乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证.doc

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毕业论文

GRADUATETHESIS

论文题目：

乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证

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2016年10月31日

目录

毕业论文

学号：

1

乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证 3

中文摘要 3

前言 5

1.材料与方法 5

1.1试剂盒 5

1.2仪器 5

1.3方法 5

2.结果 7

2.1标准曲线与线性范围 7

2.2准确度（回收率）的验证 8

2.3精密度的验证 9

2.4检测限（LOD）计算 12

3.讨论 13

3.1乙肝表面抗原定量分析的意义 13

3.2常用定量分析方法 13

3.3方法概述 14

3.4方法学验证内容 14

4.结果分析及应用评价 15

参考文献 16

综述 17

致谢 18

18

摘要

乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证

摘要

目的：

随着免疫学技术的不断发展,抗原抗体检测灵敏度不断提高,使得乙肝病毒低水平的检测成为了可能，本实验就是对上海酶联生物有限公司生产的乙肝表面抗原的ELISA法定量分析试剂盒进行方法学验证，以判断该试剂盒是否能用于临床低浓度样本的定量分析。

方法：

HBsAg的ELISA法定量分析，用浓度为8ng/ml标准品溶液做2倍稀释的6个浓度梯度做标准曲线，以6，3，1.5ng/ml3个浓度梯度5复孔做准确度，精密度和检测限等方法学验证。

结果：

标准曲线R2=0.9979，显示具有良好的相关性；检测限为LOD为0.167ng/ml；准确度99.03%，准确度好；板内精密度和板见精密度方面都表现在低浓度样品（<1.5ng/ml）的检测低于高浓度样品，重复性差。

故不适合低浓度样品的检测。

结论：

由于该试剂盒在低浓度样本测量上的精密度差，故该公司生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒不可以用于临床生物低浓度样品的分析。

关键词HBsAgELISA定量分析方法学验证

Abstract

ThereificationoftheHBsAgELISAquantitativemethodology

Abstract

Object:

Withthecontinuousdevelopmentofimmunologyandtechnology,increasingantigenantibodydetectionsensitivity,makesthedetectionoflowhepatitisbvirus，toverifythequantitativemethodologyofShanghaienzymelinkedBiologicalTechnologytomakesurewhetheritcabeusedtotheanalysisofClinicalSample.Methods:

ELISAquantitativemethodology,makeanApplicationofthestandardHBsAgkitfromtheconcentrationof8ng/mldo2timesdilutedsixconcentrationgradienttoconstituteastandardcurve,testingWith6,3,1.5ng/ml3aconcentrationgradient5accuratelypreciseanddetection.Results:

R2=0.9979,standardcurveshowedgoodcorrelation;DetectionlimitforLODis0.167ng/ml;99.03%accuracy,goodaccuracy;Precisionandprecisionoftheplateintheplatehasperformanceinlowconcentrationsample（<1.5ng/ml）detectionislowerthanthehighconcentrationsamples,poorrepeatability.Soisnotsuitablefordetectionoflowconcentrationsamples.Conclusion:

Becausethekitonthelowconcentrationsamplemeasurementprecisionispoor，sotheELISAquantitativeanalysiskitofHBsAgcannotbeusedfortheanalysisofClinicalSample.

Keywords:

HBsAg;Quantitativeanalysis;Verification;Methodology.

研究论文

乙肝表面抗原的ELISA法定量分析方法学验证

前言

根据流行病学调查,我国人群乙型肝炎病毒感染率为10%左右,乙型肝炎病毒（HBV）感染是最常见的传染病之一。

实验室诊断乙型肝炎对其治疗和预防有重要的参考意义而HBsAg是乙肝病毒感染最早的血清标志物,因此乙肝表面抗原检测是一个重要的乙型肝炎病毒感染的诊断的依据。

随着免疫学技术的不断发展,抗原抗体检测灵敏度不断提高,使得乙肝病毒低水平的检测成为了可能,对于临床诊断和流行病学具有重要意义[1]。

ELISA方法具有灵敏度高、特异性强、重复性好和定性测定的优点,可以在酶免疫分析仪进行批量检测。

目前临床上多倾向于做定量分析，若想得到准确的检验结果，必须要经过实验室的验证，本实验对上海酶联生物生产的HBsAg的ELISA法定量分析试剂盒进行准确度，精密度和检测限等方法学验证，现将实验结果报告如下：

