SIAH1与Bim在乳腺癌中的表达及意义.docx

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SIAH1与Bim在乳腺癌中的表达及意义

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论文中英文摘要格式

作者姓名：

温媛媛

论文题目：

SIAH1与Bim在乳腺癌中的表达及意义

作者简介：

温媛媛，女，1982年2月出生，2005年8月师从于中国医科大学病理学教研室宋敏教授，于2010年7月获博士学位。

中文摘要

前言

乳腺癌是女性一种常见的恶性肿瘤，已成为女性死亡的主要原因。

乳腺癌的发生经历了以下几个阶段：

正常—普通导管增生—不典型增生—导管原位癌—乳腺浸润性导管癌，探讨与乳腺癌动态发展过程相关的基因对治疗乳腺癌具有重要意义。

SIAH家族蛋白是果蝇属SINA蛋白的同系物，人类有两个高度保守的同源SINA：

SIAH1和SIAH2，siah1定位于16q12号染色体，编码282个氨基酸，与果蝇属sina有76﹪的氨基酸相似，siah2定位于3q25号染色体，编码了324个氨基酸，与果蝇属sina有68﹪的同一性，与siah1有77﹪的同一性。

然而SIAH1和SIAH2蛋白在N端有显著差别。

SIAH1蛋白具有E3泛素连接酶的活性，可调节一些蛋白的泛素化和降解，这些蛋白包括ß-catenin，c-myb，APC和SIAH1本身。

SIAH1可作为一种肿瘤抑制因子发挥生物学作用，研究发现SIAH1在肝癌细胞系中低表达且过表达SIAH1后可诱导肝癌细胞的凋亡。

乳腺癌细胞过表达SIAH1后可通过改变有丝分裂来抑制细胞生长和诱导细胞凋亡。

还有研究表明SIAH1可以在p53依赖和独立的细胞凋亡和肿瘤抑制细胞模型中表达。

Bim（Bcl-2interactingmediatorofcelldeath）是Bcl-2家族中BH3-only亚家族的成员，是一种重要的凋亡调节蛋白。

现已明确，Bim分子在一定的凋亡刺激下被激活，活化的Bim分子即可通过与Bcl-2/Bax的相互作用激活Bax，从而引起线粒体途径的细胞凋亡。

最近有研究发现SIAH1可能通过JNK/c-jun途径来调节细胞凋亡。

JNK信号通路在细胞应激和细胞凋亡中起重要作用，且JNK可通过调控Bim的表达来诱导细胞凋亡。

所以我们推测SIAH1可能通过JNK通路来调控Bim，从而诱导乳腺癌细胞的凋亡，但上述假设是否成立？

其具体机制如何？

这些问题需要我们进一步研究证实。

本研究目的旨在探讨乳腺组织中SIAH1和Bim的表达情况及与临床病理学参数的意义。

在细胞水平上，通过过表达和干扰SIAH1，观察其对Bim表达，MAPK信号通路活性及对乳腺癌细胞凋亡和生长侵袭能力的影响。

材料与方法

1、乳腺组织

本研究选取了231例乳腺组织标本（包括40例正常乳腺组织，53例乳腺不典型增生组织，36例乳腺导管原位癌组织和102例乳腺浸润性导管癌组织），均来自中国医科大学附属第一临床学院2005-2008年肿瘤外科手术切除的标本，所有患者术前均未接受放、化疗。

标本经4%中性甲醛固定，石蜡包埋，HE常规染色后明确诊断。

其中部分癌旁乳腺组织（远离肿瘤至少5厘米）和癌组织离体后立即放入液氮后-70℃冰箱保存备用。

2、免疫组织化学染色及结果判定

标本用中性福尔马林溶液固定，石蜡包埋，制成4μm切片，经脱蜡，脱苯，水化后，采用链菌素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组化法（S-P法）检测SIAH1和Bim蛋白表达。

多克隆抗体SIAH1和Bim4℃孵育过夜。

以PBS缓冲液代替一抗为阴性对照。

结果判定：

SIAH1和Bim以细胞质中出现棕黄色颗粒为阳性显色。

高倍视野（×400）下选阳性信号最强区域计数200个肿瘤细胞中阳性细胞数，按SIAH1和Bim表达百分率分为以下四个等级：

0%为0分，1%-50%为1分，51%-75%为2分，>75%为3分。

根据免疫组化染色强度分为三个等级：

浅黄色计为1分，棕黄色计为2分，黄褐色计为3分。

以阳性细胞率和染色强度的分值乘积作为每一例的积分，积分<4者判定为阴性，积分≥4为阳性。

3、细胞培养

用含10%新鲜胎牛血清的DMEM培养基，在37℃，5%CO2的条件下培养人乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF7，人乳腺正常上皮细胞系MCF7-10A。

