从土壤中分离芽孢杆菌的设计实验报告.doc

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从土壤中分离芽孢杆菌

一、实验目的

1、了解生物分离提纯的原理和方法技术

2、掌握从土壤样品中分离和筛选微生物菌种的技术和实验设计思路。

3、掌握平板稀释涂布法、划线接种法、分离筛选菌株的基本原理。

4、初步掌握从土壤样品中筛选芽孢杆菌的基本技术。

5、掌握革兰氏染色和芽孢染色。

二、实验原理

自然界中，土壤是微生物生活最适宜的环境。

土壤具有微生物进行生长繁殖和生命活动中所需的各种条件。

土壤中微生物的数量因土壤类型、季节、土层深度与层次等不同而异。

一般地说，在土壤表面，由于日光照射及干燥等因素的影响，微生物不易生存，离地表10cm～30cm的土层中菌数最多，随土层加深，菌的数量减少。

值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养。

因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。

芽孢是菌体生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。

它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。

细菌富集一段时间后，生长环境不利，会产生芽孢，再在80-90温度下杀死菌体，可使芽孢得到富集。

芽孢杆菌属的共同特征是：

革兰氏阳性；接触酶阳性；水解淀粉；VP试验阳性；不产生吲哚；苯甲氨酸不脱氨；分解酪素；不分解酪氨酸；不产生二羟丙酮；营养体的最高生长温度大约从25℃到75℃以上；最低生长温度大约5℃到45℃；生长最低pH值，从7.5—8到2左右；耐盐范围从低于2%的NaCl到25%NaCl；营养明胶（22℃）7天内液化1厘米或1厘米以上。

枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌在糖发酵试验用阿拉伯糖，木糖和甘露糖代替葡萄糖可产酸；作为营养生长的最低限培养基是无维生素的，但含有葡萄糖、柠檬酸盐和一个氨态盐作为唯一的碳源和氮源。

三、实验材料

1、土壤样品采集周围有花草的成颗粒状的离地表10cm左右的土壤

2、培养基牛肉膏蛋白胨培养基

3、试剂草酸铵结晶紫染液，95%乙醇，番红水溶液、碘液、孔雀绿水溶液

4、玻璃器皿

烧杯（500ml）·········1

锥形瓶（250ml）·······2

培养皿···············15

涂布棒···············1

移液管（1ml）·········5

试管·················5

盖玻片，载玻片·······若干

5、其他设备及仪器

pH试纸，棉花，牛皮纸，玻璃珠，超净工作台、生化培养箱、电热干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、显微镜、接种环等

四、实验步骤

1、初筛选

1.1样本采集

采集土壤，放到塑料袋中。

1.2芽孢富集

•取10g土壤加入250ml烧杯中，再加入90ml无菌水振荡10min制成土壤混悬液。

•在80℃水浴锅中加热10分钟，杀灭菌体，使芽孢得到富集。

1.3梯度稀释菌悬液

分别另取装有9mL无菌水试管5支，用记号笔编上用记号笔编上10-2、10-3、10-4。

取已稀释成10-1土壤液，振荡后静止0.5min，用无菌的移液器吸取1mL土壤悬液加入10-2的无菌水的试管中，并在试管内轻轻反复吹吸数次，使之充分混匀，即成10-2土壤稀释液。

同法从10-2的试管中吸取1mL稀释液加入编号为10-3的无菌水试管中，混匀后即为10-3土壤稀释液，同法得到10-4土壤稀释液。

1.4涂布平板

用一支新的无菌枪头，由低浓度开始，从各浓度土壤稀释液中各吸取100ul，对号较均匀地放入已写好稀释度的牛肉膏蛋白胨培养基平板上，用灼烧冷却后的无菌玻璃涂棒涂匀。

每个浓度做2个平板（重复）。

37℃下恒温培养24h。

2、复筛选

2.1划线接种

在上述不同稀释度培养基中挑取不同形态的单菌落进行分区划线，先在平板培养基的一边作第1次平行划线3~4条，再转动培养皿约60°角，并将接种环上剩余物烧掉，待冷却后通过第1次划线部分作第2次平行划线，再用同法通过第2次平行划线部分作第3次平行划线和通过第3次平行划线部分作第4次平行划线（如右图）。

