缓冲溶液配制大全.docx
《缓冲溶液配制大全.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《缓冲溶液配制大全.docx（25页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
缓冲溶液配制大全
生物化学实验溶液配制手册
序言
目录
收集各种实验体系用到的缓冲溶液：
结构式，理化性质，配制方法
第一章免疫学实验常用溶液配制（ELISA、荧光免疫、试纸条等用到的缓冲溶液）
第二章分子生物学实常用溶液配制（PCR，基因表达，文库构建等）
2.1植物、动物、微生物基因组DNA、RNA的提取与鉴定
2.2PCR扩增
2.3电泳缓冲液、染料和凝胶加样液
2.4分子杂交技术
2.5限制性内切酶消化
2.6分子克隆全过程
第三章细胞生物学实验常用溶液配制
第4章生化实验常用溶液配制
第5章其他常用溶液配制（抗体保存溶液、培养基配制、菌株保藏、）
2.1植物、动物、微生物基因组DNA、RNA的提取与鉴定
20×SSC
SSC缓冲液主要由氯化钠、柠檬酸钠组成，主要用于RNA杂交（如Northern印迹）、（如Sorthern印迹）等核酸杂交。
Leagene SSC缓冲液（20×,pH7.0）其pH值为7.0
主要用于核酸杂交，不同浓度作用不同：
常用2×，及0.5×
·SSC缓冲液中的盐离子（Na）中和RNA/DNA主链上的负电荷，使其呈电中性，这样可以使探针和把序列的结合比较容易进行。
·2×SSC：
高盐洗膜，洗去部分非特异性结合的探针。
·0.5×SSC：
低盐洗膜，增加核酸链的严紧性，使得RNA/DNA之间的排斥力增加。
组份浓度3.0MNaCl，0.3MNa3citrate·2H2O（柠檬酸钠）
配制量1L
配制方法1.称量下列试剂，置于lL烧杯中。
NaCl
175.3g
Na3citrate·2H2O
88.2g
2.向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3滴加14NHCl，调节pH值至7.0后，加去离子水将溶液定容至1L。
4.高温高压灭菌后，室温保存。
20×SSPEBuffer
基本信息
【名称】：
中文名称：
乙二胺四乙酸。
EDTA[1]
化学名称：
EthyleneDiamineTetraaceticAcid。
化学简称：
EDTA
中文别名：
四乙酸二氨基乙烯，托立龙。
俗名：
依地酸（特别是它的钙盐络合物，医学上称为依地酸钠钙）。
英文名称：
Ethylenediaminetetraaceticacid
英文别名：
（Ethylenedinitrilo）tetraaceticacid,Edathamil
【线性分子式】：
（HO2CCH2）2NCH2CH2N（CH2CO2H）2
【分子式】：
C10H16N2O8
【分子量】：
292.248（注：
EDTA二钠为372.2）。
【CAS号】：
60-00-4
【密度】:
1.566g/cm3
【熔点】：
250℃
【贮藏】：
密封保存。
EDTA是化学中一种良好的配合剂，它有六个配位原子，形成的配合物叫做螯合物，EDTA在配位滴定中经常用到，一般是测定金属离子的含量，在生物应用中，用于排除大部分过度金属元素离子（如铁（III），镍（II），锰（II））的干扰。
在蛋白质工程及试验中可在不影响蛋白质功能的情况下去除干扰离子。
20×SSPEBuffer
组份浓度3.0MNaCl，0.2MNaH2PO4，0.02MEDTA
配制量1.L
配制方法1.称量下列试剂，置于lL烧杯中。
NaCl
175.3g
NaH2PO4·H2O
27.6g
Na2EDTA·2H2O
7.4g
2.向烧杯中加入约800ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3.加NaOH调节pH值至7.4（约6.5ml的10NNaOH）。
4.加去离子水将溶液定容至lL。
5.高温高压灭菌后，室温保存。
50XDenhardt’S溶液
邓哈特溶液：
主要成分Ficoll400、Polyvinylpyrrolidone、BSA
英文名称：
Ficoll400
中文名称：
聚蔗糖
CAS号：
26873-85-8
MDL号：
MFCD00081599
EINECS号：
200-334-9
常采用Ficoll—400，也就是相对分子重量为400000，Ficoll渗透压低，但它的粘度却特别高，为此常与泛影葡胺混合使用以降低粘度。
主要用于分离各种细胞包括血细胞、成纤维细胞、肿瘤细胞、鼠肝细胞等。
聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone）简称PVP，是一种非离子型高分子化合物，是N-乙烯基酰胺类聚合物中最具特色，且被研究得最深、广泛的精细化学品品种。
