LCMSMS方法检测人血浆中普伐他汀的浓度.docx
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LCMSMS方法检测人血浆中普伐他汀的浓度
&58&药物分析杂志ChinJPharmAnal2009,29（1
LC-MS/MS方法检测人血浆中普伐他汀的浓度
张敏,谭志荣,陈豪,陈英,郭栋,周宏灏
（中南大学临床药理研究所,长沙410078
摘要
目的:
建立液质联用法测定人血浆中普伐他汀的浓度。
方法:
空白血浆加普伐他汀和内标,液液萃取后采用LC-MS/
*
MS进行分析。
采用日本InertsilODS-3柱（21mm50mm,5m,流动相为乙腈-1mmolL-1甲酸铵水溶液（含01%甲酸（6040,v/v,流速为02mLmin-1,柱温40!
进样量为10L,采用ESI正离子方式进行检测,用于定量分析的监测离子为m/z448∀3277（普伐他汀和m/z4832∀2586（罗素他汀。
结果:
本方法线性范围为0957~510ngmL-1（r=09991,最小检出浓度为0957ngmL-1,绝对回收率均在75%以上,相对回收率在80%~120%之间,日内、日间RSD均小于15%。
结论:
本方法经济、简便、灵敏,适用于普伐他汀血药浓度检测和药代动力学研究。
关键词:
液质联用;普伐他汀;血药浓度中图分类号:
R917
文献标识码:
A
文章编号:
0254-1793（200901-0058-04
LC-MS/MSdeterminationofpravastatininhumanplasma
ZHANGMin,TANZhi-rong,CHENHao,CHENYing,GUODong,ZhouHong-hao
（InstituteofClinicalPharmacology,CentralSouthUniversity,Changsha410078,China
*
AbstractObjective:
ToestablishanLC-MS/MSmethodfordeterminationofpravastatininhumanplasma.
Methods:
Afteradditionofrosuvastatin（internalstandardwithliquid-liquidextraction,theanalysisinvolvedaInertsilODS-3（21mm50mm,5mcolumn.Themobilephaseconsistedofacetonitrile-1mmolL
-1
-1
ammo
niumformatewatersolution（include01%formicacid（6040,v/vataflowrateof02mLmin,thecolumn
+
temperaturewassetat40!
.ESIwasperformedintheMRMmodeusingtargetionsatm/z448∀3277（pravastatinandm/z4832∀2586（rosuvastatin.Results:
Thepeakareaofpravastatininplasmashowedgoodlinearityintherangeof0957-510ngmL
-1
（r=09991,andtheLLOQofpravastatininplasmawas0957ngmL.
-1
Theextractedrecoverywas>75%,andtherelativerecoverywas80%-120%,theintra-andinter-dayRSDswere<15%.Conclusion:
Thismethodissensitive,simpleandaccurate.Anditcanbeusedfordeterminationofpravastatinsodiumtabletsplasmaconcentrationandit#spharmacokineticstudy.Keywords:
LC-MS/MS;pravastatin;plasmadrugconcentration
普伐他汀（pravastatin为3-羟基3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMG-CoA还原酶的竞争性抑制剂,可以抑制胆固醇的生物合成。
适合于能降低体内总的尤其适用于饮食限制仍不能控制的原发性高胆固醇血症（∃a和∃b型
[1]
测定。
1%仪器与试药
美国Waters公司QuattroMicroAPI型液质联用仪,配有电喷雾离子化源（ESI及MassLynx41数据处理系统;Waters2695型高效液相色谱仪带自动进样器。
试验制剂普拉固片,中美上海施贵宝制药有限公司,每片含普伐他汀钠10mg,批号0510056。
普伐他汀对照品由浙江海正药业股份有限公司提供,批号0502-1,纯度995%。
罗素他汀购自Sigma公司,纯度998%。
色谱纯乙腈、叔丁基甲
。
普伐他汀（pravastatin通常为钠盐形式,是一种
吸湿的结晶性粉末。
目前测定生物样品中普伐他汀含量的方法有气质联用HPLC
[4,5]
[2]
、放射化学法
[3]
、
和LC-MS/MS
[1,6]
分别测定尿、胆汁、肌
肉和人血浆中的普伐他汀的含量。
本研究提供了一
种经济、简单、高效和灵敏的方法对普伐他汀进行
%（-i:
lm
药物分析杂志ChinJPharmAnal2009,29（1&59&
基醚、甲醇、甲酸购自广州迪马公司,其余试剂均
为分析纯。
2%色谱质谱条件
色谱柱为InertsilODS-3柱（21mm50mm,
-1
5m;流动相为乙腈-1mmolL甲酸铵水溶液（含01%甲酸（6040,v/v,流速为02mLmin,柱温40!
