荔枝皮中多酚类物质的提取分离及其抗氧化性能研究.docx
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荔枝皮中多酚类物质的提取分离及其抗氧化性能研究
荔枝皮中多酚类物质的提取分离及其抗氧化性能研究
中山大学化学与化学工程学院应用化学广州510275
摘要：
本实验通过传统的溶剂回流与超声辅助提取法，对桂味的果皮内的多酚物质含量进行提取。
本实验通过溶剂回流与与超声辅助提取法，对桂味的荔枝皮内的多酚物质含量进行提取。
实验证明，溶剂回流技术提取的效果较好，精密度也较高。
溶剂回流方法算得样品中多酚含量为22.380±0.037mg·g-1，回收率是75.9%；超声辅助提取法测得多酚含量为16.988±0.691mg·g-1，回收率是84.4%。
还对样品进行了氧化性能的测定，溶剂回流提取的样品IC50=0.395mg·L-1，超声提取的样品IC50=0.319mg·L-1，与没食子酸IC50=0.635mg·L-1，VcIC50=1.35mg·L-1进行比较，可得样品的IC50与没食子酸的IC50较为接近，比Vc大大减小，故样品与没食子酸抗氧化性能比Vc要强许多。
关键词：
荔枝皮多酚类物质溶剂回流提取超声辅助提取抗氧化性
1.引言
荔枝作为中药或其他食疗用途时，通常采用荔枝果肉，而大量荔枝果皮则作为废弃物丢弃，不仅造成环境污染，而且也是一种资源浪费。
因为研究表明荔枝皮中富含具有良好抗氧化和抗自由基的多酚类物质。
多酚类物质被称为“第七类营养素”，属植物次生代谢产物，具有多元酚结构（图1），它一般由三个环构成：
A环、B环（连接有羟基）和C环（含氧碳环），按结构可分为酚酸类（phenolicacids）、类黄酮类（flavonoids）及1,2-二苯乙烯（stilbenes）和木酚素类（lignans）。
多酚不仅具有较强的抗氧化能力，能有效清除体内过剩的自由基，抑制脂质过氧化，对自由基诱发的生物大分子损伤起到保护作用。
图1类黄酮类多酚的骨架结构
多酚类化合物的提取分离方法多种多样。
经典的提取方法主要是有机溶剂提取法，这种提取方法不需要特殊的仪器，应用较为普遍，但存在产品安全性低、耗时长、提取率不高等缺点。
随着科学技术进步，一些以先进仪器为基础的新型提取方法，如超声波辅助提取、微波辅助提取技术等，以其高效、节能、环保等优点，得到越来越广泛的应用。
DPPH在有机溶剂中是一种稳定的自由基，呈紫色，在517nm有强吸收。
有自由基清除剂存在时，DPPH的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度变小，这种颜色变浅的程度与配对电子数成化学剂量关系。
因此，可根据该波长处的吸光度检测自由基的清除情况，从而评价样品的抗氧化能力。
本实验以作为桂味的果皮为研究对象，分别以传统溶剂回流、超声辅助提取荔枝皮中的多酚类物质，通过紫外光谱（UV）研究多酚类物质的组成和含量，同时采用DPPH法测定荔枝皮乙醇提取物中总多酚的抗氧化性能。
2.实验过程
2.1实验仪器
紫外可见分光光度计（Varian），分析天平（0.1mg）。
其他一般实验室常用仪器。
2.2实验试剂
桂味2的干皮，分析纯95%乙醇、碘、碳酸钠、乙酸、浓硫酸，福林酚试剂、羧甲基纤维素；表儿茶素、儿茶素、没食子酸、绿原酸、槲皮素标准品；α,α-二苯-β-苦味肼（DPPH），色谱纯甲醇、乙腈，水为二次蒸馏水。
2.3实验步骤
2.3.1荔枝皮中多酚化合物的提取
溶剂回流提取法：
准确称取在60℃烘干的洁净荔枝皮样品5.0g，加入150mL95%乙醇溶液，水浴加热并回流1h。
过滤并用95%乙醇定容200mL备用。
平行两次实验。
超声波辅助提取法：
准确称取在60℃烘干的洁净荔枝皮样品2.0g，加入30mL95%乙醇溶液，超声提取30min。
过滤并用95%乙醇定容至50mL备用。
平行两次实验。
2.3.2Folin-Denis法测定荔枝皮中总多酚的含量
a.福林酚试剂。
b.没食子酸溶液（100mg/L）：
准确称取10.0mg没食子酸标准品，用水溶解后定容至100mL容量瓶中，摇匀备用，现配现用。
c.样品溶液配制：
准确移取适量提取液至50mL容量瓶中，用95%乙醇稀释备用。
d.标准曲线绘制：
