高铜对雏鸡血清中免疫球蛋白含量的影响.docx

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高铜对雏鸡血清中免疫球蛋白含量的影响

2010届本科毕业论文（设计）

高铜对雏鸡血清中免疫球蛋白含量的影响

学生姓名：

所在院

所学专业：

导师姓名

完成时间：

2011年6月

摘要

选用1日龄艾维茵肉鸡健雏420只，随机分为7组，分别喂以对照日粮（Cu11mg/kg）、高铜日粮（Cu100mg/kg，高铜Ⅰ组；Cu200mg/kg，高铜Ⅱ组；Cu300mg/kg，高铜Ⅲ组；Cu400mg/kg，高铜Ⅳ组；Cu500mg/kg，高铜Ⅴ组；Cu600mg/kg，高铜Ⅵ组）六周，以免疫比浊法研究日粮铜添加水平对雏鸡血清中免疫球蛋白含量的影响。

结果显示高铜Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组雏鸡血清中免疫球蛋白含量在整个实验期间与对照组比较差异均不显著（P﹥0.05）；日粮含铜超过300mg/kg时，雏鸡血清中免疫球蛋白含量程度不同地降低，与日粮含铜量呈负相关。

表明，日粮中低于300mg/kg的高铜量对雏鸡血清中免疫球蛋白的合成无显著影响，超过300mg/kg的高铜量对免疫球蛋白合成有程度不同的抑制作用。

关键词：

肉鸡，高铜，血清，免疫球蛋白

Abstract

420one-day-oldAvianchickenswererandomlydividedintosevengroups,andfedondietsasfollows:

controlgroup（Cu11mg/kg）andCu-excessgroups（Cu100mg/kg,Cu-excessgroupⅠ;Cu200mg/kg,Cu-excessgroupⅡ;Cu300mg/kg,Cu-excessgroupⅢ;Cu400mg/kg,Cu-excessgroupⅣ;Cu500mg/kg,Cu-excessgroupⅤ;Cu600mg/kg,Cu-excessgroupⅥ）respectivelyforsixweeks.EffectofdietarydifferentquantityofcopperonImmunoglobulinlevelofbloodseruminchickenwasstudiedbyImmunoturbidimetry.TheresultsshowedthatImmunoglobulincontentsofbloodserumingroupⅠ、Ⅱ、Ⅲhadnoobviousdifferenceinwholeexperimentperiodincomparisonwiththoseofcontrolgroup（P>0.05）;ImmunoglobulincontentsofⅣ、Ⅴ、Ⅵgroupsweredecreasedsignificantlyincomparisonwiththoseofcontrolgroup.Theabove-mentionedresultsshowedthat100、200、300mg/kgCuhadnoobviousinfluenceonImmunoglobulinsynthesisofbloodseruminchicken,anddietaryCumorethan300mg/kgcoulddecreaseitindifferentdegrees.

Keywords:

Chicken;Copper-excess;BloodSerum;Immunoglobulin

前言3

1材料与方法4

1.1材料4

1.1.1实验动物4

1.1.2　试验日粮4

1.2　试验方法动物分组与饲养管理5

1.3采取样品及样品制备5

1.4血清中免疫球蛋白含量5

1.5数据统计与分析6

2　结果与分析6

2.1　临床观察6

2.2血清中免疫球蛋白的变化6

2．2．1IgG:

2．2．2IgA:

2．2．3IgM:

3　讨论9

参考文献11

致　谢12

前言

铜作为机体必需的微量元素之一，在维持正常的免疫功能方面具有重要作用[1]。

铜对体液免疫功能影响的研究主要集中在铜缺乏对血清中免疫球蛋白的影响，业已证实，铜缺乏小鼠[2-3]和大鼠[4]注射绵羊红细胞后，抗体形成细胞应答反应降低，结果导致铜缺乏小鼠和大鼠脾脏抗体产生受阻。

