谷胱甘肽的简便测定法.doc
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谷胱甘肽的简便测定法
药物分析杂志2000年第1期第20卷研究简报
作者：
赵旭东 魏东芝 万群 俞俊棠
单位：
赵旭东 魏东芝 万群 俞俊棠（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室 上海 200237）
关键词：
谷胱甘肽、甲醛、半胱氨酸、DTNB
摘 要：
目的：
建立一种快速简便测定谷胱甘肽的新方法。
方法：
样品1式2份，pH8.0条件下分别和甲醛反应2min和60min，各取1mL加入5mLDTNB溶液，25℃反应5min后分别测定在波长412nm的吸光度，算出2者的差值ΔA，代入标准曲线计算得出谷胱甘肽含量。
结果：
谷胱甘肽浓度在0.19～0.95g·L-1之间线性关系良好，回归方程为：
Y=0.7154X-0.0004，r=0.9999，最大误差不超过6%。
结论：
方法成本低廉，简单易行，特别适合于有干扰物质存在时还原型谷胱甘肽浓度的分析。
ASimpleMethodforRapidDeterminationofReducedGlutathione
ZhaoXudong WeiDongzhi WanQun YuJuntang
（StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineering,InstituteofBiochemistry,
EastChinaUniversityofScienceandTechnology,Shanghai 200237）
Abstract：
Objective：
Anewsimplemethodforrapiddeterminationofreducedglutathioneinthepresenceofotherthiolsisdevelopedbasedonthereactionsofformaldehydewithglutathioneandintereferingsubstances.Method:
Aftereachaliquotoftwosamesamplesreactswithformaldehydefor2and60minrespectively,1mLofeachsolutionisaddedto5mLDTNBandreactsfor5minat25℃.Theabsorbanceismeasuredimmediatelyatwavelength412nm.Thedifferencebetweentwoabsorbance（ΔA=A2min-A60min）iscalculated,concentrationofglutathionecanbeobtainedfromstandardcurve.Result:
Thereisagoodlinearitybetween0.19to0.95g·L-1glutathione.Regressionequation:
Y=0.7154X-0.0004，r=0.9999，maximumdeviationislessthan6%.Conclusion:
Themethodischeap,simple,practicableandisapplicabletoassayofreducedglutathioneinthepresenceofotherintereferingsubstances.
Keywords：
glutathione,formaldehyde,cysteine,DTNB▲
谷胱甘肽（GSH）是由谷氨酸、半胱氨酸（Cys）和甘氨酸组成的天然三肽，用途广泛。
利用基因工程微生物生物合成方法是生产谷胱甘肽的主要方式。
作为前体之一，半胱氨酸的浓度较高，对谷胱甘肽的测定有干扰。
已有几种方法用于半胱氨酸存在时谷胱甘肽的测定：
酶分析方法［1，2］可测高达1000倍半胱氨酸存在时谷胱甘肽的含量，结果较准确，但需价格昂贵的辅酶Ⅱ和谷胱甘肽还原酶，并且后者活力变化严重影响测量结果；色谱法［3，4］冗长费时；Jocelyn［5］采用将样品在硫酸中煮沸1h的方法，不太安全；Wronski［6，7］方法效果较好，但需用对羟基汞苯甲酸和萤光黄；荧光法［8］容易受干扰，误差较大；乙二醛酶法［9］需要复杂的技术和设备。
针对上述方法的不足，本文在研究甲醛同谷胱甘肽和常见含巯基物质反应特点的基础上结合巯基的测定方法［10，11］提出一种简单，快速的新方法，应用于生物合成反应溶液中谷胱甘肽含量的分析取得满意结果。
1 仪器和试剂
752紫外光栅分光光度计（上海第三分析仪器厂），恒温水浴槽（上海医疗器械五厂）。