取7支10mL具塞比色管，准确移取没食子酸溶液（100mg/L）0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.20、1.60mL，加入1.2mL福林酚试剂，摇匀后静置5min，加入3.0mL5%的Na2CO3溶液，用水定容至10.0mL，室温下避光放置30min，于644nm波长下测定标准系列溶液的吸光度，绘制标准曲线。
e.样品中总多酚含量的测定：
取适量样品溶液在上述2.4条件下测定其吸光度，计算样品中总多酚的含量，比较不同提取方法对荔枝皮中多酚的提取效果。
f.回收率测定：
通过向原料中加入一定量的没食子酸，重复提取测定过程，检测产品回收率。
2.3.3荔枝皮中总多酚的抗氧化性能研究
a.IC50测定步骤：
吸取系列样品溶液，分别加入5.0mL50mg/LDPPH-乙醇溶液，静置60min，于517nm处测定反应液的吸光度并计算其抑制率。
以吸取的样品量（浓度或质量）与相应的抑制率作图，图中抑制率为50%时对应的样品量为其IC50值。
b.没食子酸与Vc的抗氧化性对比：
配制100mg/L的没食子酸与Vc溶液，用同样方法配置一系列样品溶液，测定并计算其抑制率。
3.结果与讨论
3.1标准曲线的绘制
表1标准曲线测定数据
ID
1
2
3
4
5
6
浓度mg·L-1
2.000
4.000
6.000
8.000
12.000
16.000
吸光度
0.188
0.381
0.555
0.731
1.157
1.494
图1标准曲线
线性方程为y=0.09427x-0.00313，相关系数r2=0.9988
3.2荔枝皮中多酚的含量测定
表2不同萃取条件下提取量（稀释50倍）
条件
序号
浓度mg·L-1
吸光度
含量mg·g-1
平均值mg·g-1
标准差
回流
1
11.203
1.053
22.406
22.380
0.037
2
11.177
1.051
22.354
超声
1
13.120
1.109
16.400
16.988
0.691
2
14.061
0.946
17.576
可见，溶剂回流技术提取的效果较好，精密度也较高。
溶剂回流方法算得平均值为22.380mg·g-1，标准差0.037，故样品中多酚含量为22.380±0.037mg·g-1；超声辅助提取法测得样品平均含量为16.988mg·g-1，标准差为0.691，故样品中多酚含量为16.988±0.691mg·g-1。
3.3回收率测定
表3不同萃取条件下回收率测定（稀释100倍）
条件
序号
测定含量
mg·g-1
加入量
mg·g-1
浓度
mg·L-1
吸光度
回收含量
mg·g-1
回收率
%
平均回收率%
精密度
回流
1
22.406
22.300
9.958
0.936
39.832
78.1
75.9
3.11
2
22.354
22.200
9.679
0.909
38.716
73.7
超声
1
16.400
17.250
12.653
1.190
31.633
88.3
84.4
5.16
2
17.576
16.500
12.345
1.161
30.863
80.5
注：
回收率计算方法：
（回收含量-测定含量）÷加入量×100%
由上表可得，溶剂回流方法的回收率低于超声辅助提取法，溶剂回流的回收率平均值为75.9%，超声辅助提取法的回收率平均值为84.4%。
3.4抑制率标准曲线的绘制
图2 抑制率测定标准曲线
线性方程y=0.02856x，系数r2=1
3.5样品抑制率测定
表4不同样品抑制率的测定
加入量/mL
加入浓度/mg·L-1
测定浓度/mg·L-1
吸光度
抑制率
回流
0.01
0.1120
19.707
0.563
21.15
0.02
0.2240
16.688
0.476
33.33
0.03
0.3360
14.455
0.413
42.16
0.04
0.4480
10.494
0.300
57.98
0.05
0.5600
10.176
0.291
59.24
0.06
0.6720
10.563
0.302
57.70
0.08
0.8960
8.871
0.253
64.57
超声
超声
Vc
0.10
1.1200
7.626
0.218
69.47
0.12
1.3440
7.796
0.223
68.77
0.15
1.6800
6.458
0.185
74.09
0.20
2.2400
6.935
0.198
72.27
0.01
0.1312
18.929
0.540
24.37
0.02
0.2624
15.756
0.450
36.97