1.材料与方法

1.1试剂盒

乙肝表面抗原ELISA法定量分析试剂盒，上海酶联生物出品。

1.2仪器

酶标仪：

ELx800光吸收酶标仪；洗板机：

DNX-9620A电脑洗板机；超纯水系统：

MilliporeElix；电热恒温培养箱（DNP-9052）上海精宏实验设备有限公司；振荡器（苏州管械，KJ-201A）；移液器；Tip头；EP管。

1.3方法

1.3.1．溶液配置

磷酸缓冲液的配备:

称取8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可。

在15lbf/in2（1034×105Pa）

标准品的配备：

原始标准品浓度为8ng/ml。

取6支2mlEP管，分别标记为A1-A6。

50ul/well,共1孔需50ul，每孔配置60ul留作备用，稀释方案详见表一。

编号

终浓度

（ng/ml）

预加磷酸缓冲液

标记

取（ul）

剩余（ul）

A1

8

0

标准品

120

60

A2

4

60

A1

60

60

A3

2

60

A2

60

60

A4

1

60

A3

60

60

A5

0.5

60

A4

60

60

A6

0.25

60

A5

60

60

表一标准品的稀释方案

质控品的配置：

50ul/well,共5复孔需250ul，配置300ul留作备用，取3支2mlEP管，分别标记为C1，C2，C3，质控品稀释方案见表二。

编号

终浓度

（ng/ml）

预加磷酸缓冲液

标记

取（ul）

剩余（ul）

C1

6

150

标准品

450

300

C2

3

300

C1

300

300

C3

1.5

300

C2

300

300

表二质控品的稀释方案

1.3.2．铺板方案

取出试剂盒中已包被酶标板，取出板条，在相应孔中依次加入系列标准品、质控品及空白对照，每孔50ul。

空白对照加入磷酸缓冲液缓冲液。

铺板方案见表三。

序号

标准品

质控1

质控2

质控3

空白组

1

A1

C1

C2

C3

磷酸缓冲液

2

A2

C1

C2

C3

磷酸缓冲液

3

A3

C1

C2

C3

磷酸缓冲液

4

A4

C1

C2

C3

磷酸缓冲液

5

A5

C1

C2

C3

磷酸缓冲液

6

A6

表三铺板方案

1.3.3．加样步骤

加入酶标抗体，50ul/well，震荡。

37℃电热恒温培养箱温育60min，取出后洗板4次，加入A、B液,50ul/well，37℃电热恒温培养箱温育15min。

加入终止液，50ul/well。

酶标板放入酶标仪，盖上盖子，在电脑上打开MicroplateManager5.2软件，选择450nm波长（参照波长630nm），设置layout和报告模式，测定各孔吸收值。

