DNA电泳常见问题分析.docx
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DNA电泳常见问题分析
DNA电泳常见问题
凝胶电泳操作注意事项
1、琼脂糖：
不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移
及荧光背景的强度，应有选择地使用。
2、凝胶的制备：
凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶化的凝胶应及时
倒入板中，避免倒入前凝固结块。
倒入板中的凝胶应避免出现气泡，以免影响电
泳结果。
3、电泳缓冲液：
为保持电泳所需的离子强度和pH，应经常更新电泳缓冲液。
4、样品加入量：
一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5μg的DNA量,加样量的
多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定.当加样孔大时,样品上样
量应相应加大,否则会造成条带浅甚至辨认不清;反之则应适当减少加样量，但是
上样量过多会造成加样孔超载，从而导致拖尾或弥散，对于较大的DNA此现象更
明显。
5、DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条
件以消除这种影响。
6、DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。
采用不同浓
度的凝胶有可能分辩范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范
围来决定凝胶的浓度。
小片段DNA的检测应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，以提高分
辨率。
7.选择的实验材料要新鲜，处理时间不易过长。
8.在加入细胞裂解缓冲液前，细胞必须均匀分散，以减少DNA团块形成。
9.提取的DNA不易溶解：
不纯，含杂质较多；加溶解液太少使浓度过大。
沉淀物
太干燥，也将使溶解变得很困难。
10.电泳检测时DNA成涂布状：
操作不慎；污染核酸酶等。
11.分光光度分析DNA的A280/A260小于1.8；不纯，含有蛋白质等杂质。
在这种情况下，应加入SDS至终浓度为0.5%，并重复步骤2～8。
12.酚/氯仿/异戊醇抽提后，其上清液太黏不易吸取：
含高浓度的DNA，可加大抽
提前缓冲液的量或减少所取组织的量
DNA电泳常见问题分析之一
1请问配制聚丙烯酰胺凝胶电泳胶时，促凝的是TEMED还是过硫酸铵？
胶
聚时间很长如何解决？
过硫酸铵提供驱动丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合所需的自由基，而TEMED通过催
化过硫酸铵形成自由基而加速它俩的聚合。
胶聚合时间长可能是TEMED失效了，
过硫酸铵固体时间过久也会失效的。
一个让PAGE胶很快聚合的方法：
不要先配AP（过硫酸铵）溶液，因为AP很容易变质。
在保证TEMED和AP质
量的情况下，每次配胶时，直接称一定量的AP粉剂溶入液体状态的PAGE中，
这样可以保证AP的催化能力，而且可以多加一点。
配25ml的PAGE胶，加0.03
克AP粉剂，最后加入25ulTEMED，20分钟左右就可以凝固（当然这个时候拔梳子，会有少量未凝固的PAGE在孔里形成丝状干扰，使加的样品看起来不太漂亮，但一般不影响跑胶效果和条带的形状和位置）。
2DNA电泳的MARKER怎么是扭曲的？
1、配制胶时的缓冲液需要和电泳缓冲液不是同时配制的.最好是同时配制.电泳时
缓冲液高过液面1－2mm即可。
2、电泳时电压过高,可以在电泳前15分钟用较低电压（3V/cm）,等条带出孔后比较
漂亮了.然后再调电压。
3、上样时尽量慢慢加样,等样品自然沉降后再加电压。
3跑出的DNA带模糊？
1、DNA降解：
避免核酸酶污染。
2、电泳缓冲液陈旧:
电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲
能力减弱，从而影响电泳效果。
建议经常更换电泳缓冲液。
3、所用电泳条件不合适:
电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA
链电泳，温度应＜15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。
4、DNA上样量过多：
减少凝胶中DNA上样量。
5、DNA样含盐过高：
电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。
6、有蛋白污染：
电泳前酚抽提去除蛋白。
7、DNA变性：
电泳前勿加热，用20mMNaCl缓冲液稀释DNA。
4有不规则DNA带迁移?
