水使pH由低到高或用酸性水使pH由高到低，依次萃取，达到分离目的的方法。
常用于不同碱度的生物碱分离和不同酸度的蒽醌苷元和黄酮苷元的分离。
4、盐析法:
在中药的水提液中，加入无机盐至一定浓度，或达到饱和状态，可使某些成分在水中的溶解度降低而析出沉淀,从而与水溶性大的杂质分离.常用作盐析的无机盐的氯化钠、硫 钠、硫酸镁、硫酸铵等。
例三七的水提液中加入硫酸镁至饱和状态，三七皂苷乙即可沉淀析出；自黄藤中提取掌叶防己碱；自三棵针中提取小檗碱在生产上都是用氯化钠盐析制备；将羊角拗和酒精提取物溶于水，水液用铅盐法除去杂质后，加入硫酸铵饱和,即析出粗强心苷。
5、透析法：
利用小分子及小离子在溶液中可通过半透膜，而分子及大离子不能通过的性质,借以达到分离。
例如分离纯化皂苷，蛋白质、多肽、多糖等成分时，可用透析法除去小分子杂质如无机盐、单糖、双糖等。
6、两相溶剂萃取法
⑴液—液萃取与分配系数K值
两相溶剂萃取法定义:
利用混合物中各成分在两种互不相溶的溶剂中分配民系数的不同而达到分离的方法叫两相溶剂萃取法。
溶质在两相溶剂中的分配系数K在一定温度及压力下为一常数：
K=CU/CLK：
分配系数CU：
示溶质在上相溶剂中的浓度CL：
示溶质在下相溶剂中的浓度。
假定：
A、B两种溶质用氯仿/水进行分配,A、B均为1克，KA=10，KB=0.1，两相溶剂体积比VCHCl3/VH2O=1
则在分液漏斗中作一次振摇分配平衡后，溶质A90％以上分配到上相溶剂中，10%以下分配到下相溶剂中。
计算方法:
KA=10/1A=10/11⨯100％=90.91%。
同理：
溶质B的分配与A相反，10%以下在上相中，90%以上在下相中.计算方法：
KB=0.1=1/10B=1/11⨯100％=9。
09％。
⑵分离难易与分离因子β
分离因子β可定义为A、B两种溶质在同一溶剂系统中分配系数的比值。
β=KA/KB（注：
KA〉KB）,上例中，β=KA/KB=10/0.1=100
β≥100仅作一次简单萃取就可实现基本分离
100〉β≥10则须萃取10-12次
β≤2须作100次以上萃取
β≌1则KA≌KB意味着两者性质极其相近，或甚至即为同一物质，故即使作任意次分配也无法实现分离.
⑶分配比（系数）与PH
对酸性、碱性及两性有机化合物来说，分配比还受溶剂系统PH的影响。
原因是PH变化可以改变它们的存在状态（游离型或解离型），从而影响在溶剂系统中的分配比。
对酸性物质（HA），其在水中的解离平衡及解离常数K可用下式表示:
两边取负对数
注：
Ka越大,酸性越强；PKa值越小,酸性越强。
若使该酸性物质完全解离，即使HA均转变成A—，则
故
若使该酸性物质完全游离，即使A-均变成HA
则
酚类化合物PKa值一般为9。
2-10.8；羧酸类化合物PKa值约为5.
因而PH3以下，大部分酸性物质将以非解离形式（HA）存在，易分配于有机溶剂中，而PH12以上时,则将以解离形式（A—）存在,易分配于水中。
同理，对碱性物质（B）,其碱性强弱可用其共轭酸（BH+）的解离常数Ka-或PKa—值表示。
Ka—越小，碱性越强；PKa—越大，碱性越强。
一般PH〈3时，酸性物质多呈非解离状态（HA），碱性物质则呈解离状态（BH+），但PH>12，则酸性物质呈解离状态（A—），碱性物质则呈非解离状态（B）存在。
据此，可利用PH值的不同将酸、碱物质分开.
