参考westernblotting.docx

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参考westernblotting

Westernblot

原理：

通过电泳区分不同的组分，并转移至固相支持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进行检测，蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）中等大小的靶蛋白。

一、抗原的选择和制备

A：

样品的制备

1组织：

组织的处理方法：

组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS，0℃研磨，加入5×STOPbuffer，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins离心，取上清。

加入β-ME（9.5ml加入0.5ml），溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。

2细胞：

细胞的处理方法：

离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOPbuffer，收集，180W，6mins，0℃超声波破碎，5000rpm，5mins离心，取上清。

加入β-ME（9.5ml加入0.5ml），溴酚蓝（9.5ml加入0.5ml）煮沸10min，分装后于-20℃保存，用时取出，直接溶解上样。

3分泌蛋白的提取（特例）：

直接收集分泌液，加入β-ME、溴酚蓝制样。

B：

蛋白的定量方法及影响蛋白定量原因

1.双缩脲法：

双缩脲法是第一个用比色法测定蛋白质浓度的方法。

在需要快速，但不很准确的测定中，常用此法。

硫铵不干扰显色，这对蛋白质提纯的早期阶段是非常有利的。

双缩脲法的原理是Cu2+与蛋白质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝色络合物，此物在540nm波长处有最大吸收。

双缩脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白质溶液测定。

干扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。

可用沉淀法除去干扰物，即用等体积10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白质，然后弃去上清液，再用已知体积的1mNaOH溶解沉淀的蛋白质进行定量测定。

2.Lowry法：

此法是双缩脲法的进一步发展。

他的第一步就是双缩脲反应，即Cu++与蛋白质在碱性溶液中形成络合物，然后这个络合物还原磷钼磷-磷钨酸试剂（福林-酚试剂），结果得到深蓝色物。

此法比双缩脲法灵敏得多，适合于测定20mg/L～400mg/L含量的蛋白质溶液。

其干扰物质与双缩脲法相同，而且受他们的影响更大，硫醇和许多其他物质的存在会使结果严重偏差。

另外要注意的是，加入福林试剂时要特别小心，试剂只在酸性pH环境中才稳定，上述提到的还原反应只有在pH10时才发生，因此，福林试剂加入到碱性的Cu2+-蛋白质溶液中时，必须立刻搅拌，以使磷钼酸-磷钨酸试剂在未被破坏之前能有效地被Cu2+-蛋白质络合物所还原。

3.紫外吸收法：

大多数蛋白质在280nm波长处有特征的最大吸收，这是由于蛋白质中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的缘故，因此，利用这个特异性吸收，可以计算蛋白质的含量。

如果没有干扰物质的存在，在280nm处的吸收可用于测定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白质溶液。

部分纯化的蛋白质常含有核酸，核酸在260nm波长处有最大吸收。

4.Bradford比色法：

Bradford比色法比Lowry法测定蛋白浓度更简单迅速。

用脱氧胆酸/三氯乙酸沉淀蛋白可排除甘油、去污剂、2-巯基乙醇、乙酸、硫酸铵、Tris和一些碱性缓冲系统的干扰。

分别在两组微量离心管中各加入0.5mg/ml牛血清白蛋白（5，10，15和20祃），以0.15mmol/lNaCl补足至100祃，同时以两管100祃的0.15mmol/lNaCl作空白对照。

每管各加入1ml考马斯亮蓝染料溶液，振荡混匀，室温放置2分钟。

用1cm光径的微量比色杯测A595，取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画标准曲线，并测量待测样品的A595。