已发展成为非离子、阳离子、阴离子3大类，工业级、医药级、食品级3种规格，相对分子质量从数千至一百万以上的均聚物、共聚物和交联聚合物系列产品，并以其优异独特的性能获得广泛应用。
PVP作为一种合成水溶性高分子化合物，具有水溶性高分子化合物的一般性质，胶体保护作用、成膜性、粘结性、吸湿性、增溶或凝聚作用，但其最具特色，因而受到人们重视的是其优异的溶解性能及生理相容性。
在合成高分子中像PVP这样既溶于水，又溶于大部分有机溶剂、毒性很低、生理相溶性好的并不多见，特别是在医药、食品、化妆品这些与人们健康密切相关的领域中
牛血清白蛋白（BSA），又称第五组分，是牛血清中的一种白蛋白，包含583个氨基酸残基，分子量为66.430 kDa，等电点为4.7。
牛血清白蛋白在生化实验中有广泛的应用，例如在westernblot中作为Blockingage；在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。
防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的。
牛血清白蛋白
基本信息
中文名称：
牛血清白蛋白[1]
中文别名：
组分V
英文名称：
Albuminfrombovineserum
英文别名：
BSA
纯度：
98%
CAS号：
9048-46-8
等电点：
（4.7）
性状描述
白色结晶或类白色冷冻干燥粉末。
溶于水。
难于盐析。
水溶液加热至60-70℃时，蛋白即凝固沉淀。
物理参数
熔点:
240～245℃
用途说明
1、在酶切反应缓冲液中加入BSA，通过提高溶液中蛋白质的浓度，对酶起保护作用。
防止酶的分解和非特异性吸附，能减轻有些酶的变性，能减轻有些不利环境因素如加热，表面张力及化学因素引起的变性的。
2、ELISA中也常常用到，比如封闭液，样本稀释液，酶结合物稀释液都可以用BSA。
3、生化研究，遗传工程和药物研究。
组份浓度
1%（W/V）
Ficoll400（菲可400/水溶性聚蔗糖400）
1%（W/V）
Polyvinylpyrrolidone
（聚维酮/聚乙烯吡咯烷酮）
1%（W/V）
BSA
配制量500ml
配制方法1.称量下列试剂，置于500ml烧杯中。
Flcoll400
5g
PoLyvlnylpyrrolldone
5g
BSA
5g
2.加去离子水约400ml，充分搅拌溶解
3.加去离子水将溶液定容至500ml。
4.用0.45µm滤膜过滤后，分装成每份25ml。
5.-20℃保存。
SalmonDNA（鲑鱼精DNA）
鲑鱼精DNA储存在水或者TE缓冲液中，TE缓冲液（10mMTris,pH8.0；1mMEDTA）是一种常用的储存DNA的溶液。
本试剂可用于DNaseI的底物，也可用于杂交（一般浓度为100ug/ml）;仅供实验室研究使用。
组份浓度10mg/mlSalmonDNA
配制量约100ml
配制方法1.称取鲑鱼精DNA2g置于500ml烧杯中，加入约200ml的TEBuffer。
2用磁力搅拌器室温搅拌2~4h，溶解后加入4ml的5MNaCl，使其终浓度为0.1M。
3.用苯酚和苯酚/氯仿各抽提1次。
4.回收水相溶液后，使用17号皮下注射针头快速吸打溶液约20次，以切断DNA。
5.加入2倍体积的预冷乙醇进行乙醇沉淀。
6.离心回收DNA后，溶解于100ml的去离子水中。
测定溶液的OD260值。
7.计算溶液的DNA浓度后，稀释DNA溶液至10mg/ml。
8.煮沸10min后，分装成小份（1ml/份）。
-20℃保存。
9.使用前在沸水浴中加热5min后，迅速冰浴冷却。
2.2常用PCR缓冲液：
1.PCR的基本原理
PCR的基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机理沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。
通过不断重复这一过程，可以使目的DNA片段得到扩增。
另一方面，新合成的DNA片段也可以作为模板，因而PCR技术可使DNA的合成量呈指数型增长。
2.PCR的基本成分
PCR包括7种基本成分：
模板DNA、特异性引物、热稳定DNA聚合酶、脱氧核苷三磷酸（dNTP）、二价阳离子、缓冲液及一价阳离子。
模板DNA：
包括基因组DNA、质粒DNA、噬菌体DNA、预先扩增的DNA、cDNA和mRNA分子等几乎所有形式的DNA和RNA都能成为PCR技术反应的模板。
除此之外，PCR反应还可以直接以细胞为模板。
特异性引物：
是一段与模板DNA链结合的寡核苷酸片段，对于DNA的扩增起到引发的作用。
热稳定DNA聚合酶：
这是PCR技术实现自动化的关键。
热稳定DNA聚合酶是从两类微生物中分离的：
一类是嗜热和高度嗜热的真细菌，另一类是嗜热古细菌。
