尼妥珠单抗原液生产车间工艺设计毕业论文.docx

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尼妥珠单抗原液生产车间工艺设计毕业论文

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摘要

尼妥珠单抗（Nimotuzumab），是一个IgG1型的人源化单克隆抗体，作用机理为特异性结合EGFR胞外的结构域的抗原表位[1]，阻止其活化。

临床上主要应用于与放疗联合治疗，以稳固化疗治疗效果。

根据现有尼妥珠单抗氨基酸序列，人工合成尼妥珠单克隆抗体重链与轻链基因，将尼妥珠单抗重链的pSV2-gpt质粒和编码轻链的pSV-hyg质粒转入CHO宿主细胞，获得可稳定表达尼妥珠克隆抗体的工程细胞。

应用细胞灌流培养技术，通过细胞的扩增培养和发酵表达培养，在哺乳动物细胞表达系统利用CHO细胞高效稳定的产生尼妥珠单克隆抗体，然后使用重组proteinA层析提纯以及纳米滤膜过滤等纯化工艺进行纯化，再经过无菌灌装单体原液程序产生尼妥珠单抗原液。

针对单克隆抗体生产工艺特性，遵循GMP和国家相关设计规范的要求，根据尼妥珠单克隆抗体的生产工艺流程、设计符合GMP要求的尼妥珠单克隆抗原液生产车间。

关键词：

尼妥珠单抗，灌流培养工艺，生产车间设计

DesignofNituzumabAntigenSolutionProductionWorkshop

Abstract

imotuzumab（Nimotuzumab）isanIgG1humanizedmonoclonalantibodythatspecificallybindstotheepitopeoftheextracellulardomainofEGFR[1],preventingitsactivation.Clinically,itismainlyusedincombinationwithradiotherapyforthetreatmentofstageIII/IVnasopharyngealcarcinomawithpositiveexpressionofepidermalgrowthfactorreceptor（EGFR）.

Accordingtotheexistingaminoacidsequenceofnimotuzumab,theheavychainandlightchaingenesofthemonoclonalantibodyofnimotuzumabwereartificiallysynthesized,andthepSV2-gptplasmidoftheheavychainofnimotuzumabandthepSV-hygplasmidencodingthelightchainweretransferredintoCHOhostcellstoobtainengineeredcellsthatcanstablyexpressNitozolcloneantibodies.Usingcellperfusionculturetechnology,throughcellexpansioncultureandfermentativeexpressionculture,themonoclonalantibodyofNitozolisproducedinCHOcellsofmammaliancellexpressionsystem,whichisthenpurifiedusingrecombinantproteinA,virusinactivationandnanofiltrationmembranefiltration.Thepurificationprocesswithinthepurification,andthenasepticallyfilltheproductionprocessofthemonoclonalantibodystocksolution.

Accordingtothecharacteristicsofmonoclonalantibodyproductionprocess,followtherequirementsofGMPandrelevantnationaldesignspecifications,accordingtotheproductionprocessofNitrozinemonoclonalantibody,designtheproductionworkshopofNitrozinemonoclonalantigensolutionthatmeetsGMPrequirements.

Keywords:

Nitozumab,perfusioncultureprocess,workshopdesign

1.前言

1975年克勒和米尔斯坦发明了淋巴杂交瘤技术，使单克隆抗体拥有实现的可能性。

最早应用于疾病临床治疗的是1982年由美国斯坦福医学中心Levy等人制备的抗独特型单抗用以治疗B细胞淋巴瘤[1]。

该临床实验作为单抗医疗应用的敲门砖，打开了单抗医疗行业的大门，随着杂交瘤技术的发展，以及生物技术制药、工业制药等应用科学的发展，大大推动了治疗性单克隆抗体药物的迅猛发展。

第一个治疗性单克隆抗体药物在1986年经FDA批准上市，用于器官移植时的抗排斥反应[2]。

随着人类生活水平以及平均寿命的提高，癌症的病发率也随之上升，由于单抗药物的选择性好与化疗相比正常细胞损伤较少，能有效提高接受治疗的患者的生活质量，这大大提高了单抗药物的需求量。