自动进样瓶温15!
。
质谱采用ESI正离子方式监测;ESI源电压为35kV;源温度:
100!
;去溶剂气体温度:
350!
;锥孔气体流速:
50Lh;去溶剂气体流速:
450Lh。
普伐他汀及罗素他汀采集离子分别为m/z448∀3277、m/z4832∀2586（见图1。
-1
-1
-1
min,转移上清至另一干净玻璃管,30!
水浴氮吹仪
中挥干,以150L流动相溶解,进样10L。
5
专属性考察
在上述色谱条件下,测得人空白血浆、对照品溶
-1
液加空白血浆（5275ngmL和样品（2605ngmL
-1
质谱色谱图分别见图2-A、B、C。
由图可
见,普伐他汀的保留时间约为107min,内标罗素他汀的保留时间约为134min,空白血浆中的内源性
物质不干扰普伐他汀峰。
图1%普伐他汀（A及内标罗素他汀（B的二级质谱碎裂图Fig1
Productionmassspectraofdeprotonatedionsobtainedfrom
pravastatin（Aandtheinternalstandardrosuvastatin（B
331
对照品血浆及内标溶液的配制系列对照品血浆
精密称量普伐他汀对照品
-1
88mg,置于25mL量瓶,加甲醇溶解并稀释至刻度,颠倒及震荡摇匀,即得到358gmL普伐他汀储备液,置于4!
冰箱中保存。
将储备液用空白血浆按梯度稀释成510,255,1225,6125,30625,1531,766,3828,1914,0957ngmL对照品血浆,置于4!
冰箱保存备用。
32内标溶液精密称量罗素他汀对照品252mg,置于1mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,颠倒及震荡摇匀,即得到252mgmL储备液,置于4!
冰箱保存备用。
将储备液用甲醇稀释至252ngmL即得内标溶液。
4%血浆样品的预处理
取血浆500L,加入内标溶液100L,加入100mmolL甲酸铵水溶液100L,震荡30s,加入叔
-1
2min,r-1
-1
-1
-1
图2Fig1
普伐他汀的人血浆LC-MS/MS色谱图
RepresentativeLC-MS/MSchromatogramsforpravastatininhu
B.空白血浆+对照品（blankplasma+
manplasma
A.空白血浆（blankplasmareferencesubstance
oraladministrationpravastatin1.普伐他汀（pravastatin
2.内标（internalstandard
C.服药后2h血浆样品（humanplasma2hafter
6%线性关系考察
按∋31（项下方法制备系列对照品血浆,按∋4（
项下方法操作,以普伐他汀浓度为纵坐标,以普伐他汀和内标的峰面积比为横坐标,权重为1/X,绘制标准曲线,得到直线回归方程为:
=0278X0r=09991
&60&
-1
药物分析杂志ChinJPharmAnal2009,29（1
最低检测浓度为0957ngmL
7精密度及准确度测定mL
-1
（S/N=5。
上述色谱条件每份每天测定1次,计算浓度,求得日内RSD;连续测定3d,求得日间RSD。
低、中、高浓度的日内、日间RSD均小于15%。
测得相对回收率在80%~120%范围内。
见表1。
配制低、中、高浓度（1914,1531,255ng对照品血浆各5份,按∋4（项下方法操作,按
Tab1
C/gL-1
表1%精密度及准确度测定结果
Determinationofprecisionandaccuracy
日间（inter-day,n=3
回收率（recovery
RSD/%114945103211589382
测得值（found/ngmL-221672322
1
日内（intra-day,n=5
测得值（found/
ngmL-19141531255
221582278
1
RSD/%14614588
RSD/%14813695
回收率（recovery
RSD/%11494610919691185
8%提取回收率测定
配制低、中、高浓度（1914,1531,255ngmL
-1
存。
实验期间无不良事件发生。
平均血药浓度时间
曲线见图3。
主要的药物代谢动力学参数见表2。
对照品血浆各5份,按∋4（项下方法操作,求
得普伐他汀面积,并与相当浓度的普伐他汀对照品
溶液直接进样的面积比较,得提取回收率。
低、中、高的提取回收率（n=5分别为696%,725%,801%;RSD分别为52%,69%,65%。
9%稳定性考察
91融冻条件下的稳定性（1914,1531,255ngmL
-1
配制低、中、高浓度对照品血浆各5份,
图3%健康受试者口服40mg普伐他汀后的平均血药浓度-时间曲线Fig3
Healthysubjectsofplasmaconcentrationversustimeobtainedaf
teroraladministrationpravastatin40mg
在24h内25~-20!
