诱变物质的微核检测技术.doc

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山东大学实验报告

姓名系年级学号日期

科目遗传学实验题目诱变物质的微核检测技术同组者

诱变物质的微核检测技术

摘要：

微核是间期细胞的细胞质中一个或多个圆形或杏仁状结构。

核仁的折光率及细胞化学反应性质和主核一样，也具有合成DNA的能力。

微核（micronucleus），与染色体损伤有关，是染色体或染色单体的无着丝点断片或纺锤丝受损而丢失的整个染色体，在细胞分裂后期遗留在细胞质中，末期之后，单独形成一个或几个规则的次核，包含在子细胞的胞质中，比主核小，故称微核。

微核是染色体畸变的另一种表现方式。

本次试验意在了解微核检测的方法和意义，通过检测评价环境中常见物质的诱变情况。

影响微核产生的因素：

遗传毒物①断裂剂——可诱发染色体断裂。

②非整倍剂——可使染色体和纺锤体联结发生障碍或纺锤体功能受损。

引起染色体断裂的因素分为物理因素和化学因素。

本次实验所用的诱变剂为叠氮化钠NaN3，不同浓度NaN3处理对大蒜生长的影响随NaN3浓度增加，微核发生率增加。

微核发生率同作用因子的剂量呈正相关。

可用简单的微核技术来反应诱变物质对生物的遗传危害。

引言

19世纪末，Howell与Jolly分别在猫和大鼠外周血中发现一种小体，命名为Howell-Jolly小体，并且发现这种小体也存在于恶性贫血患者外周血中。

这一小体便是今日被称之为微核的小体。

 1959年，Evans等将蚕豆根端细胞暴露在电离辐射下，观察到辐射诱导微核形成效应，并据此间接推断微核来源于辐射诱导的染色体异常。

1970，年Boiler和Sehmid以中国金黄地鼠为材料，观察了抗肿瘤药三亚胺给予后，骨髓与外周血细胞学的变化，并且提出用本来无核的外周血嗜多染红细胞中的微核发生率来作为微核试验的基本指标，并正式命名为微核实验。

 70年代初，Matter和Schmid首先用啮齿类动物骨髓细胞微核率来测定疑似有诱变活力的化合物，建立了微核测定法。

 此后至70年代中期，Sehmid以及Heddle研究小组的工作，全面奠定了微核实验的理论及应用基础。

 近年来，由于大量新的化合物的合成，原子能的应用，各种各样工业废物的排出，日常生活中人类接触到的有潜在遗传毒性的物质越来越多，微核实验的重要性也就随之突显出来。

微核实验技术简单易行且灵敏，目前国内外不少部门已把微核测试用于辐射损伤、辐射防护、化学诱变剂、新药试验、食品添加剂的安全评价，以及染色体遗传疾病和癌症前期诊断等各个方面。

