新一代DNA测序发展.docx

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新一代DNA测序发展

新一代DNA测序技术

DNA测序技术已广泛应用于生物学研究的各个领域，很多生物学问题都可以借助高通量DNA测序技术予以解决。

过去三年，大规模平行测序平台（massivelyparallelDNAsequencingplatform）已经发展为主流的测序技术，这项测序技术的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，还让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。

目前，新的测序技术及手段还在不断涌现，比如最新的进展就包括建立序列数据库、建立序列数据分析新方法以及设计测序试验等等。

新一代DNA测序技术有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。

今后，各种测序将成为一项广泛使用的常规实验手段，这有望给生物学和生物医学研究领域带来革命性的变革。

DNA测序技术经历了漫长而曲折的发展历程。

迄今为止，我们获得的绝大部分DNA序列都是基于Sanger测序法获得的。

在过去5年间，人们至少从以下四个方面刺激了DNA测序技术的发展（表2）。

1.具有代表性的新一代DNA测序仪

最近市面上出现了很多新一代测序仪产品，例如美国RocheAppliedScience公司的454基因组测序仪、美国Illumine公司和英国Soledadtechnology公司合作开发的Illumine测序仪、美国AppliedBiosystems公司的SOLiD测序仪、Dover/Harvard公司的Polonator测序仪以及美国Helicos公司的HeliScope单分子测序仪。

所有这些新型测序仪都使用了一种新的测序策略——循环芯片测序法（cyclic-arraysequencing），也可将其称为“新一代测序技术或者第二代测序技术”。

所谓循环芯片测序法，简言之就是对布满DNA样品的芯片重复进行基于DNA的聚合酶反应（模板变性、引物退火杂交及延伸）以及荧光序列读取反应。

2005年，有两篇论文曾对这种方法做出过详细介绍。

与传统测序法相比，循环芯片测序法具有操作更简易、费用更低廉的优势，于是很快就获得了广泛的应用。

虽然这些新一代测序仪以及芯片的实际制作过程似乎都和传统的测序方法有很大的不同，而且各有特点（表3），但实际上它们背后的原理和技术都是非常相似甚至是相同的（图1b）。

新一代测序法首先也是将基因组DNA随机切割成小片段DNA分子，然后在体外给这些小片段分子的末端连接上接头制成文库，也可以使用配对标签（mate-pairedtag）制成跨步文库（jumpinglibraries）。

随后可以通过原位polony（insitupolony，小词典1）、微乳液PCR（emulsionPCR）或桥式PCR（bridgePCR）（图5）等方法获得测序模板。

上述方法有一个共同点，那就是任何一个小片段DNA分子的PCR扩增产物都是在空间上聚集的：

原位polony法和桥式PCR法中所有的产物都集中在平板的某处，在微乳液PCR法（emulsionPCR）中所有的产物都集中在微珠的表面。

真正的测序反应本身和传统测序法一样，是由重复的聚合酶促反应和最后的荧光读取分析反应组成（图6）。

本文讨论的所有测序仪都是使用合成测序法（sequencingbysynthesis），即通过聚合酶或连接酶不断地延伸引物获得模板序列，最后对每一轮反应的结果进行荧光图像采集、分析，获得序列结果。

注：

虽然目前测序片段长度短和准确率不高这两个缺点限制了新一代测序技术的应用，不过应该坚信，我们最终一定会克服这些问题。

就好像经过了30年的努力，传统的测序技术也今非昔比，到达了今天的水平一样。

1.1   454测序仪

454测序仪的出现极大促进了测序业务的开展，科研人员已经将测序技术作为解决科研工作中许多常见问题的利器。

这是因为454测序仪在以下几个方面取得了质的突破：

首先是解决了高通量测序问题；其次它简化了样品准备步骤，将以往转化大肠杆菌扩增质粒的繁琐过程全部用简单的体外PCR扩增法替代了；最后，它缩小了测序反应体积，节省了试剂。

