荧光素酶报告基因检测.doc

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荧光素酶报告基因检测

l        原则

荧光素酶检测系统，可用裂解液来温和而快速地提取真核细胞中的荧光素酶，用其底物来检测荧光素酶活性。

检测步骤如下：

1）         加裂解缓冲液裂解转染的细胞。

2）         将上述裂解物转移入微孔板或者试管中（根据检测的需要选择所用器材类型）。

3）         加入含有所有酶反应成分（必须包括底物荧光素），使化学发光反应开始。

4）         用荧光仪或者液闪计数仪检测所发射的荧光。

l        特点

u        敏感度和检测范围：

5fg荧光素酶

u        发射光的线性范围：

10fg—10ng

u        确切的检测限依检测仪器而定。

u        特异性：

本文介绍的荧光素酶报告基因系统的操作步骤，通常用来检测转染了萤火虫荧光素酶基因的真核细胞中荧光素酶表达的活性。

不适用于对细菌荧光素酶进行检测。

l        器材和试剂

u        器材

在微孔板或试管中，用自动或手动荧光仪、液闪计数仪或者摄影胶片都可以检测到荧光素酶活性，而且高度敏感。

当用微孔板时可以是白色，也可为黑色。

u        试剂

1）        荧光素酶检测试剂：

荧光素酶检测试剂包括荧光素、ATP、CoA、以及一些添加剂，这些试剂可以启动酶反应。

这种荧光酶检测试剂的混合物可稳定保存在在-60℃以下12个月，-15℃~-25℃一个月，2℃~8℃只能保存一周。

避免反复冻融。

应避光保存，因为荧光素在光照下会发生氧化。

2）        裂解缓冲液：

下面将加以介绍。

l        基本操作步骤

下面的操作步骤适用于培养的真核细胞。

提取物必须立刻检测，否则必须在-15～-25℃储存大约一个月。

不要反复冻融以避免酶活性的降低。

1）         将荧光素酶报告基因与b-gal对细胞进行共转染，按实验计划进行处理。

2）         彻底吸去培养皿（60mm）中的细胞培养液，用冰预冷的磷酸盐缓冲液（PBS，无钙和镁离子）小心冲洗细胞3次，彻底去除剩余的PBS。

10×PBS缓冲液：

NaCl100g，KCl2.5g，Na2HPO414.4g，KH2PO42.5g，用三蒸水定容至1000ml。

3）         加入最小体积的Triton/甘氨酰甘氨酸裂解缓冲液盖过细胞，例如60mm的培养皿用360ml裂解液，35毫米的培养板用150ml裂解液。

用橡皮刮将细胞刮离培养皿。

将裂解物转移到微量离心管中。

Triton/甘氨酰甘氨酸裂解缓冲液：

1%（v/v）TritonX-100，25mmol/L甘氨酰甘氨酸（pH7.8），15mmol/LMgSO4，4mmol/LEGTA，1mmol/LDTT（临用前加入）

4）         在漩涡混合器上轻轻振荡细胞裂解液，以最大速度4℃离心以去除细胞碎片。

将上清转移到另一个微量离心管中，置于冰上以备分析。

5）         在开始化学发光反应之前，将100ml的细胞提取物转移到荧光仪或者液闪计数仪所用的检测器皿中（我们建议用96孔板）。

加入360ml荧光素酶分析缓冲液。

荧光素酶分析缓冲液：

25mmol/L甘氨酰甘氨酸（pH7.8），15mmol/LMgSO4，4mmol/LEGTA，2mmol/LATP，1mmol/LDTT（临用前加入）

6）         用25mmol/L（pH7.8）的甘氨酰甘氨酸稀释荧光素至200mmol/L。

荧光素贮液：

1mmol/LD-荧光素（合成晶体蛋白，Sigma），25mmol/L甘氨酰甘氨酸（pH7.8），10mmol/LDTT。

（分成1ml小份，-70℃保存在避光盒中几个月）

7）         样品中加入200ml稀释的荧光素液。

荧光素在光照下迅速发生氧化，因此丢弃未用完的荧光素稀释液。

在562nm条件下进行检测。

l        注意事项：

1）         荧光素酶检测试剂需在15-25℃的条件预平衡后再进行反应，而后依据具体条件进行自动或手动检测。

当用液闪计数仪时，加入荧光素酶检测试剂后立即轻轻混匀。

.加入荧光素酶检测试剂0.5-10秒内开始检测发射光1-5秒，持续发光20秒后，产生光强度降低，其半衰期为5分钟。

2）         如果细胞裂解后不能立即对提取物进行检测，样品可以在冰上保存大约5个小时，在-70℃可保存数月。

3）         利用上述方法检测冷的样品时，其信号强度将下降5-15%。

4）         在荧光素酶活性较高的情况下，导致信号超出线性范围（信号溢出），可用裂解液将样品进行稀释。

5）         我们建议不要储存稀释过的样品。

如果必须保存，要在稀释的样品中加入BSA至终浓度为2.5mg/mL，这样可以保持样品的稳定性。

6）         如果样品中的荧光素酶的活性较高，应尽可能减少所用来检测的样品的体积。

在这种情况下，按照标准操作，可以相应减少所使用的荧光素酶检测试剂（荧光素酶试剂体积/样品体积=100ml/20-50ml），这样对检测结果没有影响。

7）         一些荧光仪在进行检测前需要1-2秒的稳定，因此，我们建议在开机后过一段时间再进行检测操作。

8）         有一些荧光仪需要在不改变样品体积的条件下加入更多的检测试剂（如300ml）,这与所给定的标准的操作（50-100ml）有所不同。

9）         如果用液闪计数仪，要逐个加入检测试剂后逐个立即检测。

荧光素酶报告基因检测结果需要用b-gal进行校正，既荧光素酶报告基因检测结果