从BSA标准曲线中确定待测样品的浓度。

测定10-100礸的蛋白质，要在较大试管中将染料溶液体积增大5倍进行。

样品浓度过高，可稀释后进行，或在10-100礸另作一标准曲线进行测定。

5．电泳估算法（我们选择此法）：

样品倍比稀释，SDS-PAGE电泳，同时做定量marker对照，可以估算样品大概浓度。

以提取癌组织总蛋白为例：

①取等量胰腺癌组织、癌旁组织及正常胰腺组织，用dH2O漂洗5～10次，再用预冷的1×PBS洗涤3次，目的是去除样本中的血液。

②每2克组织加入3ml1×PBS匀浆，保持在4℃条件进行。

③加入5×STOPBuffer缓冲液1ml，混匀，4℃下超声碎化。

再加入0.5mlβ-ME，0.5ml溴酚蓝，煮沸10mins，至此，制样过程完成；

④SDS-PAGE电泳，以BAS作为对照估计样品蛋白浓度。

二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳（SDS－PAGE）

A：

实际操作

1.做胶前的准备

1）检查是否有足够的、干净的spacer、comb和架子。

2）检查是否有新鲜的，足量10%APS，没有立刻重配。

3）按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小，计算出胶的浓度，并算出分离胶各组分的用量。

2.制胶，电泳

1）装好架子。

2）按照下面配方配制分离胶。

（单位：

ml，Total：

8ml）

7.5％10％15%

2×Sep.buffer444

30％Gel.sol2.02.74

ddH2O1.91.20

TEMED8ul8ul8ul

10%APS80ul0ul80ul

在胶上面加入一层蒸馏水，促进胶更好的凝集。

3）待分离胶凝集后，配制浓缩胶。

（单位：

ml，Total：

3.5ml）

3％

2×Stacking.buffer1.7

30％Gel.sol0.35

ddH2O1.4

TEMED5ul

10%APS50ul

倒好后插入预先准备好的梳子。

4）待胶凝集好后，上样，电泳。

上层胶用60-80V电压，当样品至分离胶时，用100-120V电压。

一般电泳时间在1.5小时左右。

B：

注意事项及常遇到的问题

1）分离胶不要倒的太满，需要有一定的浓缩胶空间，否则起不到浓缩效果。

2）上样蛋白量不应超过30ug/mm2（载荷面即：

如果你的胶槽是5mm×1mm，则载荷面为：

1mm×5mm=5mm2）。

3）gel通常在0.5-1h内凝集最好，过快表示TEMED、APS用量过多，此时胶太硬易龟裂，而且电泳时容易烧胶。

太慢则说明两种试剂用量不够或者系统实际不纯或实效。

4）混合搅拌速度太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形。

太慢不均匀，特别是甘油。

5）电泳中常出现的一些现象：

︶条带呈笑脸状，原因：

凝胶不均匀冷却，中间冷却不好。

︵条带呈皱眉状，可能是由于装置不合适，特别可能是凝胶和玻璃挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。

拖尾：

样品溶解不好。

纹理（纵向条纹）：

样品中含有不溶性颗粒。

条带偏斜：

电极不平衡或者加样位置偏斜。

条带两边扩散：

加样量过多。

三、转移

在电流的作用下，使蛋白质从胶转移至固相载体（膜）上。

膜的选择：

印迹中常用的固相材料有NC膜、DBM、DDT、尼龙膜、PVDF等。

我们选用PVDF（聚偏二氟乙烯），其具有更好的蛋白吸附、物理强度，以及具有更好的化学兼容性。

有两种规格：

Immobilon-P（0.45um）和Immobilon-PSQ（0.2umforMW<20kDa）。

A半干法

即将凝胶夹层组合放在吸有转印缓冲液的滤纸之间，通过滤纸上吸附的缓冲液传导电流，起到转移的效果。

因为电流直接作用在膜胶上，所以其转移条件比较严酷，但是其转移时间短，效率高。

1实验条件的选择

电流1mA-2mA/cm2，我们通常100mA/膜，按照目的蛋白分子大小、胶浓度选择转移时间，具体可以根据实际适当调整。

目的蛋白分子大小（kDa）胶浓度转移时间

80---1408%1.5-2.0

25---80101.5

15--40120.75

<20150.5

2实验操作

（1）滤纸和膜的准备（在电泳结束前20分钟应开始准备工作）。

A.检查是否有足够的transferbuffer，没有立即配制。

B.检查是否有合适大小的滤纸和膜。

C.将膜泡入甲醇中，约1-2分钟。

再转入transferbuffer中。

D.将合适的靠胶滤纸和靠膜滤纸分别泡入transferbuffer中。

PDVF膜在进转移缓冲液时，要在甲醇里面泡多长时间?

