酵母菌感受态制作及转化.doc

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Y187酵母感受态制作及转化

1）挑新鲜单菌落Y187于8mlYPDA培养液，30℃，250rpm培养16-18h；

2）至OD600＞1.5，1：

10转接，此时OD600≈0.3；

3）30℃，250rpm，4-7h，每2h检测一次，直到OD600=0.4-0.6；

4）转入2个50ml离心管，5100rpm,5min,弃上清；

5）加入1/2VddH2O,洗涤细胞，5100rpm,5min,弃上清；

6）每管中分别加1ml1×TE/LiAc，冰上混匀，10000rpm，15s，去上清；

7）每管中分别加0.5ml1×TE/LiAc，冰上混匀，10000rpm，15s，去上清；

8）每管中分别加0.5ml1×TE/LiAc，冰上混匀，10000rpm，15s，去上清；

9）每管中分别加0.4ml1×TE/LiAc，每管100ul分装；

10）分别加入100ng左右DNA（plasmid）和0.1mg鲑鱼DNA（10mg/ml,10ul）,移液器抽吸混匀溶液；

11）分别加入600ulLiAc/PEG，高速混匀（10s-1min内）；

12）30℃摇床恢复30min；

13）超净台（无菌条件下）加入70ulDMSO,轻轻颠倒混匀；

14）42℃热激15min；

15）冰上放置1-2min；

16）14000rpm,15s,去上清；

17）300ulTE重悬细胞；

18）100ul/1ul分别涂布于YPDA平板；

100ul/1ul分别涂布于SD/-Trp单缺陷平板；

100ul/1ul分别涂布于SD/-Trp/-His双缺陷平板上，30℃倒置培养48-72h可见转化菌落。