到2019年共有91种治疗性单抗药物经FDA批准上市销售。

在发展初期由于技术不成熟大多数单抗均为鼠源性，虽然鼠源蛋白与人类蛋白相似，但是在长时间的临床治疗中，发现在人体内反复应用鼠源单抗会引起人抗鼠抗体（HAMA）反应，降低治疗效果，严重者甚至可引起过敏反应导致患者死亡。

为了降低单抗药物的免疫原性并提高治疗效果，抗体人源化以及鼠源单抗药物的淘汰成为单抗药物的发展方向，随着技术的发展出人鼠嵌合，人源化以及全人源单抗。

从1975年杂交瘤技术的发明至1982年单抗的医疗临床应用，到现今一共有91中治疗性单抗通过临床试验成功并获批上市。

国外单抗药物发展历程：

阿昔单抗作为第一个人鼠嵌合抗体药物于1997年投放市场；，帕利珠单抗作为第一个人源化抗体于1998年上市,阿达木单抗作为全球第一个全人源抗体于2002年上市。

我国相比国外的单抗行业，由于生物制药工业基础薄弱。

我国单抗行业起步较晚，单抗药物需求主要靠进口满足。

直到1999年才上市了第一个国产单抗药物——注射用抗人T细胞CD3鼠单抗，主要用于器官移植排斥反应。

但得益于国外多个单抗已过专利保护期，降低了国内单抗生产企业的生产成本，同时由于多个单抗陆续进入医保的利好刺激下，减少了单抗药物对患者的经济负担。

我国单抗药物行业迎来了高速增长期，经过接近20年的发展，我国单抗产业市场规模已从2004年的5700万元跃升至2017年115.65亿美元，近五年平均年增长率达20.42%以上，发展迅猛。

其中的尼妥珠单抗是我国第一个人源化单抗药物，由百泰生物制药有限公司研发于2008年上市，首次打破了国外垄断。

1.1尼妥珠单克隆抗体研究现状

尼妥珠单克隆抗体的靶向分子EGFR也叫HER1，是一种糖蛋白受体。

它正常表达时可以促进正常上皮细胞的形成，而过度表达时诱发上皮性癌组织细胞形成，其中恶性肿瘤类型有鳞状细胞癌，腺癌以及移行细胞癌。

实际上由鳞状细胞癌变所导致的肿瘤细胞都表达EGFR。

而临床前研究表明，阻断EGFR可以使细胞停留在G1期，无法正常分裂增殖从而致使肿瘤停止生长。

其中EGFR酪氨酸激酶活性可以被药物选择性地抑制或被尼妥珠单抗由细胞外配体结合位点竞争性地阻断。

因此，在理论上尼妥珠单抗对所有EGFR过度表达所造成的癌症有一定疗效。

1.1.1作用机理

尼妥珠单克隆抗体（h-R3）是一个IgG1型的人源化单克隆抗体（Mab），它特异性结合在EGFR胞外结构域的抗原表位[2]，阻止其活化。

该抗体是由计算机建模辅助将鼠源性单克隆抗体ioregf/r3（IgG2a）的互补决定区（CDR）移植到人体蛋白骨架上获得的[4]。

尼妥珠单抗的作用机制就是将细胞阻断在G1期。

阻止RNA以及核糖体的合成，最终使癌细胞无法增殖。

1.1.2尼妥珠单克隆抗体的临床应用

目前已证明尼妥珠单克隆抗体对EGFR为结合靶点的癌变细胞抑制增殖作用。

EGFR在多种恶性肿瘤中存在过度表达现象，如食道癌、子宫颈癌中。

由于尼妥珠单抗的普适性，在众多联合化疗治疗的临床试验中都得到不错的疗效成果。

如联合顺铂化疗治疗宫颈癌以及联合卡佩塔冰片对鼻咽癌的治疗。

1.1.3尼妥珠单抗的临床应用进展

随着尼妥珠单克隆抗体作用机理的阐明，以及应用的广泛性，目前已在中国、日本、美国、等20个国家进行多项临床研究，已经完成或正在进行的临床试验共计50余项，包括尼妥珠单抗联合放疗辅助治疗Ⅲ/Ⅳ鼻咽癌、食道癌、乳腺癌、等实体恶性肿瘤，参与临床实验的患者约3000人。