4、WesternBlot

在收集的细胞内加入裂解液充分裂解，低温高速离心（4℃，12000转/min，30min），提取上清为总蛋白。

上样蛋白量为60μg。

电泳（12%SDS-PAGE凝胶）、转印、封闭，一抗SIAH1（1:

400）、Bim（1:

1000）、JNK（1:

1000）、p-JNK（1:

1000）、ERK（1:

400）、p-ERK（1:

400）、p38（1:

400）、p-p38（1:

400）和β-actin（1:

200），4℃孵育过夜，分别与各自对应的二抗（1:

4000）室温孵育2小时，ECL显色，结果经自动凝胶成像分析仪采集，进行灰度值测定。

5、RT-PCR

采用TrizolTM试剂提取乳腺癌组织或培养细胞的总RNA，利用RNAPCRKit（AMV）Ver.3.0试剂盒进行反转录。

分别扩增SIAH1和Bim，以β-actin为内参。

扩增产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，成像分析。

6、siRNA干扰

根据siRNA设计原则，选取人SIAH1mRNA和BimmRNA中的特异性核苷酸片段为靶目标，应用Ambion公司在线siRNA设计软件设计SIAH1和Bim的RNAi序列，经Blast确定所选靶向的基因是特异的，序列由上海吉凯基因化学技术有限公司合成。

实验分三组：

空白对照组、非特异性siRNA转染组和特异性siRNA转染组，每个实验均重复三次，转染具体步骤按Lipofect2000试剂说明书进行。

SIAH1

siRNA序列：

1：

5'-AACTCCTGCCTCCTTATGTATTT-3'，2：

5'-GAUAGGAACACGCAAGCAA-3'，3：

5'-GUUGCAUGUAGUAACACUA-3'。

非特异性siRNA1（controlsiRNA1）序列：

5'-AAGAGCCGTCAGACTGCTACA-3'。

BimsiRNA序列：

1：

5'-ACCGAGAAGGUAGACAAUU-3'，2：

5'-CUACCUCCCUACAGACAGA-3'，3：

5'-CUACCUCCCUACAGACAGA-3'。

非特异性siRNA2（control

siRNA2）序列：

5'-CGUACGCGGAAUACUUCGA-3'。

鉴于转染效率和稳定性，我们选择SIAH1siRNA1和BimsiRNA1进行实验。

7、细胞转染

SIAH1表达质粒pcDNA3-myc-SIAH1和对照质粒pcDNA3-myc由MatsuzawaShu-ichi（BurnhamInstitute，LaJolla，California，USA）教授惠赠。

具体转染步骤按脂质体LipofectamineTM试剂说明书进行。

以未转染的细胞和转染空载体细胞作为对照。

8、MTT法检测细胞增殖

将单个细胞悬液接种于96孔培养板中，每孔含104个细胞，培养24小时，每孔加入MTT（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazoliumbromide）溶液继续培养4小时，加入DMSO，490nm波长下测定各孔吸收值，以不含细胞的等体积培养基作对照。

绘制细胞生长曲线。

9、细胞侵袭能力检测

在transwell小室下室加入600μl含10%胎牛血清DMEM培养基，上室加入100μl预冷的用无血清DMEM培养基稀释的Matrigel（1:

7），将转染后24小时的细胞接种到上室。

37℃，5%CO2孵箱中培养32小时后吸尽培养基，PBS清洗后，甲醇室温固定15分钟，用棉签擦掉微孔膜上表面的细胞，苏木素染色，室温干燥过夜。

取下微孔膜，置载玻片上，镜下观察。

10、流式细胞仪检测细胞凋亡

收集对数生长期细胞制成1×107个/ml细胞悬液。

取1ml细胞悬液75%冷乙醇于4℃固定、离心后制成500μl的细胞悬液，加碘化丙啶染液于4℃孵育45分钟后上机检测，ModFitLT3.0软件分析细胞凋亡。

sub-G1期细胞代表凋亡细胞。

11、统计分析

各组资料利用SPSSforWindow13.0进行统计分析。

P<0.05有统计学意义。

结　果

1、SIAH1在乳腺癌中低表达，且可通过上调Bim表达来诱导乳腺癌细胞凋亡

（1）SIAH1和Bim蛋白在乳腺癌癌变过程中表达逐渐下调，并且二者表达与乳腺癌分期和分化相关：

免疫组化结果显示，SIAH1和Bim蛋白在乳腺正常组织，乳腺不典型增生，乳腺导管原位癌和乳腺浸润性导管癌中的阳性表达率分别为85.0﹪与87.5﹪，66.0﹪与67.9﹪，52.8﹪与63.9﹪，28.4﹪and34.3﹪。