之间反复融冻3次,分别于0,8,12,24h按∋4（项下方法对血浆进行处理,计算0,8,12,24h普伐他汀浓度,结果低、中和高浓度的RSD均<15%,准确度均符合指导原则要求。
92长期稳定性配制低、中、高浓度（1914,
-1
1531,255ngmL对照品血浆各5份,置于-20!
考察6d,分别于0,3,6d按∋4（项下方法对血浆进行处理,计算0,3,6d普伐他汀浓度,结果低、中和高浓度的RSD均<15%,准确度均符合指导原则要求。
10%应用
18名男性健康受试者,年龄为（233岁,体重（605kg;实验前经病史询问、体格检查和实验室检查未发现异常,2周内未服任何药物。
实验期间禁烟酒及含咖啡因的饮料。
受试期间统一清淡饮食。
本实验获得了伦理委员会的同意,受试者了解试验目的、方法、意义以及可能发生的不良反应后,均签署知情同意书。
受试者于实验前12h空腹,受试者清晨200mL温开水口服40mg普伐他汀,服药4h后统一进餐。
于0h和服药后025,05,1,15,2,25,3,4,6,8,12h从上肢肘静脉采血5mL。
立
!
-1
表2%18名健康受试者单剂量口服普伐他汀后药代动力学参数Tab2
Themeanpharmacokineticparametersaftera
singleoraldoseof40mgpravastatinin18healthsubjects
参数（parameters
T1/2/hTmax/hCmax/ngmL-AUC0-AUC0-12∗
1
11
XSD18403612204921213608349248129235131412250
/nghmL-/nghmL-
11%讨论
液质联用测定人血浆中的普伐他汀,文献中多
[1,6,7]
采用负离子模式进行检测,其最低检测限能达到025ngmL,进样量为10L,血浆用量为1mL。
本文采用正离子模式进行检测,最小检出浓度
-1
为0957ngmL,血浆用量为500L。
经过换算,正离子模式和负离子模式两者的灵敏度相近,但可节省血浆用量。
液质联用测定人血浆中的普伐他汀文献中多采用固相萃取法
[1,4~7]
-1
应用起来成本比较高。
本文在
药物分析杂志ChinJPharmAnal2009,29（1&61&
文献的基础上,综合了他汀类药物的性质,利用叔丁
基甲基醚（MTBE进行液液萃取,发现提取效率高,比固相萃取相对经济,而且操作简便、结果稳定。
参考文献
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tatinanditsbiotransformationproductsinhumanserumbyturboionsprayLC/MS/MS.JPharmBiomedAnal,2000,23（5:
851
（本文于2007年11月1日收到
+生物技术药物安全性评价,出版
%%药物安全性评价永远是新药研发中十分重要的研究内容之一。
对于生物技术药物而言,由于其种类繁多,性质各异,机理复杂,并多具有明显的免疫原性等特点,使得其安全性评价研究变的更加复杂。
随着我国生物技术药物的快速发展,对从事药物安全性评价研究的技术人员,既是机遇也是挑战。
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全书内容分上下两篇,共30章。
上篇以新药研发的时间顺序为主线,尽可能详尽地反映生物技术药物安全评价研究法规与指导原则、GLP规范、实验动物管理、生物技术药物的药效学、毒理学、病理学、药代动力学,以及技术审评、临床试验的内容,并对近年来国内外倍加关注的生物仿制药物的安全性评价问题,以及生物技术药物上市后不良反应检测及其对临床前安全评价的指导作用进行了探讨。
下篇则理论联系实际,结合自身的工作经验,逐一列举了重组治疗蛋白、多肽激素、单克隆抗体、疫苗、体内诊断变态反应原、基因治疗药物、反义寡核苷酸药物、组织工程产品、细胞治疗产品等各类生物技术药物安全评价的研究实例和考虑要点;同时对安全评价工作涉及的实验动物替代方法、统计处理方法,以及近年来在生物技术安全评价中应用的众多新技术、新方法等相关内容进行了全面介绍。
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本书内容新颖丰富、参考和实用性强,所介绍的研究内容与WHO和ICH等国际技术指导原则要求一致,可作为广大从事生物技术药物研究开发领域的科研工作者、教师、学生、药品注册人员、质量检定人员等的参考书。
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