临床研究证实尼妥珠单抗对Ⅲ/Ⅳ形鼻咽癌、直肠、食道癌以及乳腺癌等有效。

患者的不良反应轻微，接受后续治疗意愿高，癌症复发率低，具有很高的临床应用价值。

1.1.4尼妥珠单抗的优点

尼妥珠单抗的与传统化疗药物相比选择性更高。

在单抗的使用过程，由于药物选择性差导致损伤正常细胞，会导致免疫性疾病的发生。

其中痤疮样皮疹的发生，是由于药物在阻断癌变细胞EGFR信号通路的同时，又干扰了正常细胞的信号通路，导致患者经常因为严重的皮肤毒性反应而不得不减量或停药，因而打断治疗疗程甚至致使癌症的复发。

尼妥珠单抗选择性强，仅阻断癌变细胞的信号通路，而不影响正常细胞形成的组织，因此在取得疗效的同时，几乎不存在痤疮样皮疹反应或痤疮样皮疹反应轻微对患者生活质量影响不大。

并且尼妥珠单抗作为人源化单抗药物，与嵌合以及鼠源单抗相比最为突出的特点就是免疫原性低。

人源化单抗药物相比嵌合单抗拥有人类成分更高，在同等的使用次数下过敏反应更轻。

而尼妥珠单抗人源成分高达95%，在临床应用过程中没有超敏反应的记录。

1.2单克隆抗体生产的特点

单克隆抗体生产有以下特点：

1.细胞培养密度有限制，长时间培养细胞活性容易下降，因此生产周期长；2.多个产品共线生产；3.单抗药物剂型为注射剂，所以必须有完善的防病毒措施；4.产品质量与常量受温度影响，因而在生产过程中需要严格控制温度[5]。

1.3生产车间设计要点

单克隆抗体的典型生产工艺流程见图1。

生产工艺流程一般分为三个阶段：

（1）上游工艺（从种子到收获）；

（2）下游工艺（从蛋白捕获到原液收获）；

（3）制剂工艺（以冻干制剂为例，从配液到成品储存）。

上游工艺涉及种子复苏等敞口操作需在层流保护下进行，并且该生产区域与其他操作活动分开，背景环境要求较高。

种子扩增阶段采用密闭的生物反应器+一次性储液袋，有效降低产品污染风险。

下游工艺涉及多步纯化和过滤工序，也多采用密闭系统，最终原液产品的过滤及封装在层流保护下进行。

图1

1.3.1生产车间洁净度要求

国家法律依据:

根据卫生部于2011年1月印发的《药品生产质量管理规范（2010年修订）》（卫生部第79号令）规定，药品生产应根据药物品种、药物剂型和生产操作要求及外部环境状况等配置空调净化系统，使生产区得到有效通风，并由空气净化系统过滤，保证药品的生产环境符合要求［6］。

洁净区压差规定:

洁净区与非洁净区之间、不同级别洁净区之间的压差应当不低于10Pa［7］。

1.3.2生产车间人流与物流控制要求

根据《药品生产质量管理规范（2010年修订）》（卫生部第79号令）［8］的要求:

1参观人员和未经培训的人员不得进入生产区和质量控制区;

2生产操作区除操作人员外，未经批准不得进入;

3洁净厂房的设计，应当尽可能减少人员流动;

4车间需设有更衣间，缓冲间供人员出入;

1.4细胞培养工艺研究现状

现在常见的细胞培养工艺有批序式培养、和补料分批培养以及灌注培养，而生物制药中最常用的是补料分批培养和灌注培养。

【9】

1在批序式培养中，因为培养过程中生物反应器不会与外界进行物质交换，所以培养基营养物会不断消耗导致细胞生长受到限制，并且随着培养时间的增加营养液中营养物质的消耗以及细胞代谢产物的积累会使细胞的培养环境发生不可扭转的变化，使得整个培养期间产生的重组蛋白糖基化不相一致最终影响产品质量。