划线完毕，盖上皿盖，倒置于28~29°C温室中培养。

2.2制片检测

2.2.1革兰氏染色镜检

涂片、干燥及固定

•初染：

在做好的涂面上滴加草酸铵结晶紫染液，染1分钟，倾去染液，流水冲洗至无紫色。

•媒染：

先用新配的碘液冲去残水，而后用其覆盖涂面1分钟，后水洗。

•脱色：

除去残水后，滴加95%酒精进行脱色约15－20秒，后立即用流水冲洗。

•复染：

滴加番红染色液，染3－5分钟，水洗后用吸水纸吸干。

•镜检：

油镜观察染色结果。

2.2.2芽孢染色镜检

•取37℃培养18～24h的芽孢杆菌涂片，干燥，固定。

•于涂片上滴人3～5滴5%孔雀绿水溶液。

•用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时，开始计算时间约4～5min。

加热过程中切勿使染料蒸干，必要时可添加少许染料。

•倾去染液，待玻片冷却后，水冲洗至孔雀绿不再褪色为止。

•用番红复染lmin，水洗。

•制片干燥后用油镜观察。

芽孢呈绿色，菌体红色。

五、注意事项

1、要严格按照培养基配方配制培养基，防止杂菌污染。

2、观察结果时要注意滴加药量及反应时间。

3、严格无菌操作，防止污染情况的发生。

4、称药品用的药匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。

调pH时要小心操作，避免回调。

不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。

5、革兰氏染色时注意脱色的时间的控制，过长或过短都会影响实验结果。

6、进行染色鉴定时，都应有已知的对照菌种在同等条件下染色，然后进行对比记录结果。

7、在芽孢染色中，应注意温度的控制，避免染料在玻片上蒸腾，否则影响实验结果。

六、时间安排

5月20号配制培养基并灭菌（另包括培养皿，移液管，试管等）

5月21号取土壤杀死菌体，稀释菌液，接种芽孢，培养

5月22号观察，平板划线，培养

5月23号观察

5月26号镜检

七、实验结果

八、实验分析

为了得到纯种，先用梯度稀释菌悬液，用涂布平板法，经培养后，可以在平板培养基表面形成多个独立分布的单菌落，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定保证是纯培养，所以我们进行复筛选，再用平板划线法分离菌种，观察菌落特征，菌落特征为扁平、边缘不整齐，白色表面粗糙有褶皱。

然后进行革兰氏染色和芽孢染色，革兰氏染色镜检结果：

呈紫色表明该细菌为革兰氏阳性。

芽孢染色镜检结果：

芽孢呈绿色，菌体红色。

镜检观察结果不明显，所以我们在革兰氏染色时注意脱色的时间的控制，过长或过短都会影响实验结果。

革兰氏染色时注意脱色的时间的控制，过长或过短都会影响实验结果。

为了我们提高实验结果的准确性，配制培养基时，要严格按照培养基配方配制培养基，防止杂菌污染。

在实验过程中，严格无菌操作，防止污染情况的发生。

通过这个实验我们感受良多：

其一，实验前小组成员的分工与准备工作安排的不充分造成实验前期比较被动，虽耗费了不少时间，但经过调整实验有条不紊的进行，让我们认识到合作的重要性，在团队合作中，我们要有团队精神，分工明确，提高效率。

其二，在分区划线这部分，我们组犯了一定的错误，导致大部分的菌种被污染，整个平板长满了菌，起初我们猜测问题可能出在倒平板培养基时没冷却就倒入平板中造成平板盖上残留大量的水珠，以致造成菌种的大面积的扩散。

事后请教其他同学才发觉是我们分区划线时可能是没有做到严格的无菌操作，导致菌种被污染。

通过这次的教训让我更意识到无菌操作的重要性。

其三，综合实验的方案设计和实验操作让我们体验到了耐心、恒心、细心的重要，让我们充分认识到做实验时要一丝不苟。

如果因为一时的粗心而导致一些细小的错误，就会带来不必要的麻烦，甚至会导致试验的失败，所以我们一定要严格按照试验要求操作。

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