统计学结果显示：

SIAH1（P=0.002）和Bim（P=0.008）蛋白在乳腺正常组织和导管原位癌中表达有明显差别，SIAH1（P=0.016）和Bim（P=0.002）蛋白在导管原位癌和浸润性导管癌中表达也有明显统计学意义。

在231例乳腺组织中，SIAH1与Bim蛋白表达呈正相关（P<0.001，rs=0.395）。

SIAH1（P=0.025和P=0.018）与Bim（P=0.045和P=0.032）蛋白在高分化和早期乳腺癌中呈高表达。

（2）SIAH1mRNA和蛋白在乳腺癌组织和乳腺癌细胞系中低表达：

RT-PCR和Westernblot结果显示，SIAH1mRNA（P<0.05）与蛋白（P<0.05）在乳腺癌组织表达低于癌旁乳腺组织，在乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7中表达低于乳腺正常上皮细胞系MCF-10A（P<0.05）。

（3）过表达SIAH1后可上调Bim的表达，从而诱导乳腺癌细胞凋亡：

实验结果表明，与乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7转染空质粒组相比，转染pcDNA3-myc-SIAH1后，Bim（P<0.05）表达上调，细胞凋亡率（P<0.05）增加；与乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7转染pcDNA3-myc-SIAH1相比，共转染pcDNA3-myc-SIAH1和SIAH1siRNA1后，凋亡率（P<0.05）明显减少。

（4）过表达SIAH1以不依赖Bim的途径来抑制乳腺癌细胞的侵袭：

细胞侵袭实验表明，与乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7转染controlsiRNA1组（13.26±2.18与11.43±1.83）或未转染组（15.45±2.36与11.69±1.62）相比，转染SIAH1siRNA1组（55.21±5.23与43.17±4.12）后，乳腺癌细胞侵袭力（P＜0.05）增加。

相反的，乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7转染pcDNA3-myc-SIAH1（3.21±0.96与2.93±0.73）后，细胞侵袭力比转染pcDNA3-myc组（14.36±2.32与11.73±1.76）或未转染组（15.45±2.36与11.69±1.62）降低。

乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7共转染pcDNA3-myc-SIAH1与BimsiRNA1（3.06±0.89与2.09±0.68）后，细胞侵袭力与单独转染pcDNA3-myc-SIAH1组（3.21±0.96与2.93±0.73）相比无明显差别。

2、SIAH1可激活JNK通路上调Bim表达来诱导乳腺癌细胞凋亡，且可使ERK通路失活来抑制乳腺癌细胞侵袭

（1）SIAH1在乳腺癌细胞系中可调控MAPK通路的活性：

Westernblot结果显示，过表达SIAH1后可上调P-JNK蛋白的表达且可下调P-ERK蛋白的表达。

相反的，干扰SIAH1后可下调P-JNK蛋白的表达且可上调P-ERK蛋白的表达。

过表达或干扰SIAH1对P-P38蛋白的表达无明显影响。

（2）过表达SIAH1可通过激活JNK/Bim通路来诱导乳腺癌细胞凋亡：

Westernblot结果表明，采用JNK通路的特异性抑制剂SP600125后，过表达SIAH1导致的P-JNK和Bim蛋白表达上调被抑制。

流式结果显示，过表达SIAH1诱导的乳腺癌细胞凋亡可被SP600125抑制。

（3）过表达SIAH1可通过ERK通路来抑制乳腺癌细胞侵袭：

Westernblot结果表明，采用ERK通路的特异性抑制剂PD98059后，干扰SIAH1导致的P-ERK蛋白表达上调被抑制。

Transwell结果表明，干扰SIAH1导致的乳腺癌细胞侵袭力增加可被PD98059抑制。

（4）JNK通路和ERK通路同时影响SIAH1调节的乳腺癌细胞生长：

MTT结果显示，过表达SIAH1抑制乳腺癌细胞的生长可被SP600125影响。

同时，我们观察到干扰SIAH1促进乳腺癌细胞的生长可被PD98059抑制。

结　论

1、SIAH1在乳腺癌癌变过程中可作为一种肿瘤抑制因子发挥作用，SIAH1与Bim表达呈正相关，并且它们均与乳腺癌的临床病理分期和分化密切相关。

2、在乳腺癌细胞中SIAH1通过调控JNK通路的活性来上调Bim表达，促进乳腺癌细胞凋亡。

3、在乳腺癌细胞中SIAH1通过调控ERK通路的活性来抑制乳腺癌细胞侵袭，且不依赖于Bim的表达。

关键词：

乳腺癌；SIAH1；Bim；JNK；ERK；凋亡；侵袭

TheexpressionandsignificanceofSIAH1andBiminbreastcancer

WenYuanyuan

ABSTRACT

Introduction

Breastcanceristhemostleadingcauseofcancerdeathinthewomenallovertheworld.Theoccurrenceofbreastcancerexperiencedseveralstages:

normal,normalductalhyperplasis,atypicalductalhyperplasis,ductalcarcinomainsituandinvasiveductalcarcinoma.Thus,acquireofnewtargetmoleculesthatplayimportantrolesinbreastcarcinogenesiswillbeessentialforimprovingtherapeuticinterventionandprognosisofbreastcancers.