进一步的研究指出，铜缺乏大鼠[5]注射绵羊红细胞后血清抗体效价下降，以及对其它一种Ｔ细胞依赖抗原的血清免疫球蛋白Ｇ产生减少或抗体效价降低[6]。

严重缺铜大鼠IgM含量减少[7]。

喂以半纯合日粮，３０日龄牛补铜（11.5mg/kg日粮）组血清IgM含量和第２１天对溶血性巴氏杆菌抗原特异性抗体含量较不补铜组高[8]。

牛缺铜时对注射流产杆菌的抗体IgG效价降低[9]。

在人方面，刘纯锐等[10]报道低铜儿童（<5.6mg/kg）血液免疫球蛋白G、A、M（IgG、IgA和IgM）分别较正常儿童降低48.35%、27.59%和40.00%。

目前，国内外尚未见有高铜对雏鸡血清中免疫球蛋白含量影响的研究。

本研究以艾维茵肉鸡为研究对象，研究不同水平的高铜日粮对雏鸡血清中免疫球蛋白含量的影响，并探讨其作用机理，为生产实践中合理使用铜添加剂提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

一日龄艾维茵肉鸡420只,购于河南省新郑正大种禽场。

1.1.2　试验日粮

玉米-豆粕型基础日粮（Cu11mg/kg）作为对照组日粮,在对照组日粮中分别添加铜89mg/kg、189mg/kg、289mg/kg、389mg/kg、489mg/kg、589mg/kg构成6种不同的试验高铜日粮：

I组（Cu100mg/kg）、II组（Cu200）、Ⅲ组（Cu300mg/kg）、Ⅳ组（Cu400mg/kg）、Ⅴ组（Cu500mg/kg）、Ⅵ组（Cu600mg/kg）。

铜源为CuSO4．5H2O晶体。

其中蛋白质含量、能量以及维生素、微量元素舔加量均参照肉鸡NRC（1994）的营养标准。

详情见表1。

表1试验日粮组成和营养成分

组成（%）

对照组

高铜Ⅰ组

高铜Ⅱ组

高铜Ⅲ组

高铜Ⅳ组

高铜Ⅴ组

高铜Ⅵ组

玉米

60.74

60.71

60.67

60.63

60.59

60.55

60.51

豆粕

34.50

植物油

1.20

NaCl

0.30

Lys

0.20

Met

0.26

CaHPO4

1.30

CaCO3

1.20

CuSO4·5H2O

0.000

0.035

0.074

0.113

0.153

0.192

0.230

CP（%）

20.12

20.11

ME（Mcal/kg）

3.0169

3.0151

3.0131

3.0121

3.0111

3.0108

3.0103

Ca（%）

0.8769

0.8796

P（%）

0.6215

0.6203

0.6200

0.6187

0.6162

0.6153

Cu（mg）

11.00

100.00

200.00

300.00

400.00

500.00

600.00

注:

每公斤饲料添加维生素:

Vitamin.A,4000IU;Vitamin.D,250ICU;Vitamin.E,10IU;Vitamin.K3,1mg;Vitamin.B1,2mg;Vitamin.B2,4mg;Vitamin.B6,3mg;Vitamin.B12,0.1mg;nicotinicacid,27mg;folicacid,0.56mg;biotin,0.20mg;Capantothenate,12mg;cholinechlorine,0.5g.

每公斤饲料添加微量元素：

FeSO4.7H2O,337mg;MgSO4.7H2O,1g;CuSO4.5H2O,10mg;MnSO4,150mg;NaSeO,0.5mg;KI,0.458mg.

