铁皮石斛愈伤组织诱导培养中的污染问题.doc
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学院：
生命科学与技术学院
专业：
农学
学号：
201101130056
姓名：
曾通明
指导老师：
薛春丽
铁皮石斛愈伤组织诱导培养中的污染问题
曾通明
（红河学院生命科学与技术学院，云南蒙自661100）
摘要以铁皮石斛无菌苗的茎段作为外植体，讨论MS培养基中添加不同浓度的激素对铁皮石斛的诱导、增殖、分化以及生根的影响。
结果表明：
最适合铁皮石斛茎段根诱导的培养基为MS+IBA1.5mg/L+香蕉汁100g/L。
同时以铁皮石斛愈伤组织培养快速繁殖过程中出现了各种污染，并以此为对象,分析污染发生的原因,研究对此应采取的控制措施。
结果表明:
外植体的消毒灭菌程度和接种过程中是否存在有菌环境等是引起污染的主要因素，而细菌和真菌是引起污染的次要因素;污染在组织培养的每一步骤都会发生;注重无菌操作的训练,提高操作水平是降低污染率的重要手段。
关键词：
铁皮石斛；诱导；组织培养；污染
前言铁皮石斛（Dendrobiumofficinale）是兰科石斛属植物，又名铁皮枫斗、黑节草，主要分布于云南、安徽、贵州、浙江、江西、广东、广西等地，不仅是名贵的室内盆栽花卉，还是一种珍贵的中药材，在《神农百草经》中记载，铁皮石斛具有滋阴清热，生津益胃，润肺止咳，润喉明目，延年益寿的功效，是日常生活的保健佳品。
天然状态下主要生长于悬崖峭壁上，自然繁殖力低，加上药农掠夺性挖采，造成自然资源匮乏、濒临绝迹的境况。
而常规条件下人工繁殖又较难，长期以来组织培养在植物生产中得到广泛应用，是产生极大经济效益的一项生物技术[1]。
1试验材料与方法原理
1.1试验材料和用具
材料：
多年生铁皮石斛植株茎段。
实验药品：
1/2MS基本培养基、琼脂、NAA、6-BA、70%酒精、0.1%Hgcl、无菌水等。
实验用具：
超净工作台、高压蒸汽灭菌锅、PH试纸、分析天平、酒精灯、剪刀、镊子、试管、培养瓶、烧杯、移液管、量筒、脱脂棉、火柴、手术刀等。
1.2实验原理
已有特定结构与功能的植物组织，在一定条件下，其细胞被诱导改变原来的发育途径，逐步逆转其原有的分化状态，转变为具有分生能力的胚性细胞，这个过程称为脱分化（dedifferentiation）。
来自于植物各种器宫的外植体在离体培养条件下，细胞经脱分化等一系列过程，改变了它们原有的特性而转变形成一种能迅速增殖的无特定结构和功能的细胞团，即愈伤组织。
一般情况下，植物各器官和组织均有诱导产生愈伤组织的潜在可能性。
植物生长调节剂是诱导愈伤组织形成的极为重要的因素。
生长素是用于诱导愈伤组织形成的生长物质，常用的种类有2,4-D,IAA和NAA,所需浓度在0.01～10mg/L范围内；常用的细胞分裂素是激动素、玉米素和6-BA，使用的浓度范围在0.1～10mg/L。
对有些植物材料而言，生长素和细胞分裂素对保持愈伤组织的快速生长是必要的，特别是两者结合使用时，能更强烈地刺激愈伤组织的形成。
来自于不同植物、同一植物的不同器官或组织，产生的愈伤组织在质地和物理性状方面是有差别的。
在一定条件下，离体的外植体可以形成愈伤组织（即一块未分化的组织），形成愈伤组织的过程也是细胞的脱分化过程。
已有的实验表明，所有的多细胞植物，包括双子叶植物和单子叶植物，都有诱发愈伤组织形成的潜在可能性。
一般认为诱发愈伤组织成败的关键不在于植物材料的来源，而在于培养的条件。
外植体上损伤的细胞能释放一种自溶产物，对诱导细胞的分裂起着重要的作用。
一般要经过愈伤组织的细胞脱分化、人工诱导再分化两个不同的阶段，因此在这些实验中愈伤组织的诱导是否成功也是关键的基本因素。
总之，愈伤组织诱导条件的选择在植物细胞培养技术中占据着非常重要的地位。
1.3试验方法
1.3.1无菌系建立
从1多年生铁皮石斛植株上选择生长健壮的茎段，摘去叶片和膜质叶鞘，剪成约2cm长带节的小段，用洗衣粉清洗后置流水下冲洗20min。
在超净工作台上用75%的酒精消毒30s，0.1%HgCl2灭菌5min后，用无菌水冲洗5~6次，放入垫有干无菌滤纸的培养皿中，以吸去多余水分，茎段两端各切去0.2~0.3cm，插入备好的垫有干且无菌的培养皿中，等待接种。
1.3.2培养基配制
配方：