三、层析法Chromatography
层析技术目前已广泛应用于各种化合物的分离分析，发展很快，它已成为化学实验室不可缺少的分析分离手段。
层析法是一种使不同分子相互分离的过程，当一混样品被导入一固定相的支持体中，而另一流体（移动相）通过时，由于样品各组分与固定相和移动相相互作用的大小不同，使用权各组分通过固定相支持体的速成率不同而得到期分离。
按其操作方法，在柱上进行称为柱层析；在薄层上进行称为薄层层析;在纸上进行称为纸层析.
层析法按分离原理可分为⑴吸附层析（利用吸附剂对样品吸附能力的差别进行分离）；⑵分配层析（利用样品组分在二种不相互溶的溶剂中分配系数的不同进行分离）；⑶离子交换层析（利用样品组分在离子交换树脂上交换能力大小不同进行分离）；⑷凝胶层析（利用分子筛分离物质的一种方法）。
（一）薄层层析:
薄层层析是50年代初发展起来的一种新型、快速、简单、高效的层析法。
薄层层析的操作方法是将吸附剂均匀地铺在玻璃板上，把欲分析的样品点加到薄层上，然后用合适的溶剂展开而达到分离、鉴定和定量的目的，因为岐析是在薄层上进行，所以称它为薄层层析.
薄层层析在天然药物化学中应用：
⑴天然药物化学成分的予试验;⑵中药中已知有效成分的鉴定（须用已知标准品或对照品进行对照）;⑶分离得到的有效成分或单体的纯度判断；⑷小量样品的制备;⑸探索柱层析分离的条件。
薄层层析优点：
⑴价廉、设备简单、易于操作；⑵展开时间短，一般只须数分钟到期数十分钟；⑶斑点扩散小，检出灵敏度高；⑷分离情况受温度影响小；⑸可以使用腐蚀性试剂。
薄层层析缺点：
⑴Rf值重现性差（因此，为了克服这一缺点，通常将标准品与样品在同一薄层板上同时层析）；⑵用大的薄层板展开时，容易出现边缘效应；⑶色谱图不易保存。
吸附剂的选择
国内常用的吸附剂有硅胶、聚酰胺和纤维素。
氧化铝已经不常用。
其中硅胶由于它们的吸附性能良好，适用于各类化合物的分离，应用最广.
硅胶商品常见的有以下几种⑴硅胶G：
粘合剂为石膏（Gypsum）；
⑵硅胶H:
不含石膏和其它有机粘合剂；⑶硅胶HF254：
不含粘合剂，但含有一种无机荧光剂.
薄层的制备薄层板常分为软板和硬板两种，软板常用5⨯20cm的玻璃板；硬板常用7.5⨯2。
5cm的显微镜载玻片.软板的制备是选用一根直径为1-1.2cm的玻璃管，根据薄层的厚度在玻璃管两端绕几圈胶布。
把吸附剂倒在玻璃板上，用玻璃管将吸附剂顺一个方向推动，即成薄层。
硬板的制备是用stahl涂布器或手工方法铺板。
国内一般都采用手工方法铺板.
铺板注意事项：
⑴用蒸馏水调制吸附剂时,有时为了把气泡赶尽,可加1-2滴乙醇消泡；⑵国内产硅胶G中的石膏经常不起粘合作用，因此，常用2‰的CMC-Na溶液调硅胶G制成硬板。
薄层层析操作方法参见其它专著。
薄层层析操作注意事项：
⑴样品点在距离薄层下端1-1.5cm处，样品原点的直径要小（2—3mm），如一次点样量不够，可在溶剂挥发后重复点样；⑵样品量要适中。
样品量太少时，样品中含量少的成分不易检出,但样品量太多会形成斑点过大互相交叉或拖尾而不能达到很好的分离；⑶被检样品用合适的溶剂溶解（尽量避免用水、甲醇）,但有时样品只能用水、甲醇作溶剂时，点样时，要注意斑点的扩散（每次点样量要小，点样后可采用电吹风吹干或在水浴锅上加热挥干后，再重复点样），点样完毕后,也要将水和甲醇挥去以后，才能进行展开，否则得不到较好的分离效果（原因:
水和甲醇会改变展开剂极性；展开剂多为有机溶剂，由于水和展开剂互不相溶，展开剂展开时开始会绕着原点展开）。
⑷点样时避免将固体物质点到薄层上，否则，当展开剂时样品边溶解,边移动，形成严重拖尾，组分交叉重叠，达不到分离目的。
⑸有些展开剂中因含有水，有时可能会分层,此时一定要将水分去后，方能展开，否则层析失败,观察不到很好的斑点.
