DAPI和Hoechst-PI染料.doc

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DAPI

DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole），是一种能够与DNA强力结合的荧光染料，常用于荧光显微镜观测。

因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。

DAPI介绍

在荧光显微镜观察下，DAPI染剂是利用紫外光波长的光线激发。

当DAPI与双股DNA结合时，最大吸收波长为358nm，最大发射波长为461nm，其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。

DAPI也可以和RNA结合，但产生的荧光强度不及与DNA结合的结果，其发散光的波长范围约在500nm左右。

DAPI的发散光为蓝色，且DAPI和绿色荧光蛋白（Greenfluorescentprotein,GFP）或TexasRed染剂（红色荧光染剂）的发散波长，仅有少部分重叠，研究员可以善用这项特性在单一的样品上进行多重荧光染色。

DAPI能快速进入活细胞中与DNA结合，因此DAPI对生物体而言，也被视为一种毒性物质与致癌物。

使用过程中应注意操作与抛弃的处理程序。

中文名：

4，6-联脒-2-苯基吲哚（?

）

英文名：

4',6-diamidino-2-phenylindole，2-（4-amidinophenyl）-1H-indole-6-carboxamidine，DAPIdihydrochloride

分子式：

C16H15N5

分子量：

277.324

CASnumber：

28718-90-3

光谱性质：

DAPI的最大激发波长为340nm，最大发射波长为488nm

与双链DNA结合时最大吸收/最大发射为358nm/461nm；与RNA结合时，最大发射移动到400nm左右。

DAPI染色原理：

DAPI为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。

显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记的效率高（几乎为100%）。

DAPI染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。

DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。

细胞经热激处理后用DAPI染色3分钟，在荧光显微镜下可以看到细胞核的形态变化。

a、正常的烟草细胞核：

核形完整，染色质均匀。

b、染色质固缩，向外周聚集，形成周边化。

c、染色质进一步固缩，形成很多颗粒物质。

d、细胞核破裂形成碎片，核解体。

染色步骤：

在细胞移植前，将DAPI以一定的浓度加入培养基中，与细胞共同孵育过夜，用PBS缓冲液漂洗至少6次以洗掉未结合的DAPI，再用酶消化后离心收集细胞，加入DMEM培养基制成细胞悬液以备用。

存储条件：

-20℃避光保存

每次使用，用量较少，可反复冻融，无需分装

注意事项：

1、DAPI强烈致癌，操作时要戴上手套。

2、贮存液用70%酒精配制，浓度100μg/ml，可用黑纸包住，长期冻存。

使用液按1:

1000用PBS稀释，最终浓度100ng/ml。

3、DAPI是非常优秀的DNA染料，固定过和没有固定过的活细胞均可用DAPI染色。

Hoechest染色

三种染料都可在350nm左右的紫外光激发。

都在461nm处发出蓝靛色荧光。

未被结合的染料最大发射光在510到540nm之间。

可被氙-氩灯或水银-氩灯或紫外激光激发。

激发光和发射光之间的斯托克斯位移巨大，故可用于多染料多颜色荧光染色。

Hoechst染料的荧光强度随着溶液pH升高而增强。

Hoechst染料溶于水和有机溶剂，如二甲基甲酰胺或二甲基亚砜。

浓度可高达10mg/mL.水溶液可在4°C避光保存至少6个月。

长期储存于≤-20°C

Hoechst与DNA双链中的小沟（minorgroove）结合，更倾向与于富含A/T（腺嘌呤/胸腺嘧啶）的DNA链。

虽然说它能与所有的核酸结合，但是富含AT的双链DNA使荧光强度显著增强。

Hoechst可穿过细胞膜，可结合于活细胞或固定过的细胞。

因此可用于活细胞标记。

Hoechst是一种膜通透性的荧光染料，故正常细胞和中早期调亡细胞均可被Hoechst着色，但是正常细胞核Hoechst染色的形态呈圆形，淡蓝色，内有较深的蓝色颗粒；而调亡细胞的细胞核由于浓集而呈亮蓝色，或核呈分叶，碎片状，边集。

常用Hoechst33258和Hoechst33342，前者渗透性不如后者好，多用于活细胞染色，而后者活细胞和死细胞均可。

Hoechst33342能透过胞膜完整的细胞,嵌入细胞核DNA,使之发出明亮的蓝色荧光。

凋亡的细胞核染色增强,荧光更为明亮,呈圆状或固缩状、团块状结构。

非凋亡细胞核呈现荧光深浅不一的结构样特征。

二者形态迥然相异,很易判别。

Hoechst染色方法：

1.贴壁细胞

A.取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养级PBS或0.9%NaCl等洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。

将盖玻片置于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%-80%满。

B.刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入固定液，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。

C.去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，吸尽液体。

洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。

D.加入终浓度为10μg/ml的Hoechst染色液，染色5分钟。

也宜用摇床，或手动晃动数次。

E.用PBS或0.9%NaCl洗两遍。

F.将贴有细胞的盖玻片盖于载玻片上，尽量避免气泡。

切勿弄反。

G.荧光显微镜或激光共聚焦显微镜检测。

2.悬浮细胞

A.离心收集细胞样品于1.5ml离心管内，加入固定液，缓缓悬起细胞，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。

B.离心去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。

C.最后一次离心后吸去大部分液体保留约50μl液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。

D.稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。

E.均匀滴加Hoechst染色液，染色5分钟。

用吸水纸从边缘吸去液体，微晾干。

F.用PBS或0.9%NaCl洗两遍。

G.盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。

H.荧光显微镜或激光共聚焦显微镜检测。

3.组织切片

A.对于任何常见切片，处理至常规可以进行免疫染色时，或完成常规的免疫染色后，即可进行后续的Hoechst染色。

B.PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。

洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。

可在六孔板中操作。

C.加入Hoechst染色液，染色5分钟。

也宜用摇床，或手动晃动。

D.用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。

E.将切片置于载玻片上，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。

F.荧光显微镜或激光共聚焦显微镜检测。

荧光物质均易发生淬灭，染色后的样品宜避光。

在使用抗淬灭封片液的情况下可以减缓淬灭，但仍宜尽量避光。

注意控制染色时间，染色时间过长容易出现假阳性。

PI单染

将处于对数生长期的细胞，经过不同浓度的药物处理不同时间后，离心（1000rpm，5min）收集贴壁和悬浮的所有细胞，PBS洗涤，再次离心（1000rpm，5min），每个离心管的细胞重悬于500μL预冷的PBS中，缓慢注入3mL预冷无水乙醇进行固定，4℃下保存（可保存1～2周），待检。

细胞上机检测前低速离心除去乙醇，PBS洗涤2次，每个离心管分别加入500μLPBS重悬细胞，然后加入10μL10mg/mL无DNase的RnaseA，37℃孵育30min，转入冰浴，加入25μL10mg/mLPI，冰上避光染色30min，300目筛绢过滤，于EPICSXL型流式细胞仪中进行检测及分析数据。