PVDF是疏水性的，在转膜缓冲液里很难浸透，甲醇处理后使更容易浸润。

PVDF的预处理是用甲醇浸泡活化，浸泡透之后转入蒸馏水洗两次。

用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合。

一般5-20分钟都有人在用。

可在取胶的同时泡，估计前后5分钟左右。

效果还不错。

以前有站友发贴，说处理时间没多大关系，关键看膜的质量．确实是这样的。

只要让膜完全浸透应该就没问题了。

Hybond的PVDF说明书这样的写的：

“pre-wetthemembranein100%methanol（10seconds）”。

我的理解是，至少10秒钟，多泡下也没关系的，事实上，泡10秒的做过，10分钟的也做过，都没有问题的。

（2）转移

A.在电转移仪上铺好下层滤纸。

一般用三层。

B.将膜铺在靠膜滤纸上，注意和滤纸间不要有气泡，再倒一些transferbuffer到膜上，保持膜的湿润。

C.将胶剥出，去掉stackgel，小心的移到膜上。

D.剪去膜的左上角，在膜上用铅笔标记出胶的位置。

E.将一张靠胶滤纸覆盖在胶上。

倒上些transferbuffer，再铺两张靠胶滤纸。

F.装好电转移仪，根据需要选定所需的电流和时间。

G.转移过程中要随时观察电压的变化，如有异常应及时调整。

3注意事项及常遇到的问题

1）滤纸、胶、膜之间的大小，一般是滤纸>=膜>=胶？

2）滤纸、胶、膜之间千万不能有气泡，气泡会造成短路。

3）因为膜的疏水性，膜必须首先在甲醇中完全浸湿。

而且在以后的操作中，膜也必须随时保持湿润（干膜法除外）。

4）滤纸可以重复利用，上层滤纸（靠膜）内吸附有很多转移透过的蛋白质，所以上下滤纸一定不能弄混，在不能分辨的情况下，可以将靠胶滤纸换新的。

5）转移时间一般为1.5小时，（1mA-2mA/cm2，10%gel），可根据分子量大小调整转移时间和电流大小。

1）在叠膜、胶、纸三明治时候，操作于盛有转膜Buffer的大平皿中进行，叠好后，再将三者平行转移至转膜装置，切勿再移动，因为在buffer中操作，已经完全排除了气泡存在的可能，无需再赶气泡

2）关于转膜时间：

半干转的话，20V×30min即可

B湿法

我们基本上不用此方法，这里暂不做介绍。

C转移后效果的鉴定

1．染胶

用考马斯亮兰染色经destain脱色后，看胶上是否还有蛋白来反映转移的效果。

2．染膜

有两类染液选择，可逆的和不可逆的。

可逆的有ponceau-sred、FastgreenFC、CPTS等，这类染料染色后，色素可以被洗掉，膜可以用做进一步的分析用。

但是不可逆的染料，如考马斯亮兰、indiaink、Amido.black10B等，染色后膜就不能用于进一步的分析。

四、封闭（block）

封闭是为了使我们的抗体仅仅只能跟特异的蛋白质结合而不是和膜结合。

常用的封闭液有bovineserumalbumin（BSA），non-fatmilk，casein，gelatin，tween-20等，我们一般用non-fatmilk。