A.愈伤组织诱导的培养基配方是1/2MS+1.5mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+30g/L蔗糖+7.5g/L琼脂+外源添加物。
B.外源添加物：
香蕉、马铃薯、番茄
I、以MS为基本培养基，根据正交试验设计的配方进行配制：
配制母液
Ⅱ、取少量的蒸馏水（约为配制培养基量的2/3）加入烧杯中。
Ⅲ、加琼脂7.5g/L，边加热边搅伴。
Ⅳ、加入蔗糖30g/L，边加热边搅伴。
Ⅴ、按母液顺序和规定量，用量筒、移液管或微量移液器取母液，依次放入烧杯中。
Ⅵ、通过计算，用微量移液器取所需的各种生长调节剂母液。
Ⅶ、定容：
当琼脂、蔗糖溶解，试凝成功后，用蒸馏水水定容至所配制的数值。
Ⅷ、调pH值：
用1mol/LNaOH和1mol/LHcl将pH调至所需的数值，一般pH=5.4。
Ⅸ、分装,将配制好的培养基分装到培养瓶中，每瓶30ml左右。
Ⅹ、封口：
用瓶盖、棉塞或锡箔纸、牛皮纸。
注明培养基编号、配制人、配制时间。
ⅩⅠ、培养寂灭菌：
手提式高压蒸汽锅灭菌。
D.实验处理设计选取外植体、细胞分裂素6-BA、生长素NAA、外源添加物进行不同因素处理的培养基配置实验，其中每一因素取三个水平，进行考察上述因素对铁皮石斛愈伤组织诱导的影响。
如下表：
表一铁皮石斛愈伤组织诱导的正交实验因素水平表头
水平
1/2MS
因素
A．外植体
B．６－BA
C．NAA
C．外源添加物50g/L
1
带腋芽茎段
0.50
0.25
香蕉50g/L
2
叶
1.00
0.50
马铃薯50g/L
3
茎尖
1.50
0.75
蕃茄汁50g/L
表二铁皮石斛愈伤组织诱导的正交试验处理表
处理号
A
B
C
D
1
1
1
1
1
2
1
2
2
2
3
1
3
3
3
4
2
1
2
3
5
2
2
3
1
6
2
3
1
2
7
3
1
3
2
8
3
2
1
3
9
3
3
2
1
其中，每个处理配制培养基5瓶，小计共配制培养基45瓶。
1.3.3铁皮石斛茎段接种
将备好的洁净外植体在超净工作台上进行接种。
首先穿戴好实验服，脚套，头套等装备，然后将手用洗衣粉冲洗多次方可进出接种室。
接种前应把接种工具插入灭菌炉进行高温灭菌，一定时间后取出冷却至不烫手进行夹取外植体接种，每瓶接种3个点，同时应点燃酒精灯，以避免有杂菌混入时将其杀死。
接种完毕后迅速将培养瓶用封口膜将其封严，贴上标签，再将这些接种好的培养瓶放到培养室进行培养。
1.3.4铁皮石斛愈伤组织的诱导培养与观察
接种铁皮石斛培养材料的组培苗在组织培养室里培养。
培养条件：
温度21—23℃，光强为1500-2000Lx，光照时间12h/d为宜，每三天观察记录一次。
2结果与分析
2.1观察结果
由于操作不当出现了一下结果：
第十二天观察时，除去被污染的只剩下三瓶，且都只出现了一小团愈伤组织。
表三污染及生长状况统计
处理
第三天
第六天
第九天
第十二天
污染
情况
生长
状况
污染
情况
生长
状况
污染
情况
生长
状况
污染
情况
生长
状况
①
0瓶
—
1瓶
—
1瓶
—
3瓶
—
②
1瓶
—
0瓶
—
2瓶
—
2瓶
—
③
1瓶
—
0瓶
—
1瓶
—
1瓶
出现一团绿色
④
0瓶
—
1瓶
—
1瓶
—
2瓶
出现一团绿色
⑤
1瓶
—
1瓶
—
2瓶
—
1瓶
—
⑥
0瓶
—
1瓶
—
1瓶
—
3瓶
—
⑦
2瓶
—
0瓶
—
1瓶
—
2瓶
—
⑧
0瓶
—
1瓶
—
3瓶
—
1瓶
—
⑨
1瓶
—
3瓶
—
1瓶
—
0瓶
—
注：
“—”表示没有生长或已污染
2.2污染现象
在组织培养中污染经常发生又难以控制。
造成污染的原因多种多样,如外植体的种类,取材的季节、时间、预处理方法,消毒药剂的种类、浓度,消毒时间,消毒方法,培养基和器皿灭菌,操作人员,工作环境,超净工作台的工作质量等都与污染密切相关,导致污染成因的复杂性[2]。
依据上述因素,将污染原因归结为3个方面:
一是组织培养室或接种室的清洁问题;二是外植体自身带菌;三是组织培养过程各环节操作不适宜或不严格。
其现象有二：
第一，培养基表面有一层黄色或粉红色糊状黏物；第二，其培养基表面及其外植体周围有数团白色或淡红色斑点。
图一
2.3讨论与分析
影响污染的因素概括起来主要有两方面：
一是植物本身带菌（简称外生菌）所造成的污染。
外植体带菌是不易清除的，特别是外植体内部所带的菌（简称内生菌），特别难消除。