1.2　试验方法动物分组与饲养管理

一日龄艾维茵肉鸡420只随机分为7组,对照组和6个高铜组铜含量由低到高依次编为1组、2组、3组、4组、5组、6组。

每组60只，其中40只用于定期剖杀作动态观察，20只作全程临床观察。

七组雏鸡分别饲养于木制的试验禽笼内，自由饮水和采食对照组日粮和6种不同的试验日粮，每日清晨8：

00和下午2：

00分别记录温度变化，定时清扫卫生，试验期六周。

1.3采取样品及样品制备

试验开始后，全程观察试验雏鸡的临床症状，并从2、4、6周各个处理组随机选取4只，颈静脉采血致死，待血液自然凝固后，3000r/m离心10分钟，分离血清，-20℃保存，以备测定。

1.4血清中免疫球蛋白含量

方法采的测定用免疫比浊法。

免疫球蛋白测定试剂盒由四川迈克科技公司提供，按照其说明在新乡市中心医院免疫实验室测定。

以每ml血清中免疫球蛋白（Ig）的mg（mg/ml）作为含量单位。

1.5数据统计与分析

所有数据均经SPSS11.0统计软件统计。

各组数据均以X±SD表示，并用t检验分析试验组和对照组均数间差异的显著性。

2　结果与分析

2.1　临床观察

小四实验第一周，Ⅴ、Ⅵ组雏鸡采食量稍低于对照组，其余各组无明显变化。

实验第三周，Ⅵ组雏鸡生长发育落后于其他组，至第六周时，雏鸡缩头，羽毛粗乱，翅膀下垂，肛门周围染有污垢粪便，患鸡排淡红色或墨绿色粪便，严重者两肢麻痹，卧地不起或跛行，最后消瘦、衰竭而死。

20只全程观察雏鸡死亡2只，死亡率为10%。

Ⅴ组雏鸡精神萎靡，食欲轻度下降，生长发育受阻。

其余各组临床症状均不明显。

2.2血清中免疫球蛋白的变化

2．2．1IgG:

高铜Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组在整个实验期间差异均不显著（P>0.05）；高铜Ⅳ组在2、4周龄时差异不显著（P>0.05），6周龄时差异显著（P<0.05）；高铜Ⅴ组在2周龄时差异不显著（P>0.05），4、6周龄时差异显著（P<0.05）；高铜Ⅵ组在2周龄时差异显著（P<0.05），在4、6周龄时差异极显著（P<0.01）。

结果表明:

日粮含铜低于300mg/kg时,对雏鸡血清中IgG的含量无显著影响；当铜含量超过300mg/kg以上时，IgG含量显著或极显著低于对照组，严重影响了雏鸡的免疫功能。

详情见表2,图1。

表2高铜对雏鸡血清中IgG含量的影响（mg/ml）

组别

2周

4周

6周

对照组

6.18±0.53AB

6.32±0.21AC

6.57±0.16AC

Ⅰ组

6.28±0.08BC

6.46±0.43A

6.71±0.21A

Ⅱ组

6.22±0.39BC

6.40±0.36Aa

6.65±0.33Aa

Ⅲ组

6.15±0.64AC

6.31±0.10ACa

6.46±0.10Cac

Ⅳ组

6.14±0.25AC

6.27±0.14Cac

6.35±0.16bc

Ⅴ组

6.09±0.31ACa

6.12±0.28Bc

6.32±0.38bc

Ⅵ组

5.81±0.11a

5.99±0.16B

6.10±0.52B

图1高铜对雏鸡血清中IgG含量的影响（mg/ml）

2．2．2IgA:

高铜Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组在整个实验期间差异均不显著（P>0.05）；高铜Ⅴ组在2、4周龄时差异不显著（P>0.05），6周龄时差异显著（P<0.05）；高铜Ⅵ组在2、4周龄时差异显著（P<0.05），在6周龄时差异极显著（P<0.0１）。

结果表明:

日粮含铜在400mg/kg以下时,对雏鸡血清中IgA的含量无明显影响；当铜含量超过400mg/kg以上时，雏鸡血清中IgA的含量程度不同地低于对照组，影响了雏鸡的免疫功能。