展开剂
层析过程中溶剂的选择对组分分离关系极大。
在国内，可供选择的吸附剂种类不多，而展开剂的种类很多，不仅可用单一溶剂,而且常用各种配比的混合溶剂。
因此，在进行薄层层析时，选择展开剂比选择吸附剂要复杂的多.
选择展开剂时,在吸附薄层上,主要是考虑展开剂的极性;被分离物质在展开剂中的溶解度;在分配薄层上，根据被分离物质在两相溶剂中的溶解度来选择。
这里着重讨论吸附层析的情况。
一般说来，当吸附剂选定之后，在同一吸附剂上展开剂的极性越大，则对同一化合物的冼脱能力也越大，即在薄层上能把它推得越远，Rf值越大。
因此,如果用某种展开剂去展开某一化合物时，当Rf值太小时，就要考虑换用一种极性较大的溶剂去展开；Rf值过大时，就降低溶剂的极性。
在进行薄层层析时，除了考虑吸附剂和展开剂，还要考虑被分离物质的极性大小.被分离物质、吸附剂和展开剂三者既相互联系又相互制约，三者之间的关系可用下图表示：
在实际工作中,应注意前人有经验，再结合自己的条件加以选择。
特殊薄层及薄层新进展：
⑴荧光薄层:
在吸附剂中加入荧光性物质，制成的薄层，用于不显色或不能显色的物质分离。
⑵络合薄层：
硝酸银薄层,用于分离碳原子数目相等而其中碳碳双键数目不等的一系列化合物.其主要机理是由于碳碳双键能与硝酸银形成络合物，而饱和的碳碳单键则不与硝酸银络合。
硼酸薄层用于分离糖类化合物。
其原理是利用硼酸与糖分子中羟基的络合作用于以达到分离.
⑶酸碱薄层：
在铺制薄层时采用稀酸或稀碱以代替水调制的薄层.
⑷薄层新进展:
烧结薄层层析；高效薄层层析；有浓缩区的薄层层析;双波长薄层层析扫描。
（二）硅胶柱层析硅胶的应用范围比较广，既能用于非极性物质的分离，也能用于极性化合物的分离。
如挥发油、萜类、甾体化合物、生物碱、苷类、蒽醌、酚酸类化合物等。
硅胶的活性与含水量有关，含水量高则吸附力减弱，当游离水含量高达17%以上时，吸附能力极低，而可作为分配层析载体。
含水量
0
5
15
25
38
活度（级）
1
2
3
4
5
1、装柱
⑴干法装柱将层析柱垂直固定在铁支架上,柱底填上一块棉花（如柱底有烧结层可不垫棉花，可以垫一张滤纸），打开活塞。
将硅胶经漏斗慢慢装入柱中,边填装，边用橡皮塞轻轻敲击层析柱，使其填装均匀紧密，最后使吸附剂表面形成一水平面。
该法优点装柱速度快，洗脱剂用量少；缺点由于硅胶表面和吸附剂间隙带有空气，影响分离效果。
⑵湿法装柱将硅胶混悬于洗脱剂中，不断搅拌待空气除去后，连同溶剂一起倾入，否则由于不同粒度大小的硅胶沉降速度不一，使硅胶柱有明显的分段，容易影响分离效果.打开活塞，放出上面过多的洗脱剂.使洗脱剂盖过硅胶表面数厘米为宜。
用橡皮塞轻轻敲击层析柱.要求在层析柱四周敲击均匀,否则，由于层析柱两侧硅胶紧密程度不一，造成色谱带产生斜面，影响分离效果.敲击顺序就为从下逐步往上。
2、上样⑴湿法上样一般将样品溶于洗脱剂中轻轻注入已准备好的硅胶柱上面，勿使硅胶柱面受到扰动，否则将影响层析效果，所用样品洗脱剂要少，使样品在硅胶柱上形成狭窄的原始谱带。
⑵干法上样如果样品在所选装柱洗脱剂中不易溶解,则可将样品溶于能溶的溶剂中，再用不到装柱用量的1/20的吸附剂拌匀,然后将溶剂挥发干净（有时需研粉），再按一般装柱法将带有样品的硅胶加在层析柱中硅胶上面.上样时注意除去样品硅胶中的气泡。
3、注意事项
⑴层析柱内径与柱长之比一般为1:
10-20.