2.结果

2.1标准曲线与线性范围

序号

1

2

3

4

5

6

HBsAg（ng/ml）

8

4

2

1

0.5

0.25

吸光度值

1.67

0.99

0.63

0.40

0.31

0.26

表四标准品理论浓度对应的实测OD值

以标准品实际浓度为横坐标，所测吸光度值值为纵坐标作图，绘制标准曲线观察线性关系，结果显示R2=0.998，显示具有良好的相关性。

表五标准曲线

2.2准确度（回收率）的验证

质控品理论稀释浓度对应实测浓度值见表六。

HBsAg（ng/ml）

1

2

3

4

5

6

6.51

4.94

5.67

6.08

6.12

3

3.57

3.07

3.29

3.08

2.95

1.5

1.27

1.36

1.54

1.21

1.59

表六实测浓度值

质控品做了3个浓度梯度，每个浓度做了5个复孔，见表七。

HBsAg

（ng/ml）

测定值（ng/ml）

回收率（%）

平均回收率

RR（%）

3个浓度的平均回收率

6

6.51

108.5

97.72

99.03%

4.94

82.3

5.67

94.5

6.08

101.3

6.12

102.0

3

3.57

119.0

106.40

3.07

102.3

3.29

109.7

3.08

102.7

2.95

98.3

1.5

1.27

84.7

92.96

1.36

90.7

1.54

102.7

1.21

80.7

1.59

106.0

表七回收率

结果显示HBsAg6ng/m的平均回收率为97.72%，3ng/ml的平均回收率为106.40%和1.5ng/ml的平均回收率为92.96%，满足限度要求在85%-115%的范围内，3个浓度梯度的平均回收率为99.03%，显示准确性好。

2.3精密度的验证

2.3.1板內精密度的验证

HBsAg

（ng/ml）

1

2

3

4

5

RSD（%）

6

6.51

4.94

5.67

6.08

6.12

5.86±0.60

10.24

3

3.57

3.07

3.29

3.08

2.95

3.19±0.24

7.52

1.5

1.27

1.36

1.54

1.21

1.59

1.39±0.17

12.23

表八板內精密度测定值

表八中RSD（%）这一参数表示相对标准偏差，也就是变异系数CV值，HBsAg6ng/ml的5个复孔的变异系数CV值为10.24%，1.5ng/ml的5个复孔的变异系数CV值为12.23%，显示孔间差异较大，精密度不高，但是符合ng/ml级RSD水平的一般应<15%的要求，其中有一孔浓度为4.94和1.21，与其它孔比较差异较大，可能是由于操作不当引起。

而3ng/ml的变异系数CV为7.52%，符合显示孔间重复性好，符合ng/ml级RSD水平的一般应<15%的要求，精密度高。

2.3.2板间精密度的验证

从同一实验室中获取2组同样的数据，做板间精密度验证。

HBsAg

（ng/ml）

8

4

2

1

0.5

0.25

第二组OD值

1.98

1.42

0.86

0.58

0.40

0.31

第三组OD值

1.31

0.77

0.36

0.17

0.09

0.03

表九实测OD值

以标准品实际浓度为横坐标，所测吸光度值值为纵坐标作图，绘制标准曲线观察线性关系。

表十标准曲线

以上标准曲线结果显示第二组数据的R2=0.967，第三组数据R2=0.991。

第三组有一些数据偏差较大，但考虑到随机抽样和人为操作的偏差在内，还是可以应用到统计分析中。

下面对3组数据做板间分析。

HBsAg

（ng/ml

1

2

3

4

5

RSD（%）

6

6.23

4.55

5.73

6.08

6.39

6.04±0.55

9.10

6.10

5.78

6.08

6.64

6.84

5.99

5.39

6.34

6.49

5.96

3

3.36

3.28

3.55

3.28

3.47

3.06±0.37

12.06

3.36

2.93

3.53

3.07

2.99

2.59

2.71

2.81

2.49

2.52

1.5

1.24

1.27

1.17

1.16

1.19

1.34±0.23

16.78

1.46

1.50

1.73

1.71

1.76

1.19

1.24

1.25

1.21

1.11

表十一板间精密度测定值

从表十一中3组的数据比较可以知道，HBsAg6ng/ml的5个复孔的变异系数CV值为9.10%，3ng/ml的5个复孔的变异系数CV值为12.06%，但是也符合ng/ml级RSD水平的一般应<15%的要求，表示精密度高。

而HBsAg1.5ng/ml的5个复孔的变异系数CV值为16.78%，不符合ng/ml级RSD水平的一般应<15%的要求，显示低密度的孔间精密度不高，重复性差，故以下对HBsAg理论浓度为1.5ng/ml的三组数据做以下分析。