现在又出现了一种兼顾了几种DNA聚合酶特点的混合型酶。
脱氧核苷三磷酸（dNTP）：
是DNA合成的原料，包括dATP、dGTP、dTTP、dCTP。
二价阳离子：
常用到Zn2+和Mg2+,作为构成热稳定性DNA聚合酶的成分之一。
缓冲液：
一般使用Tris-Cl缓冲液，标准的为10mmol/L,并将其调节到8.3~8.8之间。
一价阳离子：
一般使用50mmol/L的KCl溶液，有利于改善扩增的产物质量。
PCR的基本操作
PCR是一种级联反复循环的DNA合成反应过程。
PCR技术的基本反应由三个步骤组成：
1.变性：
通过加热使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身和引物之间存在的局部双链也得以消除；
2.退火：
将温度下降至适宜温度，使引物与模板DNA退火结合；
3.延伸：
将温度升高，热稳定DNA聚合酶以dNTP为底物催化合成DNA链延伸。
以上三部为一个循环，新合成的DNA分子又可以作为下一轮合成的模板，经多次循环后即可达到扩增DNA片段的目的。
PCR的主要应用
最初建立PCR是为了扩增已知序列的靶基因。
因为在PCR方法问世以前，要获得一个靶基因，必须建立基因文件库，然后从成千上万的菌落中通过Southernblot杂交筛选含有靶基因的克隆。
这样既费时又费钱，特别是在克隆真核生物基因时难度更大。
自从建立了PCR方法以后，使克隆已知序列的基因变得非常容易。
为了适应分子生物学的快速发展，PCR方法也得到了不断发展，现在PCR已应用到生命科学的各个领域。
标准的PCR反应体系：
10×扩增缓冲液10ul
4种dNTP混合物各200umol/L
引物各10～100pmol
模板DNA0.1～2ug
TaqDNA聚合酶2.5u
Mg2+1.5mmol/L
加双或三蒸水至100ul
PCR反应五要素：
参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
10×标准DNA连接酶缓冲液（standardDNAligasebuffer）（粘端、平端连接）
成分及终浓度
配制10ml溶液各成分的用量
0.5mol/LTris-HCl
100mmol/LMgCl2
100mmol/LDTT
2mmol/LATP
5mmol/L盐酸亚精胺（可选）
0.5mg/mlBSA（组分V）（可选）
水
5ml1mol/L贮液
1ml1mol/L贮液
1ml1mol/L贮液
200ul100mmol/L贮液
50ul1mmol/L贮液
0.5ml10mg/mL贮液
2.25ml
将配制好的缓冲液分装成小份，贮存于-20℃。
100mmol/LdNTP溶液（dNTPsolutions）
储存液
dNTP溶于pH为7.0的NaOH贮存液中，最初的贮存液可稀释到10mol/L，分装后存放在-20℃冰箱中。
dNTP使用浓度在20～200μmol/L之间。
4种dNTP必须等浓度配合以减少错配误差。
使用浓度
在PCR反应中,使用低dNTP浓度,可减少非靶位置启动和延伸时的核苷酸错误掺入。
一般可根据靶序列的长度和组成来决定最低dNTP浓度。
例如在100μl的反应体系中,4种dNTP的浓度为20μmol/L,可基本满足合成2.6μgDNA或10pmol/L的400bp序列。
可以购买到100mmol/L纯dNTPs贮液，-80℃可贮存至少6个月。
10mmol/LdNTP混合液
成分及终浓度
配制20ul溶液各成分的用量
10mmol/LdATP
10mmol/LdCTP
10mmol/LdGTP
10mmol/LdTTP
水
2ul100mmol/LdATP贮液
2ul100mmol/LdCTP贮液
2ul100mmol/LdGTP贮液
2ul100mmol/LdTTP贮液
12ul
DEPC（焦碳酸二乙酯）处理水
DEPC（Diethypyrocar-bonate），中文名为焦碳酸二乙酯。
分子式为C6H10O5，分子量为162.14。
是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。
通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性，常用于生物实验中RNA的提取等。
外文名称：
DEPC
中文名称：
焦碳酸二乙酯
中文别名：
氧二甲酸二乙酯；重碳酸二乙酯；二碳酸二乙酯
英文别名：
Diethyloxydiformate;Ethoxyformicanhydride;Pyrocarbonicaciddiethylester;Diethyldicarbonate
分子式：
C6H10O5
分子量：
162.1
储藏温度：
2~8°C
DEPC是RNA酶的化学修饰剂，它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。
DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物，因而使用时需小心。
DEPC能与胺和巯基反应，因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。
2物化性质
密度：
1.12g/mLat20°C
沸点：
93-94°C（18mmHg）
折射率：
1.396-1.4
闪点：
69°C
水溶性：
SLOWDECOMPOSITION
蒸汽压：
2.88E-10mmHgat25°C
3用途
DEPC是一种有效的核酸酶抑制剂，它能够与很多酶的-NH，-SH或-OH等基团发生反应，从而破坏酶的活性中心。
常用浓度为0.1%的DEPC来作为RNA酶的抑制剂。
在进行RNA实验时，常用DEPC处理实验所用的各种试剂。
我们通常所说的DEPC（处理）水是指用DEPC处理过并经高温高压消毒的MiliQ纯水。
MiliQ纯水加0.1%DEPC，混匀过夜，121℃，20min。
而后DEPC即降解成二氧化碳和水，失去毒性。
DEPC（处理）水可以用于RNA沉淀的溶解，含有RNA的各种反应体系如反转录、siRNA的退火等，以及其它各种要求无RNase、DNase和proteinase的反应体系。
加100ulDEPC于100ml水中，使DEPC的体积分数为0.1％。
在37℃温浴至少12h，然后在15psi条件下高压灭菌20min，以使残余的DEPC失活。
DEPC会与胺起反应，不可用DEPC处理Tris缓冲液。
TE缓冲液
基本信息
内容
TE缓冲溶液buffersolution
TE是有Tris和EDTA配置而成的，主要用于溶解DNA，能稳定储存DNA。
TE缓冲液是一种能在加入少量酸或碱时抵抗pH改变的溶液。
PH缓冲系统对维持生物的正常pH值，正常生理环境起重要作用。
多数细胞仅能在很窄的pH范围内进行活动，而且需要有缓冲体系来抵抗在代谢过程中出现的pH变化。
在生物体中有三种主要的pH缓冲体系，它们是蛋白质、重碳酸盐缓冲体系和磷酸盐缓冲体系。
每种缓冲体系所占的分量在各类细胞和器官中是不同的。
在生化研究工作中，常常要用到缓冲溶液来维持实验体系的酸碱度。
研究工作的溶液体系pH值的变化往往直接影响到我们工作的成效。
如果提取酶实验体系的pH值变化或变化过大，会使酶活性下降甚至完全失活。
所以我们要学会配制缓冲溶液。
由弱酸及其盐组合一起使具有缓冲作用。
生化实验室常常用的缓冲系主要有磷酸、柠檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、Tris（三羟甲基氨基甲烷）等系统，在生化实验或研究工作中要慎重地选择缓冲体系，因为有时影响实验结果的因素并不是缓冲液的pH值，而是缓冲液中的某种离子。
如硼酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐和三羟甲基甲烷等缓冲剂都可能产生不需要的反应。
硼酸盐：
硼酸盐与许多化合物形成复盐、如蔗糖。
柠檬酸盐：
柠檬酸盐离子容易与钙结合，所以存在有钙离子的情况下不能使用。
磷酸盐：
在有些实验，它是酶的抑止剂或甚至是一个代谢物，重金属易以磷酸盐的形式从溶液中沉淀出来。
而且它在pH7.5以上时缓冲能力很小。
三羟甲基氨基甲烷：
它可以和重金属一起作用，但在有些系统中也起抑止的作用。
其主要缺点时温度效应。
这点往往被忽视，在室温pH是7.8的Tris一缓冲液，在4℃时是8.4，在37℃时是7.4，因此，4℃配制的缓冲液拿到37℃测量时，其氢离子浓度就增加了10倍。
而且它在pH7.5以下，缓冲能力差。
配置
×TEBuffer
组成浓度：
10mMTris-HCl1mMEDTAPH=8.0
配制量：
500ml
配制方法：
量取下列溶液于500ml烧杯中
1MTris-HClBufferPH=8.05ml
0.5MEDTAPH=8.01ml
向烧杯中加入约400mlddH2O均匀混合；将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存.
2作用及用途
作用
TE缓冲液是弱碱性,对DNA的碱基有保护性,（DNA在它是的稳定性较好,不易破坏其完整性或产生开环及断裂）,包括提取好的DNA也要放在TE缓冲液中保存.
用途
TE缓冲液是Tris+EDTA缓冲液，这种缓冲液我们一般用作溶解剂或保持剂，主要是调控PH，TAE是一种电泳缓冲液，主要用于DNA分子的电泳。
TE组成浓度：
10mMTris-HCl1mMEDTAPH=8.0配制量：
500ml配制方法：
量取下列溶液于500ml烧杯中1MTris-HClBufferPH=8.05ml0.5MEDTAPH=8.01ml向烧杯中加入约400mlddH2O均匀混合；将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌；室温保存.