⑵样品量与吸附剂比例硅胶一般为1:
100—300；较难分离者有时甚至可达1:
500-1000；聚酰胺为1:
20-30.
⑶洗脱用溶剂系统要通过薄层层析进行筛选。
但因薄层层析时吸附剂的表面积一般为柱层析时表面积的2倍左右，故一般薄层层析展开时使组分Rf值达到0。
2—0。
3的溶剂系统可选用为柱层离该相应组分的最佳溶剂系统。
⑷在整个层析过程中，层析柱吸附剂上面应始终保持有洗脱剂，一旦洗脱剂低于吸附剂，则带进大量空气，影响分离效果，甚至使层析过程失败.
⑸干法上样时，样品一定要呈溶液状态拌入吸附剂，如样品没有完全溶解，将混悬液拌入吸附剂,当进行柱层析时，颗粒状样品在洗脱剂作用下，逐步溶解后再经柱层析移动，用薄层层析检查时,样品完全没有分离开。
（三）反相硅胶层析
最常用的Lobar柱.柱层析的填料系将普通硅胶经化学修饰，键合上长度不同的烃基（R），形成亲油表面而成。
一般根据键合的烃基长度为乙基、辛基、十八烷基.分别命名为RP（reversephase）-2、RP—8及RP—18。
三者亲脂性强弱为RP-18>RP-8〉RP-2。
Lobar柱属于低压柱层析范畴（〈5个大气压）。
具有上样量大、分离速度快、分离效果好，价格也比较便宜，操作简便，可反复使用的优点.国内使用的单位也比较多。
适用于皂苷、多肽及其它多糖苷等水溶性成分的分离.现在国内也有反相硅胶商品出售，也可直接按常压柱层析操作使用。
为了提高分离速度，缩短分离时间，可使用加压液相层析（始于经费问题，还远没有普及）。
依据所用压力大小不同，可以分为快速层析（<5个大气压），低压液相层析（LPLC,〈小于5个大气压），中压液相层析（MPLC，5-20大气压）及高压液相层析（HPLC，>20个大气压）等.
（四）聚酰胺层析
聚酰胺的种类很多，但用于层析的有两种：
绵纶6（聚已内酰胺）和锦纶66（聚已二酰已酰胺），它们既亲水又亲脂，其亲水、亲脂性能较好.因此，既可分离水溶性物质，又可分离脂溶性物质。
聚酰胺吸附原理是由于聚酰胺分子内有很多酰胺键，可与酚酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键。
因而对这些物质产生了吸附作用即氢键吸附.酚酸类是其酚羟基和羧基与聚酰胺的羰基形成氢键.芳香硝基化合物和醌类是其硝基和醌基与聚酰胺分子中酰胺键的游离氨基形成氢键。
聚酰胺层析是一种用途十分广泛的分离方法，特别适合于分离酚类、醌类、黄酮类等化合物.
聚酰胺吸附强弱主要取决于各种化合物与之形成氢键缔合的能力，要含水溶剂中大致有下列规律：
⑴形成氢键的基团数目越多，则吸附能力越强。
如丁二酸〉丁酸;间苯三酚〉间苯二酚〉苯酚.