详情见表3，图2。

表3高铜对雏鸡血清中IgA含量的影响（mg/ml）

组别

2周

4周

6周

对照组

1.23±0.62A

1.28±0.10AB

1.29±0.20AC

Ⅰ组

1.25±0.05A

1.30±0.12AC

1.33±0.05A

Ⅱ组

1.24±0.20A

1.29±0.36Ac

1.32±0.12ADa

Ⅲ组

1.20±0.40Aa

1.26±0.26Acd

1.28±0.23Ca

Ⅳ组

1.21±0.08Aa

1.25±0.17Abc

1.27±0.17Cbcd

Ⅴ组

1.19±0.20Aa

1.24±0.40BDc

1.23±0.28Bc

Ⅵ组

1.15±0.36a

1.20±0.60Db

1.22±0.31B

图2高铜对雏鸡血清中IgA含量的影响（mg/ml）

2．2．3IgM:

高铜Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组在整个实验期间差异均不显著（P>0.05）；高铜Ⅳ组在2、4周龄时差异不显著（P>0.05），在6周龄时差异显著（P<0.05）；高铜Ⅴ组在2、4周龄时差异不显著（P>0.05），在6周龄时差异极显著（P<0.0１）；高铜Ⅵ组在2周龄时差异显著（P<0.05），在4、6周龄时差异极显著（P<0.0１）。

结果表明:

日粮含铜低于300mg/kg时,对雏鸡血清中IgM的含量无显著影响；当铜含量超过300mg/kg以上时，雏鸡血清中免疫球蛋白IgM的含量程度不同地低于对照组，影响了雏鸡的免疫功能。

详情见表4，图3。

表4高铜对雏鸡血清中IgM含量的影响（mg/ml）

组别

2周

4周

6周

对照组

1.07±0.20AB

1.13±0.15AC

1.22±0.12AC

Ⅰ组

1.09±0.04A

1.17±0.05A

1.24±0.23A

Ⅱ组

1.08±0.06A

1.16±0.10ADa

1.23±0.03AD

Ⅲ组

1.05±0.77Ab

1.12±0.28Ca

1.19±0.06Cabc

Ⅳ组

1.05±0.96AC

1.11±0.02Cbcd

1.18±0.17Bcd

Ⅴ组

1.03±0.36Cb

1.08±0.22Bc

1.15±0.10BE

Ⅵ组

1.02±0.11bc

1.06±0.15B

1.12±0.12E

图3高铜对雏鸡血清中IgM含量的影响（mg/ml）

3　讨论

免疫系统担负着调节细胞间多种生理功能的任务，免疫球蛋白就是发挥这些重要调节功能的蛋白质之一。

免疫球蛋白主要是由脾脏淋巴结和淋巴组织内的浆细胞所产生的，是具有抗体活性、能与相应抗原呈特异性结合的蛋白质，普遍存在于血液、组织液及外分泌液中，在免疫应答中产生重要作用。

IgG、IgA、IgM是在机体体液免疫中较为重要的三种特异性抗体。

IgG在血清中含量最高，约占免疫球蛋白总量的75%，由于其相对较小，较其他免疫球蛋白更易从血管渗出，因而IgG更易参与组织间和体表防御作用；IgG是血液中主要抗体成分，发挥重要的免疫学效应，如调理吞噬、ADCC、沉淀抗原、中和病毒和毒素的作用，能经过经典途径激活补体，是机体抗感染的主要抗体[11]。

IgA是富含碳水化合物的免疫球蛋白，主要是由肠系膜淋巴组织中的浆细胞所产生的，血清IgA具有多种抗体活性，占血清免疫球蛋白总量的10%左右；IgA能中和病毒，对机体局部抗病毒感染起重要作用[11]。

IgM是B细胞产生最早的免疫球蛋白分子，也是在B细胞表面表达最早的抗体，是B细胞表面的抗原受体，是B细胞分化过程中主要的表面标志；IgM抗体中和病毒的能力不如IgG抗体，但固定补体的能力很强，故对依赖补体破坏病毒感染细胞以及对包膜病毒的溶解均有重要作用[11]。

本实验结果表明，高铜Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组雏鸡血清中免疫球蛋白含量在整个试验期间与对照组比较差异均不显著，高铜Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组雏鸡血清中免疫球蛋白含量均随日粮中含铜量的增加、雏鸡日龄的增长，程度不同地低于对照组，差异显著或极显著。

