原代神经元培养.docx

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神经细胞原代培养

从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。

一、培养前准备

1.器械和器皿

器械：

外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等

各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60℃烘干，以防生锈。

由于湿热消毒对手术器械容易可用70－80％酒精浸泡1小时以上消毒。

器皿：

1）玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，

用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。

2）培养瓶、盖玻片

培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，可用0.2N盐酸浸泡10分钟，用蒸馏水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。

凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。

3）移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。

4）塑料培养皿（35mm）、塑料培养板（6、24、96孔）。

辅助工具：

放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。

2.培养基和培养用液的配制

1）  培养基质：

有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。

本室目前常用分子量为7-140000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为0.1mg/ml。

2）  平衡盐溶液：

主要以无机盐和葡萄糖配制而成。

各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。

3）  培养液：

目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。

神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6g/L。

目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。

4）  血清：

有胎牛血清、小牛血清和马血清等。

分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需56℃灭活30分钟）。

5）  胰蛋白酶溶液：

用于分离细胞。

先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至2.5%浓度，振荡摇匀，4℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml冻存。

用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至0.25%或0.125%。

实际使用温度一般为37℃20-30分钟。

6）  解剖溶液：

由平衡盐水（D1-无钙镁离子的Puck氏液）、HEPES缓冲液和蔗糖－葡萄糖溶液组成称为D1-SGH。

D1平衡盐水：

NaCl8.0g、KCl0.4g、Na2HPO4.7H2O0.045g、KH2PO40.03g、酚红0.0012g、三蒸水50ml。

蔗糖－葡萄糖（SG）：

蔗糖7.5g、葡萄糖3g、三蒸水50ml。

HEPES（H，0.352mM）：

用25ml左右的三蒸水溶解2.35g的HEPES后，用NaOH或HCl调pH至7.3-7.4，加三蒸水至28ml。

将D1、SG和H三者合在一起并稀释到1000ml即为解剖液，小瓶分装成5ml后置4℃备用。

二、培养细胞操作

1.  涂培养基

一般在细胞培养前1-2天，将使用的塑料培养皿（35mm）、24孔、96孔培养板或消毒的盖玻片涂上一层Poly-L-Llisine，置于超净台中备用。

2.  实验动物准备

动物的年龄和取材部位对培养细胞的成活率关系密切，需根据具体实验而定。

如大鼠海马细胞培养，以18天胚胎或新生48小时内的大鼠为宜，而培养背根神经节与脊髓神经元以11-13天胚胎小鼠、大脑皮层以小鼠16-21天、小脑细胞取自临产或新生动物。

3.  进入培养室操作

1）  穿上消毒衣，戴上口罩和帽子。

2）  安放消毒的实验用具，如培养皿、解剖器械、玻璃吸管、培养板等于桌面适当的位置。

3）  将平衡盐水、解剖溶液、血清、胰蛋白酶等溶液放置于桌面上，同时准备一个冰袋和污物盘。

4）  解剖动物以新生大鼠取海马组织为例：

将新生大鼠投入80％的酒精中，消毒5-10分钟。

用解剖剪断头，并移入玻璃器皿中，沿中间骨缝将头骨剪开（头骨外侧下沿也剪开），然后剥开头骨暴露大脑半球，去脑膜，沿中线将大脑半球往外翻开，暴露内侧面半月状的海马组织。

用弯头镊子轻轻夹起，放入解剖液内（培养皿可置于冰袋上）。

待数个动物均解剖后，将培养皿内的海马组织移至解剖镜下，仔细去除血管、膜及非海马结构（取材干净非常重要）后，再移至小培养皿中，加数滴D1-SGH液，并用虹膜剪剪碎或用虹膜刀切成小粒。

5）  在上述海马组织加入解剖溶液和0.25%胰蛋白酶各1ml，摇匀后置于37℃培养箱内消化25-30分钟。

6）  将消化好的细胞碎片移入2ml的离心管中，吸去剩余的胰蛋白酶溶液，加入含血清的全培养液2ml终止胰酶作用，约10分钟后，再更换一次全培养液以洗净胰酶。

（全培养液成份为80％DMEM、10％胎牛血清、10％马血清或小牛血清，胎牛血清有助于细胞贴壁）。

7）  用口径较小的、在火焰上光滑过的玻璃吸管吸取细胞团，移入另一离心管，加入2ml培养液并吹打20次。

将离心管斜放，让细胞碎片下沉5-10分钟后，吸取上层细胞溶液约1ml。

离心管中再加入培养液1ml，同上吹打并吸取细胞，与第1次吸取的细胞混合一起后计数。

8）  按所需的细胞浓度接种在事先准备的塑料培养皿、细胞培养板中，用盖玻片则需滴满。

接种后移入37℃的5％CO2培养箱，培养1天后可用无血清培养液，1星期换液2次。

三、细胞识别

根据细胞外形及内部结构进行细胞的识别。

神经细胞具有显著的特征，培养中的贴壁的神经元突起很明显，特别是树突由粗而细，有分支，突起的末端有膨大的生长锥结构，正在不断变化；细胞体呈圆形、梭形、三角形或多角形不等，胞体较厚，具有空泡状核，有明显的核仁；立体感强，常见“晕”。