⑵形成氢键的位置对吸附力有影响.易形成分子内氢键者，其在聚酰胺上的吸附即相应减弱。
如间苯二酚〉苯酚>邻苯二酚；对羟基苯甲酸>邻羟基苯甲酸。
⑶分子中芳香化程度高者，则吸附作用增强,反之,则减弱.如
⑷与溶剂介质有关，一般认为，在水中形成氢键能力最强，在有机溶剂中较弱,大碱性溶剂最弱.
因此，各种溶剂在聚酰胺柱上的洗脱能力由弱至强，大致排列成下列顺序:
水<不浓度的甲醇或乙醇<丙酮〈稀氢氧化铵或氢氧化钠〈甲酰胺〈二甲基甲酰胺<脲素水溶液
注意事项:
⑴在聚酰胺层析时,由于所用洗脱剂不同，可以达到除去杂质、纯化总酸性成分或分离单体的目的。
⑵柱层析时用含有氯仿作冼脱剂时,由于溶剂的比重大于1，无法装柱。
⑶由于条件所限，常压柱层析时，用含水溶剂作洗脱剂时，含水量越大，冼脱速度越慢。
如常用的乙醇-水；甲醇—水;丙酮-水等，当含水量大于20%以上时,所用聚酰胺颗粒最好不要小于100目.
（五）凝胶层析
凝胶层析也叫凝胶过滤、分子筛过滤、凝胶渗透层析、排阻层析等。
它是六十年代发展起来的一种分离分析技术,是利用分子筛分离物质的一种方法。
其原理是凝胶颗粒在适当的溶液中浸泡,待充分膨胀后装入层析柱，加样后用同一种溶液洗脱。
由于凝胶网孔半径的限制，大分子将不能渗入凝胶颗粒内部（即被排阻在凝胶粒子外部），故在颗粒间隙移动,并随溶剂一起从柱底先行流出；小分子因可自由渗入并扩散到疾胶颗粒内部，故通过层析柱时阻力增大,流速变缓，将较晚流出。
样品混合物中各个成分因分子大小各异，渗入至凝胶颗粒内部的程度也不尽相同，故在经历一段时间流动并达到动态平衡后，即按分子由大到小顺序先后流出并得到分离。
羟丙基葡聚糖凝胶（SephadexLH-20）为SephadexG-25经羟丙基化处理后得到的产物。
与SephadexG比较，SephadexLH—20分子中羟基总数虽无变化，但碳原子所占比例却相对增加了.不仅可在水中应用，也可在极性有机溶剂或它们与水组成的混合溶剂中膨润使用。
SephadexLH-20除保留有SephadexG-25原有的分子筛特性，可按分子量大小分离物质外，在由极性与非极性溶剂组成的混合溶剂中常常起到反相分配层析的效果，适用于不同类型有机化合物的分离，在天然药物分离中得到了越来越广泛的应用。
SephadexLH-20价格比较昂贵。
用过的SephadexLH-20可以反复再生供用，具体实验技术（装柱、加样、洗脱）参见《中草药有效成分提取分离》1981.195页。
6、离子交换层析
⑴离子交换法系以离子交换树脂作为固定相，以水或含水溶剂作为流动相。
当流动相流过交换柱时，溶液中的中性分子及具有与离子交换树脂交换基团相反电荷的离子将通过柱子从柱底流出，而具有相同电荷的离子则与树脂柱上的交换基团进行离子交换并被吸附到柱上，随后改变条件，并用适当溶剂从柱上洗脱下来。
即可实现物质分离.
⑵常用的离子交换树脂的种类有：
强酸性阳离子交换树脂；强碱性阴离子交换树脂；弱酸性阳离子交换树脂;弱碱性阴离子交换树脂。
离子交换树脂的交链度对中药化学成分的交换分离影响较大。
一般常用低交链度的树脂.阳离子交换树脂交链度3—6%；阴离子交换树脂交链度2—3％。
⑶离子交换法应用
①常用于有效部位的分离
民间使用中草药往往用煎剂，一般可用水煎剂通过强
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