这样，454测序仪做到了以极其低廉的价格进行大规模平行测序反应。

它的测序规模之大、测序费用之低是以往的测序仪无法匹敌的。

454测序仪与其它的新一代测序仪一起，降低了测序检测的费用，推动了测序技术平民化进程，使得小实验室也能开展测序检测项目，打破了以往只有少数几个大型测序中心才能进行测序研究的“垄断地位”。

在过去的18个月里，由于有了454测序仪的帮助，人们对人类基因组的结构有了更深入的了解，同时第一次使用非Sanger测序法对个人进行了测序，还建立了一种发现小RNA的新方法。

不过，要能让更多的人使用上新一代的测序产品，它们还需要变得更便宜，并且更加容易操作。

在一段时间之内，454测序仪必定会进一步降低测序费用，帮助人们迎接个人基因组时代的到来。

自从诺贝尔奖得主FrederickSanger和WalterGilbert（图2）分别发明了链终止法DNA测序技术（sequencingbychainterminationtechnique）和链断裂法DNA测序技术（sequencingbychainfragmentationtechnique）之后，人们就一直希望能够扩大DNA测序技术的处理规模。

到了今天，我们对测序技术的需求和对计算机技术的需求一起出现了迅猛的增长，因为测序技术的发展速度已经远远跟不上实验要求的增长速度。

于是出现了好几种替代Sanger测序法的新型测序方法，比如杂交测序法、借助原子力显微镜（atomicforcemicroscopy）直接DNA成像测序法（directimagingofDNAsequence）、质谱分析法、合成测序法以及微液流测序法等等。

在我们进行人类基因组计划时还出现了三项技术改进方法，即使用荧光标记物取代了放射性标记物来标记终止碱基（双脱氧碱基）；使用毛细管电泳（capillaryelectrophoresis）取代了传统的平板凝胶电泳；建立了末端配对测序法（paired-endsequencing）来对质粒、fosmid、人工细菌染色体（BAC）等短片段序列进行测序，解决了测序长度带来的限制问题。

同时，开展研究的自动化液体分装技术（liquid-handlingrobotics）帮助我们摆脱了人工试管操作，可以用自动化的方式在微量滴定板（microtiterplate）上装载待测序样品（质粒等），极大地降低了测序的费用和劳动强度。

随着美国454LifeSciences公司（该公司现已被美国罗氏公司收购）的第一台新一代测序仪——454测序仪的面世，我们获得了一种完全不同的测序方式。

454测序仪引领的新一代测序技术在一直困扰传统测序技术的三个瓶颈问题上取得了突破。

这三个问题分别是文库制备、模板制备和测序。

而且，在随后出现的其它新一代测序仪产品身上，我们或多或少都会发现在454测序仪上使用到的技术，这也足以说明454测序仪的技术创新的确取得了巨大的成功。

454测序仪的先行者地位使它对整个测序业的影响远远超过了其它新一代测序仪竞争对手。

这一点从Leamon、Rothberg等人撰写的一篇介绍2005年技术进展的论文被引用了570多次的事实，以及有100多篇经过同行审议的关于人类遗传学、代谢组学、生态学、进化学以及古生物学的论文（peer-reviewedpublications）都是使用454测序仪开展的研究多个事实中都能够得到证明。

454测序仪技术是继Sanger测序技术之后出现的第一个用于对细菌基因组进行从头测序的新技术，也是第一个被用来对人类基因组进行测序的非Sanger测序技术。

其它使用454测序仪开展的重要研究项目包括探究蜜蜂消失原因的项目、研究人类基因组重排复杂性的项目、建立用于研究传染性疾病新方法的项目以及对尼安德特尔人（Neanderthal）基因组的测序项目等。