培养细胞中可包括几种神经元的类型和非神经元的“背景细胞”，即成纤维细胞、室管膜细胞和几种胶质细胞。

成纤维细胞贴壁最快，呈扁平状，胞核卵园形，有并列的两粒小核仁，从胞体两端发出细长突起。

胶质细胞贴附在胶原上和成纤维细胞形成一层“地毯”。

神经细胞贴壁较慢，落在“地毯”上生长迁移和分化。

培养的神经细胞可按一般Nissl法染色或免疫细胞化学特异性染色加以鉴别。

无菌操作注意事项

体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。

即便使用设备完善的实验室。

若实验者粗心大意，技术操作不规范?

也会导致污染。

因而．为在一切操作中为最大可能的保证无菌．每一项工作都必须做到有条不紊和完全靠。

【培养前准备】在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。

有关数据的计算要事先做好。

根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所（培养室、超净台）内，然后开始消毒。

这可以避免开始实验后．囚物品不全往返拿取而增加污染机会。

【操作野消毒】无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次（拖布要专用）．紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。

然后紫外线淌毒30min。

在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置．否则会遮挡射线降低消毒效果。

—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。

【洗手和着装】原则上和外科手术相同。

平时仅做观察不做培养操作时，可穿装细胞培养室内紫外线照射30min的清洁工作服。

在利用超净台工作时，因整个前臂要伸入箱内，应着长袖的清洁工作服，并于开始操作前要用75％酒精消毒手。

如果实验过程中手触及可能污染的物品和出入培养室都要重新用消毒液洗手。

进入原代培养室需彻底洗手还要戴口罩、着消毒衣帽。

【火焰消毒】在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯或煤气灯。

以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。

但要注意：

金属器械不能在为焰中烧的时间过长，以防退火，烧过的金属镊要待冷却后才能挟取组织，以免造成组织损伤。

吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有害物带入营养液中。

开启、关闭长有细胞的培养瓶时，火焰灭菌时间要短。

防止因温度过高烧死细胞。

另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有毒气体，危害培养细胞。

【操作】进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。

不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。

为拿取方便，工作台面上的用品要有合理的布局，原则上应是右手使用的东西放置在右侧，左手用品在左侧，酒精灯置于中央。

工作由始至终要保持一定顺序性，组织或细胞在未做处理之前，勿过早暴露在空气中。

同样，培养液在未用前，不要过早开瓶；用过之后如不再重复使用，应立即封闭瓶口直立可增加落菌机会。

吸取营养液、PBS、细胞悬液及其它各种用液时，均应分别使用吸管，不能混用，以防扩大污染或导致细胞交叉污染。

工作中不能面向操作野讲话或咳嗽，以免唾沫把细菌或支原体带入工作台面发生污染。

操作前用酒精擦拭超净台面及双手。

手或相对较脏的物品不能经过开放的瓶口上方，瓶口最易污染，加液时如吸管尖碰到瓶口，则应将吸管丢掉。

细胞计数

细胞计数法是细胞学实验的一项基本技术。

它是了解培养细胞的生长状态．测定培养基、血清、药物等物质生物学作用的重要手段。

下面介绍常用的血球计数板计数法。

一、用品

（1）血球计数板，巴氏吸管

（2）0.25％胰蛋白酶溶液，无血清培养液

（3）显微镜

二、步骤

（1）  准备计数板：

用酒精清洁计数板及专用盖玻片，然后用绸布轻轻拭干。

（2）  制备细胞悬液；用消化液分散单层培养细胞或直接收集悬浮培养细胞，制成单个细胞悬液。

本法要求细胞密度不低于10000个细胞／m1，若细胞数很少，应将悬液离心（1000rpm，2min），重悬浮于少量培养液中。

（3）  加样：

用吸管轻吹打细胞悬液，取少许细胞悬液，在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。

（4）  计数：

在显微镜下，用10X物镜观察计数板四角大方格中的细胞数．细胞压中线时，只计左测和上方者，不计右侧和下方者。

（5）  计算：

将计算结果代入下式，得出计数结果：

细胞数／毫升原液＝（4大格细胞数之和／4）X104

细胞计数结果乘以稀释倍数即为细胞密度。

三、注意事项

（1）  消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单细胞悬液。

否则会影响细胞计数结果。

（2）  取样计数前．应充分混匀细胞悬液。

在连续取样计数时，尤应注意这一点。

否则。

前后计数结果会有很大误差。

（3）  镜下计数时，遇见2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞算。

如细胞团占10％以上，说明消化不充分；或细胞数少于200个／10mm2或多于500个／l0mm2时，说明稀释不当，需重新制备细胞悬液计数。