二是组织培养工艺过程中的各个环节操作不当或不严格而带菌[5-6]所导致的污染。
具体分析起来有以下几方面的污染因素[3]。
2.3.1外植体带菌
选取幼年植株或生理年龄为幼态的材料；外植体要求杂菌少、易启动且内生菌少，宜选取生长健壮的植株材料，如胚和无病害的茎尖；从温室或人工气候室生长的植株上选取外植体，选取水培抽出的茎段、叶片等；新萌发的萌蘖条，新生的枝条、茎尖、叶片、叶柄；黄化处理后的枝条；表面污染较重的可对母本植株进行修剪，待长出新枝后再取外植体；选取表面积小的材料。
一般以材料积累了丰富的营养和内源激素为宜，此时材料抵抗病原菌的能力较强或病菌较少，以材料休眠末期或萌动前期取材较为有利，取材多在晴天中午阳光最强时进行；取材部位以材料中下部较好[4]。
2.3.2接种苗黄化
黄化是指试管苗幼苗整株失绿,全部或部分叶片黄化、斑驳的现象。
主要因素有：
第一，培养基成分，即培养基中铁元素不足,矿物质营养不均衡,激素配比不当。
糖用量不做活已耗尽；第二，培养条件，即培养瓶通气不良,温度不适,光照不足；第三，抗生素类即培养基中添加一些抗生素类物质[5]。
2.3.3细菌污染
细菌性污染的主要症状是材料附近出现黏液状和发酵泡沫状物体,或在材料附近的培养基中出现混浊和云雾状痕迹。
一般在接种后1~2d即可发现。
细菌污染主要由外植体带菌或培养基灭菌不彻底以及操作人员操作不慎造成。
外植体带菌污染的解决措施是对外植体进行彻底消毒。
即根据不同材料选择合适的消毒剂和消毒方法;对特殊材料先进行预处理;对材料内部带菌的组织,在培养基中加入适量抗生素,以达最佳消毒效果。
此外,培养基的灭菌力求彻底,而且操作人员要严格按照无菌操作顺序操作[6]。
2.3.4操作错误
由于接种人员的疏忽，将其蒸馏水误当无菌水用，从而直接导致培养基的污染，实验的失败。
3防止和克服污染的措施
由于造成污染的原因是多方面的,故应具体分析,从不同方面预防和解决。
3.1接种室的灭菌
在每次接种前半个小时,用20%的新洁尔擦洗室内设备、工作台面,再用紫外线灯照射20min。
使用前还可以喷洒70%的乙醇,使空气中灰尘迅速下降。
在进行组培时。
除了培养基、接种材料、器皿和用具保证无菌外,同时在接种时还需要严格进行无菌操作。
3.2植物材料的选择及防止污染
由于不同的植物材料品种,不同的取材部位、取材大小、取材年龄以及取材时期,其带菌量不同,为此在取材时应仔细选择,以减少污染的发生。
一般在春季采集生长健壮的材料为佳,在连续晴天的中午取材,选取洁净、生长旺盛的部位,现取现灭菌[7].
3.3接种过程中
接种人员应修剪过长指甲；进入接种室前双手用肥皂清洗干净，用70％酒精喷洒双手；接种时再用70％酒精棉仔细擦拭双手，接种过程中经常擦拭双手；接种前和接种过程中经常擦拭工作台面；进入接种室后换拖鞋、工作服、帽子和口罩，定期清洗工作服、帽子、口罩、拖鞋，并采用高压湿热灭菌处理，接种前对其进行紫外线照射；接种前仔细观察培养容器中的培养材料；培养容器中培养物宜少接种；超净工作台上物品不要摆放过多、过高；接种时用鼻子呼吸，手不要超出工作台面，不要接触器皿边缘，不要放在器皿、接种器械上方；解开橡皮筋、打开培养容器的塞子、盖或封口膜时动作要轻，培养容器应倾斜拿，用酒精灯火焰灼烧瓶口或在火焰附近打开封口膜来杀菌；接种器械每使用1次就要彻底灭菌，一定要在下风方向操作；中途离开超净工作台后应对接种室继续灭菌后方可接种，不要中途将培养基、器械等拿入。
4总结
有效地控制污染是植物离体培养成功的关键。
培养基和无菌操作方面的污染目前已经得到控制。
外植体造成的污染最复杂，也最难控制，其原因可能是由于细引起的，也可能是真菌引起的。
微生物可能是腐生的，也可能是内生的，最难处理的则是内生菌。
铁皮石斛外植体含有较多的内生真菌，从铁皮石斛根中分离出内生真菌约25种，因此铁皮石斛的外植体消毒应特别注意也较为困难【9】。
4.1结语
科学的不断发展,使得植物组培技术的应用前景越来越广阔。
为了更好地完善这项工艺,控制或降低污染率是其关键技术。
近年来,除上面提到的一些有效措施外,污染的控制已从治标开始走向了治本,通过笼统地控制杂菌污染走向了分离、纯化检测菌种,然后针对性地加抗真菌剂或抗菌素来抑菌[10]。
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