SIAH（seveninabsentiahomolog）proteinsarehomologuesofDrosophilaseveninabsentia（SINA）protein.SINAhastwohumanhomologues,SIAH1andSIAH2.Siah1locatesinchromosome16q12andencodesa282-amino-acidproteinwith76%aminoacididentitytotheDrosophilaSINAprotein.Siah2mapstochromosome3q25andencodesa324-amino-acidproteinthatshares68%identitywithDrosophilaSINAand77%identitywithhumanSIAH1.SIAH1andSIAH2proteindiffersignificantlyattheirNtermini.SIAH1hasbeendescribedtohaveE3ubiquitinligaseactivityandtargetsomeproteins,suchasß-catenin,c-myb,APCandSIAH1,forubiquitin–mediatedegradation.SIAH1mayfunctionasatumorsuppressorgene.ThestudyshowedthatSIAH1expressionwaslowerinHCCcelllines,andoverexpressionofSIAH1couldinduceapoptosisofHCCcells.SomereportsshowedthatSIAH1overexpressioninhibitedcellgrowthandincreasedapoptosisthroughmajoralterationofmitosis.OthershowedthatSIAH1wasactivatedduringapoptosisandtumorsuppressioninp53-dependentand–independentcellularmodels.

TheBH3-onlyproteinBim（Bcl-2-interactingmediatorofcelldeath）isamemberofBcl-2famliy.Itisacriticalmediatorofcellapoptosisinvariouscelltypes.ItwasreportedthattheactivationofBimbycertainsitmulationofapoptosiswasinteractedwithBcl-2/Bax,inducingmitochondrialpathwayofapoptosis.

TheemergingevidenceshowedthatSIAH1couldinduceapoptosisbyactivatingthec-JunNH2-terminalkinade（JNK）pathway.AndJNKpathwayplayedanimportantroleincellapoptosis.SomestudiessuggestedthatBimwasinvolvedinJNK-dependentapoptosis.SowehypothesizedthatSIAH1mightinduceapoptosisbyup-regulatingtheexpressionofBimviaJNKpathway.Itisnecessarytoconfirmthissupposeinourfurtherstudies.

Inourpresentstudy,weimploredtheexpressionofSIAH1andBiminbreasttissuesandanalyzedtherelationshipbetweenSIAH1expressionandclinicalpathologyparameters.Inaddition,weexaminedtheoverexpressionorknockdownofSIAH1hadaneffectontheexpressionofBim,theactivityofMAPKpathway,apoptosisandinvasioninbreastcancercells.

MaterialsandMethods

1.Patientsandspecimens

Atotalof231casesofbreasttissues（including40casesofnormalbreasttissues（NBT）,53casesofatypicalductalhyperplasia（ADH）,36casesofductalcarcinomainsitu（DCIS）,and102casesofinvasiveductalcarcinoma（IDC））wereobtainedfromtheJanuary1st,2005totheDecember31st,2008attheFirstAffiliatedHospitalofChinaMedicalUniversity.Alloftheenrolledpatientsunderwentcurativesurgicalresectionwithouthavingchemotherapyorradiationtherapy.Formalin-fixedparaffin-embeddedsectionsoftissuesobtainedfromsurgicalsampleswerestainedroutinelywithhematoxylinandeosin（H&E）.Amongthesesamples,somefreshspecimensandcorrespondingnormaltissuesampleswerestoredat-70°CimmediatelyafterresectionuntiltheextractionofproteinandRNA.

2.Immunohistochemicalstudyandresultassessment

Four-micronthicksectionswerepreparedfromtheparaffin-embeddedtissues.

Immunostainingwasperformedbythestreptavidin-peroxidase（S-P）method.Fornegativecontrol,theprimaryantibodieswerereplacedbynon-immuneserum.Brownparticlesappearingincytoplasmwasasregardedaspositivecells.Theintensityofimmunostaining（1=weak,2=moderate,and3=intense）andthepercentageofpositivecells（0%=negative,1-50%=1,51-75%=2,≥76%=3）wereassessedinatleast5highpowerfields（×400magnification）.Thescoresofeachsampleweremultipliedtogiveafinalscoreof0,1,2,3,4,6or9,andthetissueswerefinallydeterminedasnegativeifscore<4;andpositiveexpressionifscore≥4