2补料分批培养是在细胞培养期间的根据细胞生长代谢的速度在一定的时间点通过添加高含量的补料来防止细胞生长受到营养限制，其与分批、灌注和连续培养模式相比的优点是发酵液中抗体含量大，但是由于在细胞培养过程中培养液无法外排，因此细胞分泌或细胞裂解时释放的酶会在培养过程中不断累积，可能使糖链降解，导致蛋白糖型出现异质性，从而影响产品质量。

而且在使用非连续的分批或补料分批系统培养时，所获产品保留在积聚了有毒副产物的环境中既影响其质量也为下游提纯增加难度【10】。

3细胞灌注培养工艺是以一定的流速添加培养基，同时以相同的流速排出发酵液，将细胞截留在生物反应器内，由于产物与细胞代谢物及时从培养物中分离了出来，既减少了糖蛋白在生物反应器中的停留时间也保证了培养环境的稳定，从而避免糖型的异质。

因为灌注培养不断更新培养基，因此能增加生物反应器的空间利用率以及增加培养时间【11】。

细胞灌注培养与前两项工艺相比，其产物一致性强，但是对操作人员水平要求更高。

1.4.1细胞截留系统

细胞截留设备主要基于过滤、沉降、离心原理设计。

基于过滤原理设计的细胞截留设备，可以100%分离细胞，但是在截留设备中培养液多为单向流动因此滤膜容易被细胞碎片、大分子蛋白等堵塞，最终导致灌流培养的终止。

而对细胞进行离心分离，因为动物细胞只有细胞膜不能接受过高的剪切力作用，一旦离心速率过大就可能导致细胞损伤。

使用沉降和离心原理设计的设备均不能完全截留细胞，灌流速率的大小也会影响细胞分离效果。

除此之外，能否简单而有效地进行放大也成为大部分细胞截留设备应用的限制条件[12]。

基于中空纤维柱截留原理而设计的交替式切向流（alternatingtangentialflow，ATF）系统具有有效缓解滤膜堵塞，剪切力低等优点，是目前较优良的细胞截留设备[13]。

设备工作原理如图2所示，中空纤维柱通过管道与反应器相连，另一侧由高压空气泵入与真空泵抽负压的反复交替切换带动硅胶隔膜泵运动，使得动物细胞培养液通过中空纤维柱进出反应器达到更新培养液的效果。

在这一过程同时以低剪切力的情况下对中空纤维柱进行充分地冲洗，进而降低了中空纤维柱滤饼堆积效应产生的堵塞影响。

有效提交设备的运行效率。

图2

1.5毕业设计的目的和意义

本课题通过研究尼妥珠抗体制备工艺，探讨如何从实际应用中利用现有成熟的细胞灌流培养提高抗体产量以及减低车间运行费用，以满足国内外患者对尼妥珠单克隆抗体的用药需求，有利于降低药价，降低国内外患者的经济负担以减少由于经济原因而停药复发的可能性，同时在我国抗体药物生产技术应用方面树立可行方案，增加资金与人才进入单抗生产市场，而推动我国抗体药物的发展。