0.03
0.3924
12.859
0.367
48.60
0.04
0.5248
9.111
0.260
63.59
加入量/mL
加入浓度/mg·L-1
测定浓度/mg·L-1
吸光度
抑制率%
0.05
0.6560
9.017
0.258
63.87
0.06
0.7872
9.224
0.263
63.17
0.07
0.9184
8.312
0.237
66.81
0.08
1.0496
8.972
0.256
64.15
0.10
1.3120
8.100
0.231
67.65
0.12
1.5744
8.506
0.243
65.97
0.16
2.0992
6.385
0.182
74.51
0.20
2.6240
6.550
0.187
73.81
0.02
0.124
21.406
0.558
21.85
0.05
0.310
20.555
0.553
22.55
0.1
0.620
20.858
0.543
23.95
0.2
1.240
16.984
0.442
38.10
0.3
1.860
11.277
0.293
58.96
0.4
2.480
8.261
0.215
69.89
0.5
3.100
8.178
0.213
70.17
0.6
3.720
4.788
0.124
82.63
0.7
4.340
4.682
0.121
83.05
没食子酸
0.8
4.960
8.264
0.215
69.89
0
0
27.679
0.790
10.64
0.03
0.195
21.387
0.610
14.57
0.05
0.325
21.252
0.607
14.99
0.08
0.520
18.547
0.529
25.91
0.10
0.650
14.124
0.403
43.56
0.13
0.845
9.117
0.260
63.59
0.15
0.975
6.767
0.193
72.97
0.18
1.170
4.701
0.134
81.23
0.20
1.300
4.736
0.135
81.09
0.23
1.495
4.364
0.125
82.49
抑制率计算方法：
抑制率%=（A1-A2）/A1×100
其中，A1为对照标准的吸光值，在本次实验中为0.714；A2为样品反应液的吸光值。
3.6样品IC50的测定
3.6.1对溶剂回流样品，以吸取的样品量浓度与相应的抑制率和吸光度作曲线如图：
图3回流样品IC50测定曲线
由图可得，抑制率曲线和吸光度曲线交点对应的样品浓度为0.395mg·L-1，所以样品的IC50=0.395mg·L-1
3.6.2对超声样品，以吸取的样品量浓度与相应的抑制率作图作曲线如图：
图4超声样品IC50测定曲线
由图可得，抑制率曲线和吸光度曲线交点对应的样品浓度为0.319mg·L-1，即IC50=0.319mg·L-1
3.6.3对Vc样品，以吸取的样品量浓度与相应的抑制率作图作曲线如图：
图6Vc样品IC50测定曲线
由图可得，抑制率曲线和吸光度曲线交点对应的样品浓度为1.35mg·L-1，即IC50=1.35mg·L-1
3.6.4对没食子酸样品，以吸取的样品量浓度与相应的抑制率作图作曲线如图：
图5没食子酸样品IC50测定曲线
由图可得，抑制率曲线和吸光度曲线交点对应的样品浓度为0.635mg·L-1，即IC50=0.635mg·L-1
4.结论
本实验通过溶剂回流与与超声辅助提取法，对桂味的荔枝皮内的多酚物质含量进行提取。
溶剂回流技术提取的效果较好，精密度也较高。
溶剂回流方法算得样品中多酚含量为22.380±0.037mg·g-1，回收率是75.9%；超声辅助提取法测得多酚含量为16.988±0.691mg·g-1，回收率是84.4%。
还对样品进行了氧化性能的测定，溶剂回流提取的样品IC50=0.395mg·L-1，超声提取的样品IC50=0.319mg·L-1，与没食子酸IC50=0.635mg·L-1，VcIC50=1.35mg·L-1进行比较，可得样品的IC50与没食子酸的IC50较为接近，比Vc大大减小，故样品与没食子酸抗氧化性能比Vc要强许多。
参考文献
[1]肖小华，陈锦翎，司晓喜，许先芳，李攻科，微波辅助萃取荔枝皮中多酚化合物及其抗氧化性的研究，第十七届全国色谱学术报告会论文集，2009.4.19
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