在转移结束前配好5%的Milk（TBST溶解）。

转移结束后将膜放入milk中block（一定要放在干净的容器里，避免污染而且要足以覆盖膜），并清洗整理好用过的滤纸，以便下次使用。

Block4°CO/N，或RT1小时。

封闭后可以不洗膜，让膜的一角在吸水纸上接触，把封闭液控一下即可

五、孵育一抗

A.先将需要检测的抗体准备好，并决定好它们的稀释度。

B.配好5%的Milk（TBST溶解），按要求稀释好抗体。

注意，如需高比例稀释，

最好采用梯度稀释。

C.将稀释好的抗体和膜一起孵育。

一般采用RT1小时，可根据抗体量和膜上

抗原量适当延长或缩短时间。

注意：

为了便于后面分析结果，我们一般会选用已确定分子量大小而且纯度高的抗体作为marker与一抗同时孵育。

六、洗涤

用TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉。

然后5mins×5。

洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅。

七、孵育二抗

孵育RT1小时。

一般采用HRP标记的二抗，稀释比例为1:

5000。

二抗的稀释比例不能太低，否则容易导致非特异性的结合。

注意二抗的选择有多种，要根据一抗来选择抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗，以及根据后面的显色条件来选择HRP、AP或者GOD（葡萄糖氧化酶）酶链的二抗或者标志其他探针（如核素等）的。

八、洗涤

用TBST先快速洗三次，把milk尽快的wash掉。

然后5mins×5。

洗涤是为了洗去二抗的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结果背景的深浅，所以洗涤一定要干净。

九、显色（HRP酶）

1．增强化学发光法（ECL）

Ecl显色原理：

氨基苯二酰肼类主要是鲁米诺及异鲁米诺衍生物，是最常用的一类化学发光剂。

鲁米诺（luminol，5＇-氨基-2，3-二氢-1，4-酞嗪二酮）的分子结构及化学反应式如下：

　　鲁米诺在免疫测定中既可用作标记物，也可用作过氧化物酶的底物。

在Ecl底物中，含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来。

试验步骤：

1）将两种显色底物1：

1等体积混合（一般各1ml/membrane）。

2）将混合物覆盖在膜表面，1-2分钟，摇晃使均匀。

3）用保鲜膜把膜包起来，放入夹板中。

4）在暗室中将X光片，覆盖在膜的上面，夹好夹子，曝光1min。

5）显影、定影。

6）根据结果调整曝光时间和曝光区域，得到最佳结果。

注意：

荧光在一段时间后会越来越弱。

2.DAB显色

DAB（3,3二氨基联苯胺）和HRP反应产生棕色的不溶终产物。

这种棕色沉淀不溶于酒精和其它有机溶剂，对于必需使用传统复染和封固介质的免疫组化染色应用特别理想。

对于AP标记的二抗我们选用BCIPandNBT显色，它们在碱性磷酸酶（AP）作用下反应可生成一种不溶性黑紫色沉淀的强信号。

Western显色

ECL灵敏度比DAB高不少

杂带多的原因无非是几点：

1、你的一抗如是多克隆抗体，可以试着降低一抗的浓度，如一抗是单抗，可适当降低二抗的浓度

2、还有最重要的是确保封闭的充分，封闭最好时间长点，至少2小时室温封闭，时间允许可4度过夜封闭

3、就是洗膜一定要充分，我们一般PBST10分钟三次，还有看你是DAB显色吧，背景过深，DAB显色时间不要过长，一般2分钟足够。

做一个好的阴性和阳性对照。

这样出来的带该在哪个位置，不该在哪个位置一目了然

十、分析结果及其判断

常见问题原因分析及处理方法：

见附录一、二。

附录一：

TroubleshootingBlottingProblems（P43－48）

附录二：

WesternBlottingTroubleshootingLogicTree（P390－394）

附录三：

试验中所用到的试剂和缓冲溶液

1）5xStopSolution（Samplebuffer）pH6.7:

Stock:

touse:

20%Glycerol100mltake9.5mlstock

10%SDS50gor250ml20%SDSaddBME0.5ml

250mMTris15.14gbromphenolblueor

total475.00mlpyronine4totaste

2）Gelsolution（30%w/vacrylamidemix）:

0.8bis-acrylamide0.8g

29.2%acrylamide29.2g

total100ml

3）2xLaemmliSeparationBuffer:

0.75MTris-HCl90.825g

0.2%SDS10ml20%SDS

total1000ml

pH8.8

4）2xLaemmliStackingBuffer:

0.25MTris15.14g

0.2%SDS1g

total500ml

pH6.8

5）10xLaemmliRunningBuffer:

250mMTris60.55g

1.9MGlycine285.27g

1%SDS20g

total2liters

pH8.3

6）TransferBuffer:

48mMTrisbase5.81g

39mMGlycine2.93g

0.037%SDS0.375g

20%MeOH200ml

total1000ml

7）TBST:

10mMTris-HCl，1.21g

100mMNaCl

0.2%Tween-20

Total1000ml

pH7.4

8）CoomassieStain:

40%MeOH400ml

10%HAc100ml

0.1%BBR1gBrilliantBlueR

total1000ml

9）Destain:

30%MeOH300ml

7.5%HAc75ml

total1000ml

10）10×丽春红染液配方：

丽春红2g

磺基水杨酸30g

三氯醋酸30g

total100ml

11）DAB

DAB50mg

0.05mol/LTB（PH7.6）100ml

30%H2O230-40ul

先配成2-5倍的储存液，过滤后分装，-20℃避光保存，H2O2在工作液中终浓度0.01％

不显影不一定是抗原性丧失，Westernblot环节多，一抗和二抗原因是wb中比较难掌握准的环节。

WesternBlot详解（原理、分类、试剂、步骤及问题解答）

Western免疫印迹（WesternBlot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。

对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。

本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下WesternBlot技术:

一、原理

二、分类

i.放射自显影

ii.底物化学发光ECL

iii.底物荧光ECF

iv.底物DAB呈色

三、主要试剂

四、主要步骤

五、实验常见的问题指南

1.参考书推荐

2.针对样品的常见问题

3.抗体

4.滤纸、胶和膜的问题

5.Marker的相关疑问

6.染色的选择

7.参照的疑问

8.缓冲液配方的常见问题

9.条件的摸索

10.方法的介绍

11.结果分析

一、原理

与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。

经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。

以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

二、分类

现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。

只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：

反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。

三、主要试剂

1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热（以利于溶解双丙稀酰胺）的去离子水配制含有29%（w/v）丙稀酰胺和1%（w/v）N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。

）储于棕色瓶，4℃避光保存。

严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。

使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。

如有沉淀，可以过滤。

2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:

10%（w/v）0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。

3、分离胶缓冲液:

1.5mmol/LTris-HCL（pH8.8）:

18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。

过滤后40C保存。

4、浓缩胶缓冲液:

0.5mmol/LTris-HCL（pH6.8）:

6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml1mol/LHCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。

过滤后40C保存。

这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。

5、TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。

PH太低时，聚合反应受到抑制。

10%（w/v）过硫酸胺溶液。

提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。

去离子水配制数ml，临用前配制.

6、SDS-PAGE加样缓冲液:

pH6.80.5mol/LTris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O32ml混匀备用。

按1:

1或1:

2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。

7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:

30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/LTris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。

临用前稀释10倍。

8、转移缓冲液：

配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37gSDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。

9、丽春红染液储存液：

丽春红S2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30g加水至100ml用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。

使用后应予以废弃。

10、脱脂奶粉5%（w/v）。

11、NaN30.02%叠氮钠（有毒，戴手套操作），溶于磷酸缓冲盐溶液（PBS）。

12、Tris缓冲盐溶液（TBS）:

20mmol/LTris/HCL（pH7.5），500mmol/LnaCl。

13、Tween20（15）鼠抗人-MMP-9（16）鼠抗人-TIMP-1。

14、过氧化物酶标记的第二抗体。

15、NBT（溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml）。

16、BCIP（溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml）。

17、100mmol/LTris-HCL（pH9.5）。

18、100mmol/LNaCl。

19、50mmol/LTris-HCL（pH7.5），5mmol/LEDTA。

（可以参看分子克隆）

四、主要步骤

生物秀为您搜集了现阶段几乎网上所有的WesternBlot的中英文资料，仅供实验参考，可以根据自己实验的实际情况进行调整：

WesternBlotPROTOCOL：

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