2.5工艺流程

2.5.1工程细胞的构建

根据同类上市产品泰欣生（尼妥珠单抗注射液，百泰生物制药有限公司）公开的氨基酸序列，人工合成尼妥珠克隆抗体重链与轻链基因。

将人工合成的重链与轻链基因片段分别插入到自行构建的一种高效质粒，分别获得重链表达pSV2-gpt质粒和轻链表达pSV-hyg质粒。

将pSV2-gpt质粒和pSV-hyg质粒分别转染包装细胞，对包装细胞进行增殖培养，制备大量两种分别携带有尼妥珠单抗重链与轻链基因的质粒。

两种质粒载体同时转染CHO-S细胞，获得可稳定表达尼妥珠单抗的工程细胞，对其进行增殖培养后通过有限稀释法筛选得到高水平分泌稳定表达尼妥珠单抗的细胞株。

2.5.2种子细胞的复苏

对工程细胞进行无血清培养液（Dynamis™AGT™）驯化后，传代、扩增后冻存于液氮中，作为工作细胞库。

细胞库中细胞传代应不超过允许的代次。

工作人员从液氮罐中取出冻存的工作细胞，置于37℃水浴锅中迅速融化，在超净台内吸出，放入已加培养基Dynamis™AGT™（赛默飞科技）的细胞培养瓶（T75）中，置于37℃、5%CO2培养箱中增殖，细胞贴壁后更换瓶内培养液继续培养直至至胞长成致密单层，传代后第3天消化传代，保留1/4的细胞终止液供其自身T75方瓶生长所需，补加培养基，放回恒温箱。

将40个T125方瓶内3/4的细胞悬浮液注入已配制好的10L培养基瓶内并充分摇匀，最后将10L细胞悬液分装到转瓶中，塞好瓶塞后放入转瓶机进行培养。

培养一天后进行种子扩增。

2.5.3种子逐级扩增与生产

发酵罐型号为SartoriusBIOSTAT.RMWave,一级发酵罐体积60L,二级发酵罐体体积300L作为一二级种子培养罐，通过种子扩倍逐级放大，在种子扩增培养过程中pH控制范围为6.75～7.30；溶氧控制范围为30～80%；搅拌转速范围为60～90rpm。

温度保持为37℃。

一级扩增：

种子液体积为10L,培养液40L,罐体体积60L，工作体积为50L积累细胞密度为1×105～2×105cells/mL后进行二级扩增。

二级扩增：

种子液体积为50L，培养液230L，罐体体积300L，工作体积为280L累积细胞密度为2×105～3×105cells/mL后进行生产罐体接种。

生产：

种子液体积为280L，培养液1020L，罐体体积为1500L,工作体积为1300L。

37℃扩增培养，开启管道阀门；进行培养液的补充和排放，流速设定为60L/d。

第3d，降温至33℃；进行抗体生产。

2.5.4连续灌流培养

为在长时间的培养保持细胞活性，培养条件设为温度33℃【14】,pH7.2,搅拌速度65～80rmin,溶氧45%～50%,四气混合系统供气（O2、空气、CO2、N2）,

发酵生产时培养基添加速度与流出速度相等，设为200L/d。

中空纤维柱选择截留150KD以上分子量的超滤膜，细胞培养液在隔膜泵的抽提作用下，反复冲刷中空纤维柱滤膜内测，这个过程中细胞被中空纤维柱截留并随液体流动方向脱离纤维柱表面防止形成滤饼堵塞孔道，而培养基中小于150KD的物质和抗体扩散到中空纤维柱膜外侧。

中空纤维柱滤膜外侧设置培养基排放储液瓶以及灌流培养基储液瓶并与其相连，对排放液进行收集的同时，向反应器内流加新鲜的灌流培养基。

ATF系统采用150KD孔径中空纤维柱截留细胞，属于稳态灌流培养，发酵罐内CHO细胞活性能保持40~60天【15】。

本工艺55天后停止培养，排出所有液体进行罐体清洁消毒后，再进行下一批发酵培养。

2.5.5抗体提纯

层析系统使用的SCG蛋白纯化系统（苏州赛分科技有限公司），层析介质为MabSelectSuRe，最大结合容量：

约60mg/ml，实际工作载量按50g/L上样，单次上样体积为200L，蛋白浓度为2g/L,确定层析柱Tricorn10/30（GE公司）高80cm，直径为20cm。

设定流速为20ml/min，缓冲液使用醋酸盐缓冲系统。

3倍柱体积的平衡缓冲液（20mMHAc+0.15MNaAc，pH5.2）平衡层析柱，将发酵液按照以50mg/mlgel的载量上样，3倍柱体积的平衡缓冲液洗涤至UV、pH和电导值至基线，3倍柱体积的预洗脱缓冲液（20mMHAc+1MNaAc，pH5.2）除去非特异吸附的蛋白质，再用3倍柱体积的平衡缓冲液平衡至UV、pH和电导值至基线，最后用3倍柱体积的洗脱缓冲液（20mM柠檬酸缓冲液，pH3.6）洗脱，收集洗脱峰。