1.1.1摩尔定律对454测序仪的影响

454测序仪的迅猛发展不是因为我们想要Sanger测序仪小型化，而是因为新型奔腾芯片的出现以及摩尔定律法则给我们带来的希望。

很明显，常规的人类基因测序项目会对我们处理测序技术的能力提出更高要求，这与我们对计算机处理能力的要求是一样的。

不过，只有将计算机的电子管换成晶体管，才为后来集成电路技术的发展提供了可能，这正是计算机产业发展的关键所在。

而希望对传统的毛细管电泳技术进行改良，提高它的速度和处理规模，正如只用电子管直接制作集成电路一样不可能。

因此，如果将各种测序技术比作一个个晶体管，将一系列测序步骤整合起来比作集成电路，那么也就可以用摩尔定律来预测DNA测序技术的发展速度了。

合成测序法概念虽然在提出的时候还不算成功，但它的出现为测序仪小型化奠定了基础。

基于合成测序法出现了两种策略：

一种是循环可切除终止测序法（cyclicreversibleterminationtechnology），即依次逐个添加荧光标记的碱基，继而检测荧光信号，切除荧光基团，如此往复；另一种策略是焦磷酸测序法（sequencedbydetectingpyrophosphaterelease）。

454测序仪采用的正是焦磷酸测序法，因为它似乎比第一种方法的效率更高。

结果证明，454公司的选择是正确的。

454测序仪采用的是小型化焦磷酸测序反应，测序模板准备和焦磷酸测序反应步骤都是在固态芯片上完成的。

实际上，早在上世纪90年代中期，焦磷酸测序技术就已经被科研界用来进行基因分型工作了，但那时的焦磷酸测序技术还不能够满足标准的测序实验要求，因为它的测序长度太短，因此只能用于旨在发现SNP的基因分型研究当中。

当时进行基因分型操作时，是在微量滴定板（microtiterplate）上进行的，可以连续进行最多96次基因分型实验，平均每个样品花费20美分。

那时焦磷酸测序还不能用于从头测序工作，因为从头测序需要对每一个尤其是第一个碱基都能准确地区分清楚，而焦磷酸测序只能简单地对已知位点的碱基进行检测，而且从头测序要求的测序长度也是焦磷酸测序法无法达到的。

不过，由于焦磷酸测序的原理是通过检测碱基掺入时发出的光来进行测序的（图3），所以它并不需要类似于电泳之类的物理分离过程来对碱基进行区分。

这也就是说焦磷酸测序仪可以“缩小（减）”到只需要检测光线就够了，而不需要像传统的测序仪还需要电泳设备，而这正是限制传统电泳仪小型化的关键所在。

发光检测方法还能够进行多路平行操作，但是直到454测序仪出现之前，还没有人这样做过，以前都是依次进行检测的。

和晶体管早期的遭遇一样（当时人们也怀疑晶体管替代不了电子管），人们同时对高密度的，用于并行焦磷酸测序的反应也充满了疑问。

不过，当我们不再在溶液中进行测序反应，而是将测序模板、所有的试剂（酶）都固定在平板上制成芯片之后，就获得了小型化的，能进行多路并行处理的测序仪，这就与晶体管被小型化并整合成