GSH，Gys，为生化试剂；3%甲醛溶液由分析纯试剂加水配制，用NaOH调节pH为8.0；0.25mol·L-1pH8.0的Tris-HCl缓冲液由生化试剂配制；0.01mol·L-1DTNB［5，5’-二硫代双（2-硝基苯甲酸）］溶液由生化试剂加0.05mol·L-1pH7.0的磷酸缓冲液配制，存于棕色瓶中，放于低温暗处备用；DTNB分析溶液由1体积0.01mol·L-1DTNB溶液加100体积0.25mol·L-1pH8.0的Tris-HCl缓冲液配制而成，现用现配；其它试剂为分析纯；所用水为去离子水。
2 分析方法
待分析样品（Cys含量不大于20mmol·L-1，GSH浓度小于0.9g·L-1）1mL2份，每份加入0.25mol·L-1pH8.0的Tris-HCl缓冲液3mL，摇匀，再加入3%甲醛1mL，摇匀，室温下分别准确静置2min和60min后，立刻取1mL加入预先恒温于25℃水浴中的DTNB分析溶液5mL，摇匀，准确静置5min后，立刻在波长412nm处测定吸光度A，算出2者的A值之差ΔA，代入回归方程计算相应谷胱甘肽浓度，最大误差不超过6%。
3 结果
3.1 显色溶液的稳定性 准确称取GSH溶于pH6.5去离子水配成0.48g·L-1的标准溶液，取1mL按上述方法分析，已知室温为26℃，5mLDTNB溶液预先恒温于25℃水浴中，分别加入已与甲醛反应2min和60min的样品溶液1mL后迅速摇匀，以此刻作为反应开始，于不同时间测定吸光度，见表1。
可知反应开始1.5min到10min之间显色溶液保持稳定，考虑到因季节不同，与甲醛反应后的样品溶液温度变化，1mL该溶液加入5mL预先恒温于25℃水浴中的DTNB溶液后需1～3min才能恢复到25℃，选择5min为反应时间。
表1 显色溶液在不同反应时间的吸光度
反应时间/min
反应2min的样品
反应60min的样品
0.5
0.672
0.011
1.5
0.680
0.013
2.5
0.680
0.013
5.0
0.680
0.013
10
0.680
0.013
15
0.678
0.012
20
0.678
0.012
30
0.670
0.011
60
0.649
0.006
3.2 标准曲线的制作 谷胱甘肽含有疏基，按照疏基的测定方法［11，12］可求出GSH的含量。
准确称取GSH溶于pH6.5去离子水配成0.95g·L-1的标准溶液，分别取该溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mL，相应加入0.8，0.6，0.4，0.2，0mLpH6.5的去离子水，用水代替甲醛作为对照。
按分析方法与甲醛反应2min和60min后测定结果见表2。
以Y为纵坐标，表示GSH（g·L-1）浓度，以X为横坐标，表示ΔA，用最小二乘法计算得回归方程和相关系数为：
Y=0.7154X-0.0004 r=0.9999
说明线性关系良好。
表2 GSH浓度（g·L-1）与ΔA之间的关系
GSH加入量/
A2min
A60min
ΔA
g·L-1
A2min-A60min
0.00
0.000
0.000
0.000
0.19
0.272
0.013
0.259
0.38
0.553
0.017
0.536
0.57
0.830
0.027
0.803
0.76
1.101
0.030
1.071
0.95
1.352
0.034
1.318
3.3 甲醛同Cys和GSH的反应速度 配制浓度为0.95g·L-1的GSH标准溶液和2.6g·L-1的Cys标准溶液，按分析方法分别与甲醛反应不同时间后测量A值，用水代替甲醛作为对照。
结果表明（表3）：
室温下pH8.0时，和甲醛反应2min后，98.94%的Cys被掩蔽，而GSH只有3.08%；反应1h后，97.56%的GSH也被掩蔽，由此可知，甲醛同半胱氨酸的反应更快。
利用这种反应速度的差异，可以分别测定Cys和GSH的浓度；由此启发研究其他含疏基物质与甲醛的反应特性。
表3 甲醛同Cys和GSH的反应速度
与甲醛反应
时间/min
Gys
GSH
A
A
0
2.159（对照）
1.395（对照）
1
0.240
11.22
1.384
99.21
2
0.023
1.06
1.352
96.92
3
0.019
0.88
1.329
95.27
30
0.019
0.88
0.335
24.01
60
0.018
0.88
0.034
2.44
3.4 多种含疏基物质共存时GSH含量分析 生物合成GSH溶液中含有细胞泄漏物如辅酶A、蛋白质等含疏基物质，提取时还用到疏基乙醇和NaHSO3还原氧化型GSH这些物质干扰GSH的分析。
进一步研究甲醛同这些物质的反应性质如表4所示。
表4 各种含疏基物质同甲醛的反应性质及对GSH测定的影响
编号
样品
A2min
A60min
A2min-A60min
对GSH测定的影响
1
0.2mLGSH（0.95g·L-1）
0.272
0.013
0.259
2
0.2mLCys（2.6g·L-1）
0.005
0.002
0.003
小
3