流速控制：

洗脱200ml/min，保存200ml/min，其它步骤250～350ml/min。

洗脱后预计样品体积为24L。

蛋白含量为16.6g/L。

2.5.6病毒灭活

病毒灭活工艺采用低pH孵放法。

IgG1类抗体灭活病毒采用的低pH值为3.5。

工艺操作如下：

2倍冷却注射用水稀释亲和层析洗脱收集的样品，2M柠檬酸调节pH值至3.5，在18～26℃下孵放2h，完成病毒的灭活。

灭活后样品体积为24+48=72L。

蛋白浓度为5.55g/L。

2.5.7核酸与内毒素的去除

选用QSepharoseFF填料（GE公司），载量为110mgBSA/ml。

实际工作载量按100g/L上样，单次上样体积为72L，蛋白浓度为5.55g/L,确定层析柱Tricorn10/30（GE公司）高40cm，直径为20cm。

用3倍柱体积的平衡缓冲液（20mMPB，pH7.2）平衡层析柱，上样至层析柱中，出现紫外吸收值时开始收集流穿液，上样结束后再用平衡缓冲液冲洗柱子，当UV值下降至基线时停止收集流穿液，再用3倍柱体积的洗涤缓冲液（20mMHAc+1MNaAc，pH7.2）洗涤层析柱，最后用3倍柱体积的0.5MNaOH溶液清洗层析柱。

所有步骤流速都控制在速控制在250～350ml/min。

2.5.8精细纯化

在纯化工艺中阳离子交换层析常与阴离子交换层析串联使用提高原液单抗纯度。

在阳离子交换层析中，核酸和内毒素因为带负电而不结合阳离子交换层析介质。

在一定的操作条件下酸性较强的ProteinA不结合阳离子交换介质，从而实现与抗体的分离。

另外，阳离子交换层析还可以去除病毒和多聚体。

[16]

选用GE公司的SPSepharoseFF填料，载量为100mg/ml。

实际工作载量按100g/L上样，单次上样体积为24L，蛋白浓度为16.6g/L,确定层析柱Tricorn10/30（GE公司）高40cm，直径为20cm。

3～5倍柱体积的平衡缓冲液（20mMCH3COONa，pH5.2）平衡层析柱，将Q柱收集流穿液调pH值至5.2，稀释至电导＜3.5mS/cm后上样，使用3倍柱体积的平衡缓冲液洗涤至UV、pH、电导到基线，使用3倍柱体积的洗脱缓冲液（20mMNaAc+1MNaCl，pH5.2）洗脱，收集主峰，3倍柱体积的洗涤缓冲液（20mMNaAc+1MNaCl，pH5.2）洗涤层析柱，最后用平衡缓冲液平衡层析柱。

流速控制在250～350ml/min。

洗脱后预计样品体积为24L。

蛋白含量为16.6g/L

2.5.9病毒过滤

用注射用水润湿VPF预过滤膜（庆鼎科技），然后串联VPro除病毒纳滤膜（庆鼎科技），并用注射用水润湿。

使用C3A相（20mMCH3COONa，pH5.2）平衡VPF和VPro滤膜，精细纯化后的洗脱收集液用C3A相稀释原液蛋白浓度为10g/L至后上样到滤膜中，过滤原液蛋白浓度为20g/L后。

过滤压力要求：

膜前压力＜0.21Mpa，过滤时间要求：

＜2h。

2.5.10原液保存

封装后原液的贮存条件为-70±10℃避光密闭保存。

3.物料衡算

产品名称：

尼妥珠单抗原液

批次产量：

本生产工艺为连续灌流，培养液流出速为200L/d,一个批次的生产周期为55天。

即发酵液批次产量为60×55=11000L，经纯化流程后体积缩小为1100L.浓度为20g/L