集成电路的过程一样。

此外，借助微量滴定板上一个个的小孔所达到的将不同测序反应进行分隔这一目的，也能通过在单个固相支持物上进行严密包裹（隔离）的反应来实现。

在这些各自隔绝的反应体系中，链聚合反应速度和发光速度都能通过对反应试剂和产物弥散状况进行严密的控制来进行精密的调整。

1.1.2新的并行试验方法

在开发新型高通量、高并行运行方法时碰到的一个关键问题是，如何将反应试剂同时加入数量如此之多的各个反应体系中？

在焦磷酸测序的过程当中需要反复加入不同的碱基以供测序反应使用，而当时的自动化加样设备无法有效地做到对这么多的反应体系同时循环加样。

于是，开发一种全新的高密度并行处理方法这一重要课题又再一次摆在了科研人员的面前。

这一次，我们找到了一个非常简单但是又很巧妙地方法。

在高密度的反应芯片表面使用层流（laminarflow）加样方式，反应试剂会通过扩散作用很好地进入每一个反应体系，而且也可以用层流的方式洗去多余的反应试剂。

现在，所有的新一代测序仪都采用了这种层流加样方法。

为了将每个单独的测序反应都分隔开来，我们一开始使用平板（芯片），不过在平板上平均每一平方厘米的面积上最多只能同时进行数百至数千个反应。

但我们希望达到的是在每平方厘米的面积上同时进行100万个测序反应，这样才能令测序仪小型化，同时节省试剂并进行快速成像和测序。

为了实现更高密度的测序反应，我们在平板上制作了很多小孔，将每个反应体系都安置在这些小孔中，这些小孔都足够深，足以分隔每个反应体系。

虽然这种方法极大提高了测序反应的密度，缩小了平板的面积，但是要达到我们的要求还是需要60mm×60mm大小的芯片才行。

针对图像采集问题使用了商业化的天文学照相（astrologicalgradecamera）器材，在电荷偶合装置（CCD）的表面连接上光纤束（fiber-opticbundle）。

这些光纤是锥形排列的，这样可以将大范围的光信号都传输到CCD表面上很小的一个范围。

采取下面两个步骤，我们就可以制成含有高密度小孔的芯片：

先将光纤束连接到类似于载玻片一样的一次性芯片上，然后用酸蚀刻（acidetchingprocedure）技术在玻片的另一面打上小孔。

这种酸蚀刻技术是根据制作生物传感器的技术改进而来的。

454公司制作的每张芯片上可以达到数百万个小孔，每一个小孔都是一个独立的“反应站”，互不干扰，测序反应发出的光被连接在芯片上的光纤传送到CCD记录下来（图4）。

这种芯片就好像集成电路一样一次可以同时处理数百万个测序反应。

这种芯片同样也能被其它通过发光检测技术的产品所使用。

454测序仪也没有像以前的96孔板焦磷酸测序仪那样使用液态的试剂，而是将试剂和模板统统都吸附在一个个微珠上，然后把这些微珠一个个地放到芯片上的小孔中，每孔一个微珠。

这种固定步骤不仅保证了每孔测序反应的独立性，也极大地节省了试剂消耗费用。

要想实现高通量基因组测序，只对测序步骤进行优化还是远远不够的。

人类基因组计划花费的30亿美元经费中有很大一部分都用在了测序样品制备阶段。

当时即使是采用最简单的制备样品方法也需要将目标片段克隆到细菌中，挑克隆，再转到96孔板，然后进行克隆扩增，提取质粒，制备测序模板。

这种工作流程既耗时也耗钱。

如果采用新型的文库制备方法就可以极大地节省这部分开支，这种新型的方法是先分离基因组DNA，随机切割成小片段分子，然后通过有限稀释（limitingdilution）和聚合酶扩增反应，即体外克隆方式（cloneswithoutbacterial）制备模板片段。

这样，从模板制备到最后的测序反应整个过程都能够在体外完成。

1.1.3从发明到创新

从概念的提出到最后技术上的实现，454测序仪主要关注两个方面，首先是开发蚀刻光纤玻片；其次，改进焦磷酸测序方法使其能在固相支持物上进行，即将其改造成固态焦磷酸测序法，同时也对模板及文库构建方法进行了改进，让454测序仪能进行长片段测序工作和从头测序工作。

1.1.3.1在蚀刻板上的小孔中进行固态、长片段焦磷酸测序反应

蚀刻技术经过改良之后能在75mm×75mm的玻片上刻出深55μm、宽44μm的小孔。

而开发固态测序方法和改良测序长度则是两个紧密相关的问题，因为在固定的小孔中反应实际上就能改进测序质量和测序长度。

由于反应试剂能迅速渗透到小孔中，因此反应速度也会加快。

而且这里也没有使用三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）提取未参与反应的碱基，而是将芯片置入反应池中通过层流液体的快速渗透作用将多余的未参与反应的碱基和反应副产品洗掉，由此得到100bp~500bp的测序长度。

在能有效去除多余碱基的同时，每轮反应中聚合酶的效率也得到了极大提高。

这样高效率的聚合反应使得454测序仪具有较长测序长度的同时也保证了高准确性，测序长度在200bp时的准确率高达99.5%。

这是因为通过降低小孔中残存的未参与反应的碱基浓度，可以降低这些碱基对聚合酶活性的抑制作用，或者降低这些碱基导致的延后错误（carry-forwarderror，即由于未参与反应的碱基导致的测序反应不同步现象）的发生率。