TAE是使用最广泛的缓冲系统。
其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量（TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量），且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%，电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收DNA片段时也易用TAE缓冲系统进行电泳。
TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。
50×TAEBuffer配制方法：
1.称量Tris242g，Na2EDTA.2H2O37.2g于1L烧杯中；2.向烧杯中加入约800ml去离子水，充分搅拌均匀；3加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解；4.加去离子水定容至1L后，室温保存。
2.3电泳缓冲液、染料和凝胶加样液
电泳缓冲液
聚丙烯酰氨凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳（英语：
polyacrylamidegelelectrophoresis，简称PAGE）作用：
用于分离蛋白质和寡核苷酸。
简介
作用原理：
聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。
它有两种形式：
非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）及SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。
该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂（SDS即十二烷基磺酸钠）后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。
PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类，连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCl。
分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶，凝胶缓冲液为pH8.9Tris-HCl。
电极缓冲液是pH8.3Tris-甘氨酸缓冲液。
2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
4过程
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。
如果加入一种试剂使电荷因素消除，那电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。
1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。
当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，可使蛋白质分子中的二硫键还原。
由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原的电荷量，因而掩盖了不同种蛋白质间原有的电荷差别，SDS与蛋白质结合后，还可引起构象改变，蛋白质—SDS复合物形成近似“雪茄烟”形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为18A（1A=10的负十次方米），这样的蛋白质—SDS复合物，在凝胶中的迁移率，不再受蛋白质原的电荷和形状的影响，而取决于分子量的大小由于蛋白质－SDS复合物在单位长度上带有相等的电荷，所以它们以相等的迁移速度从浓缩胶进入分离胶，进入分离胶后，由于聚丙烯酰胺的分子筛作用，小分子的蛋白质可以容易的通过凝胶孔径，阻力小，迁移速度快；大分子蛋白质则受到较大的阻力而被滞后，这样蛋白质在电泳过程中就会根据其各自分子量的大小而被分离。
因而SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的分子量。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：
logMW=K-bX，式中：
MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移
升级会员 