二代测序流程.docx

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Illumina测序的化学原理

目前我们接触到的很多生物信息学的技术，都是基于NGS技术的，比如RNA-Seq，ChIP-Seq，FAIRE-Seq，ChIA-PET，Hi-C等等。

所谓的NGS就是NextGenerationSequencing，翻译为“下一代测序技术”，或者是“第二代测序技术”。

之所以这么叫，是因为相比较于第一代测序技术其测序通量有了很大的提升

一些常用的基本概念介绍：

flowcell：

是指Illumina测序时，测序反应发生的位置，1个flowcell含有8条lane

lane：

每一个flowcell上都有8条泳道，用于测序反应，可以添加试剂，洗脱等等 tail：

每一次测序荧光扫描的最小单位

reads：

指测序的结果，1条序列一般称为1条reads

bp：

basepair碱基对，用于衡量序列长度

双端测序：

是指一条序列可能比较长，如500bp，我们可以两端各测150bp

junction：

在进行双端测序时，中间会留有200bp测不到的东西，我们称其为junction

adapter：

就是在测序时需要的一段特定的序列，有类似于引物的功能

primer：

PCR中的引物

测序反应基本流程介绍：

1、建库

A、将基因组DNA用超声波打断（由于Illumina测序策略本身的问题，导致其测序长度不可能太长，目前最好的XTen测序仪也就只能双端各测150bp，所以不可能直接拿整个基因组去测序，因此在测序的时候就需要先将其打断成一定长度的片段，这个根据需要使用不同的策略，一般测人的基因组，我们是先将其打断成300-500bp长度的片段，这个是根据跑胶控制的）

B、打断以后会出现末端不平整的情况，用酶补平，所以现在的序列是平末端

C、完成补平以后，在3'端使用酶加上一个特异的碱基A

D、加上A之后就可以利用互补配对的原则，添加adapter，这个adpater可以分成两个部分，一部分是测序的时候需要使用的引物序列，另一部分是建库扩增时候需要用到的引物序列

E、进行PCR扩增，使得DNA样品浓度能够满足上机要求

建库示意图如下：

2、桥式PCR

A、将上述的DNA样品调整到合适的浓度后加入到flowcell中，从而序列的一端与flowcell上面已经存在的短序列通过互补配对结合，如下图：

图中不同的颜色表示的是两种不同的adpater，分别对应序列之前加入的两种adpater

B、连接以后就可以正式开始桥式PCR了。

首先进行第一轮扩增，将序列补成双链。

加入NaOH强碱性溶液破坏DNA的双链，并洗脱

C、加入缓冲液，使其反应环境变成中性，这时序列自由端的部分就会和旁边的adpater进行匹配

D、进行下一轮PCR，在PCR的过程中，序列弯成桥状，所以叫桥式PCR，一轮桥式PCR可以使得序列扩增1倍

E、如此循环下去，就会得到一个具有完全相同序列的簇，一般叫做cluster

3、测序

测序的过程反而简单了不少。

就是来一个primer，然后加入特殊处理过的A，T，C，G四种碱基。

特殊的地方有两点，一个是脱氧核糖3号位加入了叠氮基团而不是常规的羟基，保证每次只能够在序列上添加1个碱基；另一方面是，碱基部分加入了荧光基团，可以激发出不同的颜色

在测序过程中，每1轮测序，保证只有1个碱基加入的当前测序链。

这时候测序仪会发出激发光，并扫描荧光。

因为一个cluster中所有的序列是一样的，所以理论上，这时候cluster中发出的荧光应该颜色一致

随后加入试剂，将脱氧核糖3号位的—N2改变成—OH，然后切掉部分荧光基团，使其在下一轮反应中，不再发出荧光。

如此往复，就可以测出序列的内容

Illumina测序会有长度限制的原因：

1、测序时，经过长时间的PCR，会有不同步的情况。

通俗一点讲就是，比如一开始1个cluster中是100个完全一样的DNA链，但是经过1轮增加碱基，其中99个都加入了1个碱基，显示了红色，另外1个没有加入碱基，不显示颜色。

这时候整体为红色，我们可以顺利得到结果。

随后，在第2轮再加入碱基进行合成的时候，就变成了，之前没有加入的加入了1个碱基显示红色，剩下的99个显示绿色，这个时候就会出现杂信号。

当测序长度不断延长，这个杂信号会越来越多，最后很有可能出现，50个红，50个绿色，这时候我们判断不出来到底是什么碱基被合成

2、测序过程中，使用的碱基是特殊处理的，有一个非常大的荧光基团修饰。

在使用DNA聚合酶的时候，酶的状态也会受到底物的影响，越来越差