0.2mL巯基乙醇（31.67%）
0.499
0.494
0.005
小
4
1mL二硫苏糖醇（0.21g·L-1）c
0.683
0.117
0.556
很大
5
1mLNaHSO3（1.08g·L-1）
0.119
0.121
-0.002
小
6
1mL木瓜蛋白酶（2.7g·L-1）a
0.072
0.071
0.001
小
7
1mLβ-半乳糖苷酶（3g·L-1）a
0.187
0.187
0.000
没有
8
0.8mL酵母细胞裂解液
0.170
0.115
0.055
大
（蛋白质浓度53mg·L-1）b
9
0.5mLE.coli细胞裂解液
0.045
0.032
0.013
大
（蛋白质浓度39mg·L-1）b
a.这2种酶含有巯基，用来说明甲醛同蛋白质巯基的反应性质
b.生物合成GSH的反应系统含有固定化酵母和E.coli细胞，溶液中有这2种细胞的泄漏物如蛋白质、辅酶等含巯基物质，分析这2个样品是为了检验这些含巯基物质对GSH测定的影响
c.二硫苏糖醇与巯基乙醇和NaHSO3不同，因为和甲醛反应使它的A值减小许多，给分析带来麻烦；还原反应溶液中的氧化型GSH时只采用巯基乙醇和NaHSO3 表4结果表明，除二硫苏糖醇外，与甲醛反应的常见含巯基物质基本上可分为4种，第1种和甲醛反应2min后，几乎完全被掩蔽，如半胱氨酸；第2种和甲醛反应的时间越长，被掩蔽的越多，以致最后被掩蔽，如谷胱甘肽、酵母和E.coli细胞裂解液中的未知成分；第3种与甲醛的反应在2min时就已完成，部分被掩蔽，2min和60min时的A值几乎一样，如NaHSO3和木瓜蛋白酶；第4种是基本上不与甲醛反应，如巯基乙醇和半乳糖苷酶。
通过求取和甲醛反应2min和60min时的A值之差，可将第1、第3、第4种物质的干扰消除；第2种含巯基物质共存时，可设立不含GSH的溶液作为对照来消除干扰，如在测量生物合成反应溶液中的GSH浓度时，以不加GSH前体的溶液作为对照。
总之，无论哪一种干扰物质和GSH共存，采用本文的分析方法都可以测定GSH含量。
各种样品按照分析方法测定的GSH含量如表5所示，每种样品测定之前用水补加至体积为1mL，表中数据为2次分析的平均值。
表5 各种样品的GSH含量分析结果
样品
GSH加入量/
g·L-1
A2min
A60min
A2min-A60min
测量值/
g·L-1
测量值与
加入量之比
/%
1 样品1+样品2
0.190
0.280±0.004
0.016±0.004
0.264
0.188
98.95
2 样品1+样品3+0.2mL样品5
0.190
0.795±0.012
0.533±0.017
0.262
0.187
98.42
3 样品1+0.2mL样品5+0.2mL样品6
0.190
0.308±0.008
0.056±0.014
0.252
0.180
94.74
4 样品1+样品8a
0.190
0.440±0.029
0.130±0.011
0.254a
0.181
95.26
5 样品2+0.3mL样品8+0.3mL样品9a
0.000
0.099±0.010
0.071±0.009
0.028
6 样品1+样品2+0.3mL样品8+0.3mL样品9
0.190
0.382±0.035
0.095±0.013
0.259a
0.185
97.37
注：
样品编号见表4
a.分析样品6必须设立对照，即样品5，原因见文中解释；计算样品6的GSH含量时，应采用样品6的ΔA与样品5的ΔA之差0.280。
分析样品4时以表4中样品8为对照 由表5可知，直接将样品的ΔΑ代入回归方程得到的测量结果误差最大不超过6%，一般小于5%，可以满足分析要求。
4 讨论
4.1 本文提出了一种成本小，简单、快速测定干扰物质共存时还原型GSH浓度的新方法，较适合于GSH含量介于0.19～0.95g·L-1的样品分析，这时相对误差较小，如生物合成反应溶液中的GSH浓度测量，一般情况下90min可以完成分析过程，得到实验结果，误差最大不超过6%，符合生物合成GSH时的分析要求。
采用更高浓度的甲醛可以缩短反应时间和测量浓度更高的样品，此时应注意设立新的标准曲线。
4.2 二硫苏糖醇非常容易氧化，对GSH测定干扰较大，本方法不适于二硫苏糖醇共存时GSH的分析测定。
4.3 与甲醛反应性质为第1种的物质其浓度不应大于表3中的数据，如Cys浓度应小于20mmol·L-1。
4.4 不能使用磷酸缓冲液，因为容易和DTNB溶液发生颜色反应干扰分析。
4.5 颜色反应必须在25℃完成，甲醛不改变最后的A值但会稍微延长颜色反应完成的时间，将分析样品放于25℃水浴中5min足够达到要求。
4.6 测定含疏基物质如辅酶A、蛋白质等含量较高的溶液中的GSH浓度时，最好先减少这些物质并作对照。
4.7 氧化型GSH还原以后才能使用本分析方法测定。
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