【实验材料】

1.试剂：

水，叠氮化钠溶液（阳性对照），阿莫西林胶囊（实验组），三聚氰胺（实验组），卡诺固定液，70%乙醇（自己配制），95%乙醇，1mol/LHCl，改良苯酚品红染液。

2.器具：

培养皿，1.5mLEppendorf管，量筒，微量移液器，枪尖，一次性PE手套，解剖刀片，解剖针，载玻片，盖玻片，吸水纸，显微镜。

3.材料：

大蒜。

【实验步骤】

1.培养

将大蒜分别置于水、不同浓度梯度的NaN3溶液、和实验组溶液中，24℃浸泡培养48h。

阴性对照

阳性对照

实验组

实验组

水

40mmol/LNaN3溶液

0.0005g/mL阿莫西林

0.0005g/mL三聚氰胺

20mmol/LNaN3溶液

0.00025g/mL阿莫西林

0.00005g/mL三聚氰胺

10mmol/LNaN3溶液

0.000125g/mL阿莫西林

0.000005g/mL三聚氰胺

恢复培养：

48h后，倒掉培养液，自来水冲洗三次，用自来水培养24h。

固定：

选择根长整齐一致，不定根长约0.5-1cm左右的大蒜，切取根尖，卡诺固定液固定24h，用95%乙醇冲洗根尖，70%乙醇中4℃下保存。

2.解离

用1mol/LHCl处理根尖10min，水洗3次。

3.染色

切取近根尖分生区的伸长区组织，用改良苯酚品红染液染色10min。

4.压片

将片子放在实验台上，盖上干净的盖玻片，并覆一层滤纸，用解剖针的背面轻轻敲片。

5.镜检

先用低倍镜找到细胞，再转用高倍镜进行观察。

【实验结果】

注：

微核的识别标准：

①凡主核大小的三分之一以下的小核；

②小核着色不论深浅；

③小核形态可以是圆形，椭圆形，不规则形；

④小核可以与主核分离，与主核有丝或蒂相连，与主核相依，但各自轮廓清楚的都可作为微核计入，但须注意不要将染色中心（Chromocenter）当作微核计入。

1.阴性对照——水

大蒜根部伸长区细胞装片（用自来水培养48h）（10×40）

结果分析：

从图中可以看出，用自来水培养的大蒜的根尖细胞中无微核。

2.阳性对照——叠氮化钠NaN3

微核

大蒜根部伸长区细胞装片（用40mmol/LNaN3溶液培养48h）（10×40）

微核

大蒜根部伸长区细胞装片（用20mmol/LNaN3溶液培养48h）（10×40）

微核

大蒜根部伸长区细胞装片（用10mmol/LNaN3溶液培养48h）（10×40）

结果分析：

从以上三个实验结果图中可以看出，用不同浓度的叠氮化钠NaN3溶液培养大蒜，都有一定比例的大蒜根部伸长区细胞的细胞中出现微核，并且叠氮化钠NaN3溶液的浓度越高，出现微核的比例越大。

3.实验组——三聚氰胺

结果图中共有57个细胞，其中6个细胞的形态出现明显变化，认为其为微核，所占比例为105.26‰，说明三聚氰胺确实对大蒜根部伸长区细胞造成了影响。

大蒜根部伸长区细胞装片（用0.0005g/mL三聚氰胺溶液培养48h）（10×40）

结果图中共有49个细胞，其中5个细胞的形态出现了明显的变化，所占比例为102.04‰。

大蒜根部伸长区细胞装片（用0.00005g/mL三聚氰胺溶液培养48h）（10×40）

结果图中共有70个细胞，其中6个细胞的形态出现了明显的变化，所占比例为85.71‰。

大蒜根部伸长区细胞装片（用0.000005g/mL三聚氰胺溶液培养48h）（10×40）

结果分析：

可以看出，用不同浓度的三聚氰胺溶液培养大蒜，都有一定比例的大蒜根部伸长区细胞的形态出现明显变化，判断其为微核，说明三聚氰胺的却对细胞造成了影响，并且三聚氰胺溶液的浓度越高，出现不正常细胞的比例越大。

4.实验组——阿莫西林胶囊

结果图中共有80个细胞，其中2个细胞的形态出现明显变化，认为其为微核，所占比例为25‰，说明阿莫西林确实对大蒜根部伸长区细胞造成了影响。

大蒜根部伸长区细胞装片（用0.0005g/mL阿莫西林胶囊溶液培养48h）（10×40）

结果图中共有73个细胞，其中3个细胞的形态出现了明显的变化，所占比例为41.10‰。

大蒜根部伸长区细胞装片（用0.00025g/mL阿莫西林胶囊溶液培养48h）（10×40）

结果图中共有87个细胞，其中5个细胞的形态出现了明显的变化，所占比例为57.47‰。

大蒜根部伸长区细胞装片（用0.000125g/mL阿莫西林胶囊溶液培养48h）（10×40）

结果分析：

可以看出，用不同浓度的用阿莫西林胶囊配制的溶液培养大蒜，都有一定比例的大蒜根部伸长区细胞的形态出现明显变化，判断其为微核，说明阿莫西林的却对细胞造成了影响，并且阿莫西林溶液的浓度越高，出现不正常细胞的比例越大。

说明：

①在实验结果中，对样品组每个浓度的样品都计算了微核千分率。

但实际上，因为所统计的细胞的数量太少，这个数值是不准确的。

②用不同浓度的三聚氰胺处理大蒜根尖，都使细胞核出现了异常（产生微核），可得出结论：

三聚氰胺会对细胞造成损害。

这让我们回忆起奶粉的案件，希望以后不要再出现类似的事件。

③用不同浓度的阿莫西林胶囊处理大蒜根尖，也使细胞核出现了异常，可得到结论：

阿莫西林会对细胞造成伤害。

这一结论可能会使人们不再敢服用阿莫西林，其实在实验中用的溶液已经接近了阿莫西林的饱和浓度。

其实，药品在投入市场之前，会经过多到程序的检测，在正常服用剂量内是不会对身体造成伤害的。

7

【注意事项】

1.提前安排好实验时间，按时处理实验材料；

2.实验中会接触到有毒试剂叠氮化钠NaN3，操作时要佩戴手套，并且不要污染未被污染的实验仪器；

3.由于样品数较多，各个步骤都要做好标记，避免混淆。

参考文献

[1]杨大翔.遗传学实验（第二版）.科学出版社.2010.9