HBsAg

（ng/ml）

测定值（ng/ml）

回收率（%）

平均回收率RR（%）

SD%

CV%

第一组数据1.5ng/ml

1.24

82.47

80.56

2.98

3.70

1.27

84.67

1.17

78.07

1.17

77.67

1.20

79.93

第二组数据1.5ng/ml

1.46

97.60

109.10

9.49

8.70

1.50

100.00

1.73

115.60

1.72

114.53

1.77

117.37

第三组数据1.5ng/ml

1.19

79.47

80.27

3.80

4.74

1.25

83.13

1.25

83.53

1.22

81.07

1.11

74.13

表十二平均回收率

从表十三中可知第一组数据和第三组数据准确性差，精密度高，而第二组数据准确性高，精密度相对第一组数据和第二组数据要好。

综上对于HBsAg理论浓度为1.5ng/ml的这一低浓度梯度的板内准确性和精密度相对于高浓度样品的线性要差一些。

2.4检测限（LOD）计算

LOD为取空白孔的OD值的均数加2倍标准差。

空白空的吸光度值分别为0.156 0.157 0.162 0.159 0.165，平均值为0.1598，LOD为0.167。

检测限（LOD）表示分析方法检测低浓度样品的能力，也称为方法的灵敏度，LOD通常为标准曲线上的最低浓度点，要求标准曲线上的最低浓度点应>LOD，此标准曲线上最低浓度点为0.25，大于LOD（0.167），故此标准曲线线性好。

3.讨论

3.1乙肝表面抗原定量分析的意义

乙肝表面抗原（HBsAg）是乙肝病毒的外壳蛋白，本身不具有传染性，但它的出现常伴随乙肝病毒的存在，所以它是已感染乙肝病毒的标志。

它可存在于患者的血液、唾液、乳汁、汗液、泪水、鼻咽分泌物、精液及阴道分泌物中。

在感染乙肝病毒后2～6个月，当丙氨酸氨基转移酶升高前2～8周时，可在血清中测到阳性结果。

急性乙肝患者大部分可在病程早期转阴，慢性乙肝患者该指标可持续阳性。

乙肝两对半定性检测对乙肝疾病的筛检试验、诊断、状态监测、临床效果观察起到了一定作用。

但随着临床医学的发展,乙肝两对半定性检测已经远远不能满足临床及患者的要求,特别是在疗效观察和乙肝疫苗的抗体产生上具有明显的短缺。

随着检验医学的发展,乙肝两对半定量测量变得可行,大大弥补了乙肝两对半定性检测的不足。

乙肝两对半检测和HBVDNA荧光测定相互补充综合评价患者病情与药物疗效，为低含量的慢性乙肝、病毒携带者提供了正确判断病情的依据【2】。

这在目前的临床治疗中应用十分广泛。

3.2常用定量分析方法

此次实验只是对一种试剂盒的可用性进行方法学验证,而目前常用的定量方法已有很多，如酶联免疫吸附试验方法（ELISA法）和化学发光微粒子免疫分析法（CMIA法）TRFIA法对受检标本进行乙肝表面抗原（HBsAg）的检测是近十年发展起来的一种微量分析方法。

全自动酶免分析仪目前也广泛应有，自动化、标准化的操作手段使实验达到了全过程控制和全过程标准化分析，大大提高了实验的精密度【3】，使检测结果更趋稳定，从而保证了实验结果的可靠性。

3.3方法概述

酶联免疫吸附实验（ELISA）即将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行的技术。

该技术可用于检测大分子抗原和特异性抗体等，具有快速、灵敏、简便、载体易于标准化等优点。

目前普遍使用的HBsAg试剂尽管在制备时采用了高亲和力的单克隆抗体，并且使包被抗体、酶.标抗体的结合位点尽可能的远。

以避免竞争抑制，最大程度地解决钩状效应（HOOK）的问题【4】。

本次实验是对实验室的一种试剂盒，即上海酶联生物有限公司生产的HBsAg的酶联免疫吸附实验（ELISA）定量分析试剂盒进行的方法学验证，以判断该试剂盒是否能用于临床样本分析。