1
、对于λ/HindIII片段cos位点复性：
电泳前于65℃加热DNA5分钟，然
后在冰上冷却5分钟。
2
、电泳条件不合适：
电泳电压不超过
20V/cm；温度＜30℃；经常更换电泳
缓冲液。
3、DNA变性：
以20mMNaClBuffer稀释DNA，电泳前勿加热。
5跑出的DNA条带带弱或无DNA带？
1、DNA的上样量不够：
增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂
糖电泳灵敏度稍高，上样量可适当降低。
2、DNA降解：
避免DNA的核酸酶污染。
3、DNA走出凝胶：
缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。
4、对于EB染色的DNA，所用光源不合适?
?
应用短波长（254nm）的紫外
光源。
6跑出的DNA带缺失不完整是怎么回事?
1、如果是小DNA带走出凝胶，可以缩短电泳时间或降低电压或增强凝胶浓
度。
2
、分子大小相近的DNA带不易分辨?
?
增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度。
3
、DNA变性：
电泳前请勿高温加热DNA链，以20mMNaClBuffer稀释
DNA。
DNA链巨大，常规凝胶电泳不合适?
?
在脉冲凝胶电泳上分析。
7做PCR电泳后跑电泳，目的基因是489BP的，结果每次切胶回收后再跑电泳就变成500多了，快到600了？
为什么？
有时只靠电泳结果判断是不准确的，同样的片段每次跑的远近会有不同。
有
经验显示目的片段是1300多，结果就跑到1000的marker下面去了，后来证实
片段没有问题。
也有做的一个片段也是这样，是490BP.理论上两个条带一样，可
是PCR结果显示就是大小不一致。
然后回收以后的检测结果又全部都一样了，后来又拿去做了下一个测序，才知道根本没有问题。
8：
为什么marker条带非常模糊，无法辨别具体条带？
A：
出现上述情况，可能有以下几个原因：
1.marker条带出现了降解。
请确保在使用过程中避免核酸酶污染；2.电泳
缓冲液陈旧。
电泳缓冲液多次使用后，离子浓度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，
从而影响电泳效果，建议经常更换电泳缓冲液；3.电泳条件不合适。
电泳时电压
应不超过20V/cm，温度应低于30℃；4.marker上样量过多。
请根据说明书选用
合适上样量；5.凝胶质量不好。
建议使用质量较好的琼脂糖；此外，凝胶凝固
不均匀也会导致条带模糊。
9：
为什么marker条带出现不规则的条带（如哑铃状等）？
A：
出现上述情况，多与以下几个原因有关：
1.电泳缓冲液陈旧。
老化的电
泳缓冲液离子浓度降低，pH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果，建议经
常更换电泳缓冲液；2.电泳条件不合适。
电泳时电压应不超过20V/cm，电压太高
可能也会导致marker条带出现不规则现象。
此外，凝胶质量差以及凝胶冷却时凝
固不均匀也会导致该现象出现。
10为什么marker条带非常弱或者根本没有条带？
A：
出现上述情况可能是：
1.marker上样量较低，可适当增加上样量；2.凝
胶质量较差或凝胶凝固不均匀也会导致电泳条带弱或根本没有条带；3.电泳时间
过长导致marker条带跑出凝胶，可缩短电泳时间，降低电压，增加凝胶浓度。
11：
为什么marker缺带？
A：
对于含有较小片段的marker，如果出现缺带现象，可能是因为：
1.小条带跑出凝胶或分子量大小非常相近的条带不易辨认所致，可适当缩短
电泳时间，降低电压，同时增加凝胶浓度；
2.凝胶中
EB含量过低，导致大片段
结合EB量太少或没有，在紫外光下亮度太低，可适当增加
EB用量。
问
原因
解决办法
题
D
DNA
避免核酸酶污染
NA降解
带模
电泳缓
电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，
pH值上升，缓
糊冲液陈旧冲能力减弱，从而影响电泳效果。
建议经常更换电泳缓冲液
电泳时电压不应超过20V/cm，温度＜30℃；巨大DNA
所用电
链电泳，
泳条件不合
温度应＜15℃；核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲
适
能力
DNA
上样量过多
DNA
样含盐过高