由此我们可以看出，一定量的高铜（低于300mg/kg）对雏鸡血清中免疫球蛋白含量无显著影响，进一步表明了一定量的高铜对雏鸡血清中B淋巴细胞含量及体液免疫功能无明显影响；随着饲用高铜日粮时间的延长，高铜Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组雏鸡血清中免疫球蛋白含量与对照组比较差异显著或极显著（P<0.05或P<0.01），表明日粮中超过一定量（300mg/kg以上）的高铜会程度不同地抑制雏鸡血清中免疫球蛋白的生成，抑制了雏鸡的体液免疫功能。

作者认为高铜对雏鸡血清中免疫球蛋白含量影响结果不同的原因可能是：

饲喂一定量高铜日粮后，雏鸡血清铜和组织中铜含量增高，铜作为外界抗原刺激脾脏边缘区巨噬细胞的吞噬，吞噬细胞携带抗原至白髓的脾小结处，刺激休止期Ｂ淋巴细胞由Ｇ０期向Ｇ１期过渡，导致Ｂ淋巴细胞分化增殖，形成生发中心，之后B淋巴细胞由脾小结处迁移至边缘区和红髓，在抗原刺激下增殖分化为浆细胞[11]，浆细胞在胞核指导下，线粒体提供能量，在粗面内质网中合成IgG、IgA、IgM等免疫球蛋白分子，导致雏鸡血清中免疫球蛋白含量增高，本实验300mg/kg以下高铜组对雏鸡血清中免疫球蛋白含量的影响与对照组比较差异不显著，原因可能是Ｂ淋巴细胞对一定量的高铜（300mg/kg以下）不敏感,这与Dove给伺喂5mg/kg和250mg/kg铜猪注射SRBC,铜添加水平不影响SRBC抗体效价[12]具有相似性。

法氏囊是禽类一个重要的中枢免疫器官,为禽类所特有[13],它对体液免疫的形成和功能具有特别重要的作用；禽类B淋巴细胞在法氏囊中发育成熟后，迁移至外周免疫器官（脾脏），激活分化为浆细胞，产生抗体参与体液免疫；脾脏中B细胞约占60%，是产生抗体的主要基地，脾脏淋巴小结是B淋巴细胞的寄宿点。

根据结构功能原理，当免疫细胞结构受到破坏时，其免疫功能也会受到损伤。

400mg/kg以上高铜组程度不同地抑制了雏鸡血清中免疫球蛋白的含量，原因可能是铜过量雏鸡血清中铜含量显著高于正常组，血清铜蓝蛋白活性显著低于对照组，导致雏鸡体内自由基或／和过氧化物堆积，损害膜系统和膜结构，组织细胞出现程度不同的病变，淋巴免疫器官的实质细胞出现变性坏死[14-15]，法氏囊、脾脏等免疫器官组织结构发生病理变化,致使Ｂ淋巴细胞增殖、分化、成熟过程发生障碍，浆细胞数量生成减少，雏鸡血清中免疫球蛋白含量相应降低,导致机体体液免疫功能受损。

这与吴建设等报道肉仔鸡饲喂的低铜（3.03mg/kg）半纯合日粮中，添加440mg/kg铜会导致B细胞对LPS刺激的应答反应降低，同时对马立克氏病弱毒疫苗（HVT）和新城疫弱毒疫苗的抗体ELISA效价也降低[16]具有相关性。

生产中，高铜作为雏鸡的促生长剂得到了广泛的应用。

本实验结果表明，300mg/kg以下的高铜量对雏鸡机体血清中免疫球蛋白含量无显著影响，而高于300mg/kg的高铜量导致雏鸡血清中免疫球蛋白含量程度不同地低于对照组。

同时有资料显示添加高铜时，血清中部分酶的活性发生改变[14-15]；也有报道当铜添加量达到150mg/kg时，肉铜含量明显上升[17]。

所以补铜必须慎重，防止过量补铜对动物机体的毒副作用，及间接对人类健康的危害。

参考文献

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