454测序仪在测序长度和准确率方面具有优势还因为其在应用流体学、表面化学和酶学（包括选择更好的聚合酶、在更高的温度进行测序反应以及更换及平衡各个酶组分）等方面都有创新（表4）。

还有一些能提高测序精度和测序长度的技术，不过暂时还没有商业化产品。

这些技术包括使用可切除的终止碱基（reversibleterminator）提高对同聚物（homopolymers）的检测精度；双末端测序法（double-endedsequencing），即同一模板的两条链均不测序；以及选择性酶固定法（alternativeenzyme-immobilizationmethod）等。

这些技术改进还都没有用到测序仪产品中，有一部分原因是因为现在还没有必要使用。

注：

蜜蜂群崩溃症（honeybeecolonycollapse），指的是来自养蜂业的蜂箱或自然界存在的欧洲蜜蜂群的工蜂突然消失的现象，又称作Colonycollapsedisorder（CCD）。

1.1.3.2模板制备程序

完全的体外大规模模板制备工作是达成高通量、低价格测序技术的前提。

已广泛使用的乳液PCR扩增技术就是一种很好的方法。

不过，由于很难在热循环测序反应中保证乳液微滴的稳定性，因此最开始实验的模板扩增方法是恒温扩增法（isothermal）。

乳液PCR不需要借助细菌的帮助就能扩增模板，虽然这一点非常诱人，但最开始时并没有合适的表面活性剂能帮助乳液在热循环过程中保持稳定。

于是出现了恒温扩增法，即滚环扩增反应（RCA）。

虽然滚环扩增反应的产量非常高，但这些产物中大部分都不能用来作为测序模板。

因此，还需要找到一种不需要细菌扩增，能用于有限稀释的模板扩增新方法。

于是，人们又把目光转回了PCR法。

在RCA法中，首先将模板克隆有限稀释之后置入光纤玻片上的小孔中，然后用橡胶衬垫把光纤玻片封闭起来，将玻片放入传统的平顶PCR仪进行扩增。

这种方法取得了成功，但是效率不高，因为在玻片中的热质量（thermalmass）和它的钳效应（clampingmechanism）需要更长的PCR循环时间，而且模板的有限稀释度不能低于10%。

孔与孔之间的相互污染现象也是一个不容忽视的问题。

不过无论如何，该方法还是第一个首先从全基因组文库中扩增模板然后使用非Sanger、非Gilbert测序法对基因组进行从头测序的方法，也是第一个使用体外模板扩增技术进行全基因组（腺病毒基因组）测序的方法。

乳液滴的热稳定性问题最终通过加入用于制造炸药的表面活性剂得到了解决，于是乳液PCR技术马上在众多新一代测序仪中得到了广泛的应用。

因为乳液PCR技术具有高效性、可扩展性，既能从30Kb的腺病毒基因组中扩增模板，也能从好几Mb的肺炎链球菌（Streptococcuspneumoniae）基因组中扩增模板。

随着测序精度、测序长度、乳液滴稳定性等各方面技术的不断发展，454测序仪已经不仅仅用于对细菌级别的基因组进行测序了，还能对更高级、更复杂的生物基因组进行测序，例如现代人类基因组、尼安德特人基因组以及环境基因组等。