减少凝胶中DNA上样量
电泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐
有蛋白
电泳前酚抽提去除蛋白
污染
DNA
电泳前勿加热，用20mMNaCl缓冲液稀释DNA
变性
对于
λ/HindIII片
不电泳前于65℃加热DNA5分钟，然后在冰上冷却5分钟
段cos位点
规则
复性
DNA
带迁
电泳条
电泳电压不超过20V/cm；温度＜30℃；经常更换电泳缓
移
件不合适
冲液
DNA
以20mMNaClBuffer稀释DNA，电泳前勿加热
变性
DNA
增加DNA的上样量；聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳
带
的上样量不
弱或
够
灵敏度稍高，上样量可适当降低
无DNA
降解
DNA
带
DNA
走出凝胶
对于
EB
染色的
DNA，所用
光源不合适
小
DNA
带走
出凝胶
分子大
D
NA
小相近的
带缺
DNA
带不
失
易分辨
DNA
变性
DNA
链巨大
问题
可
能原因
避免DNA的核酸酶污染
缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度
应用短波长（254nm）的紫外光源
缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度
增加电泳时间，核准正确的凝胶浓度
电泳前请勿高温加热DNA链，以20mMNaClBuffer稀
释DNA
常规凝胶电泳不合适在脉冲凝胶电泳上分析
解决方法
DN核每次吸取时更换灭菌枪头，勿将电泳缓冲液带入管中；
AMarker
酸酶污用后密闭4°C保存
降解
DN
AMarker
无法正确
分离
条带
黯淡
染
保4°C或-20°C保存，避免多次反复冻融；不可加热
存不当
琼使用质量可靠的琼脂糖制胶
脂糖质
量差
电更换缓冲液
泳缓冲
液多次
使用后
失效
核增加上样量
酸浓度
过低
核使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品
酸降解
D提高上样量；避免使用与目的片段迁移率相同的示踪染
NA条
料
带被示
踪染料
掩盖
条带电更换缓冲液
模糊或弥泳缓冲
散液多次
使用后
失效
核使用不含核酸酶的试剂和耗材制备样品
酸部分
降解
核酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质
酸样品
纯度
差，含
有
DNA
结合蛋
白或高
浓度的
盐份
电根据凝胶大小和电泳缓冲液类型，使用适当的电压进行
压过电泳
低，电
泳时间
过长
染
色时间
过长或
拍照前
放置过
久，
DNA
条带弥
散
条带D
NA条
缺失
带分子
量过大
分
子量接
近的
DNA
条带没
有分开
电
泳缓冲
液使用
不当
电泳结束后及时观察、拍照
使用脉冲凝胶电泳
选择适当的凝胶浓度进行电泳
SD和TBE缓冲液适于分析较小分子量的DNA片段，大
片段分子不能完全分离；TAE缓冲液不适于分离很小的DNA
片段
电
泳时间
过长或
电压过
高
，
DNA
走出凝
胶
电
极
插
反
，
DNA
走出凝
胶
条带
核
大小不正
酸降解
确
或形成
聚合物
λ
DNA
酶
切
Marker
的cos
缩短电泳时间，调整电压
正确连接电极方向
加热处理或重新制备样品
电泳前65°C加热5分钟，冰上冷却5分钟以后再上样
位点复
性
相判断DNA分子是否有特殊结构，如缺口、超螺旋、二聚
同分子体等；富含AT碱基的DNA迁移率比同分子量富含GC碱基
量的的DNA片段慢
DNA
片段由
于结构
或序列
的差异
而有不
同的迁
移率
梳使用完好的梳子制胶
子变
形，点
样孔不
在同一
水平线
上
带型不选用相同的上样缓冲液，上样量尽可能接近
异常同样本
的上样
条件不
同
上选择合适大小的上样孔，样品应完全覆盖点样孔底部
样量过
大或过
小
核酚/仿抽提或乙醇沉淀去除蛋白、盐份等杂质
酸样品
纯度
差，含
有
DNA
结合蛋
白或高
浓度的
盐份
电上样和电泳时，确保缓冲液始终能完全覆盖凝胶
泳缓冲
液未完
全浸没
凝胶
电根据凝胶大小和电泳缓冲液类型，使用适当的电压进行
压过高电泳
或电泳
时间过
长致使
凝胶过
热和
DNA
变性
凝加入EB时充分混匀或电泳结束后再染色
胶中加
入EB
造成染
色不均
凝
使用纯水和洁净容器制胶；缓慢灌胶，并赶除气泡
胶中有
气泡或
污染物
点
待凝胶完全凝聚后再取出梳子；
样孔质
量差
升级会员 