试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验往预先包被HBsAg捕获抗体的包被微孔中，测定时，将待测样品（含待测抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按一定程序与结合在固相载体上的抗原或抗体反应形成抗原抗体复合物;反应终止时，固相载体上酶标抗原或抗体被结合量（免疫复合物）与待测标本中待检抗体或抗原的量呈一定比例;经洗涤去除反应液中其他物质，加入底物进行显色，颜色的深浅和样品中得HBsaAg呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度OD值，从而计算样品浓度。

应用试剂盒HBsAg标准品从浓度为8，4，2，1,0.5，0.25ng/ml6个浓度梯度做标准曲线，以6，3，1.5ng/ml3个浓度梯度5复孔做质控，进行准确度，精密度和检测限等方法学验证。

选择最低浓度为0.25ng/ml的原因是:

因为绝大多数患者外周血中可出现HBsAg，含量在5ng/ml～600ug/ml之间，高者可达2000ug／ml以上【5】，满足了现阶段文献报道的最低浓度值。

3.4方法学验证内容

方法学验证一般包括标准曲线，准确度，精密度和检测限。

标准曲线指样品所测定的浓度值与吸光度的关系，以样品浓度为X轴，以吸光度为Y轴，绘制回归曲线，用回归方程及R值来评件曲线的可信度，该实验所用了6个浓度点建立标准曲线。

方法准确度指待测浓度与真实浓度的符合程度，一般用相对回收率表示，要求在85%—115%的范围内。

精密度则表示分析方法的可重复性，是对同一样品每次测定结果的一致性，用标准偏差和相对标准偏差表示，可做板内和板间的验证，对于ug/ml级水平的相对标准偏差一般应<10%,ng/ml级水平的相对标准偏差一般应<15%。

检测限则表示分析低浓度样品的能力，又称灵敏度，通常为取空白孔的OD值的均数加2倍标准差。

4结果分析及应用评价

第一组数据标准曲线R2=0.9979，显示具有良好的相关性，HBsAg浓度为6ng/ml和3ng/ml的回收率分别为为97.72%和106.40%，符合限度要求在85%—115%的范围内。

但是HBsAg浓度为1.5ng/ml的回收率为92.96%，显示此试剂盒对于低浓度样品的检测准确度不太好。

在精密度方面，HBsAg6ng/ml和1.5ng/ml的5个复孔的变异系数CV值为10.24%和12.23%，显示孔间差异较大，精密度不高，但是也符合ng/ml级RSD水平的一般应<15%的要求，其中有一孔浓度为4.55和1.21，与其它孔比较差异较大，可能是由于操作不当引起。

而3ng/ml的变异系数CV为7.52%，符合显示孔间重复性还好，符合ng/ml级RSD水平的一般应<15%的要求，故可以认为此试剂盒批内精密度尚可。

在做3组数据的板间精密度分析时，发现6，3，1.51.5ng/ml变异系数CV分别为9.10%，12.06%，16.78%，呈递增趋势，前两个浓度满足对ng/ml级RSD水平的一般应<15%的要求。

1.5ng/ml的CV值为16.78%，不满足ng/ml级RSD水平的一般应<15%的要求，显示低密度的孔间重复性差，精密度不高。

综上分析，该试剂盒对于高浓度生物样品的检测具有良好的准确性和精密度，而对于低浓度样品的检测在准确性和精密度方面都低于高浓度样品，且与实际值有一定差值，因此不适合低浓度样品的检测。

而目前绝大多数乙肝感染者外周血HBsAg浓度都很低，因此该试剂盒不能全面检测出此类人群，故该试剂盒不能用于临床标本的定量检测。

参考文献

【1】魏来，陶其敏．努力规范肝脏疾病的免疫学诊断．中华检验杂志，2003，26：

69—71

【2】刘晓梅，张世兰．HBsAg阴性结果的慢性乙型肝炎患者病毒血症水平与临床的关系[J】．临床检验杂志，2004，22（5）：

381-382．

【3】WeberB,DenglerT,BergerA.EvaluationoftwonewautomatedassaysforhepatitisBvirussurfaceHBsAgdetectionIMMUIITEHBsAg_