1.1.3.3文库制备

文库制备包括以下几个步骤，首先随机切割样品基因组，获得大量DNA片段，然后接上接头进行扩增反应。

454测序仪的样品制备程序和CraigVenter等人的鸟枪法样品制备程序有着本质的差别。

454公司采用的是如图4中所示的有限稀释、乳液PCR扩增法，而没有鸟枪法中的细菌克隆繁殖步骤。

去掉了细菌繁殖步骤极大地提高了整个测序工作的速度和效率，同时避免了由于细菌繁殖导致的序列丢失的可能性。

这种方法同样对古老DNA和代谢基因组学的研究也非常适用。

末端配对文库制备方法的建立同样帮助454测序仪获得了对复杂基因组从头测序、对重复片段测序以及对基因组结构（复制、重排）展开系统研究三种能力。

这种末端配对文库的制备方法是受到了Bender科研小组对果蝇（Drosophila）制备跨步文库（jumpinglibrary）方法的启发而发展得来的。

1.1.4应用范围

随着越来越多重要的研究领域受到测序技术的影响，454公司开始和其它商业和学术机构开展合作，进行样品测序和分析工作。

这些合作项目又进一步验证了454测序仪使用的技术能够在众多领域中发挥作用，例如末端配对文库技术对于研究基因组结构的作用和乳液PCR技术捕获目的DNA片段的作用等。

1.1.4.1细菌基因组测序和比较基因组研究

为了测试454测序仪在全基因组测序方面的能力，454公司一开始就参与了一项合作项目，该研究项目会对4株结核分支杆菌基因组进行测序，这四株结核分支杆菌分别是一株对R207910具有耐药性的结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）菌株，基因组大小约4Mb；两株对R207910具有耐药性的耻垢分支杆菌（Mycobacteriumsmegmatis），基因组大小约6Mb；以及一株正常的耻垢分支杆菌（Mycobacteriumsmegmatis），基因组大小约6Mb。

他们希望能发现结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）对R207910产生抗药性的机制。

该项研究清晰的展现了454测序仪在测序速度和测序精度方面的优势。

使用传统的Sanger测序法对一个4Mb的基因组和3个6Mb的基因组进行测序需要好几个月的时间，而用454测序仪，在只有一位实验人员参与实验的情况下，包括样品制备等步骤在内所用的时间仅需要一周。

而且使用454测序仪还避免了传统测序方法中细菌克隆阶段可能出现的错误，获得了高质量的测序结果，发现了导致结核分枝杆菌对R207910产生抗药性的两个点突变位点。

这项研究成果让我们在最近的40年内第一次找到了特异性治疗结核病的药物，同时也对454测序仪在细菌基因组测序方面的应用价值有了深刻的体会。

随后，454测序仪又参与了比较基因组学研究项目、对高致病性细菌空肠弯曲菌（Campylobacterjejun）基因组的从头测序项目、对幽门螺杆菌（Helicobacterpylori）在慢性胃炎致病过程中的进化研究项目、从南极海冰细菌（Antarcticseaicebacterium）中新发现冰结合蛋白（ice-bindingprotein）并对其测序的研究项目，以及在引起肺炎、脑膜炎和泌尿道感染的细菌中发现致病因素的研究项目等。

由于454测序仪不会因为细菌克隆产生测序误差，所以在对结核分枝杆菌抗药性的研究中表现出了非常强的发现突变位点的能力，这一点也被后来的其它研究项目所证实。

此外，最近在用454测序仪进行的人类基因组测序项目中发现了长达29Mb的片段与人类基因组参考序列build-36不相符，这些片段被认为是参考序列中不存在的序列，属于基因组中的常染色质部分。

不过，还需要注意的是，有些报道称由于重复片段的存在会出现序列组装错误，而且小模板片段雾化（nebulization）处理这种方式也会造成测序错误出现。

1.1.4.2小RNA测序

对于包括miRNA在内的小RNA的研究兴趣从2005年开始就持续不断升温，而2005年恰好也是454测序仪上市的那一年。

454测序仪以其不需要进行传统的细菌克隆步骤和足以覆盖只有21bp长的miRNA的测序长度等优势，很快就在miRNA的作用研究之中占据了一席之地。

454测序仪最早参与进行的miRNA研究是对拟南芥（Arabidopsisthaliana）miRNA开展的研究。

随后马上又参与了另一项研究项目，在这个项目中我们在小鼠体内发现了一种新型的小RNA——piRNA。

这些研究项目为我们在人类、黑猩猩、斑马鱼和肿瘤细胞系中开展小RNA研究铺平了道路。

454测序仪具有的这种对小RNA进行研究的能力使它在众多有关RNA的研究领域都能有所作为，例如转录体研究领域、