大豆异黄酮含量的测定高效液相色谱法国家标准编制说明.docx

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大豆异黄酮含量的测定高效液相色谱法国家标准编制说明

大豆异黄酮含量的测定

国家标准编制说明

一、工作简况

（一）任务来源

本标准为2007年全国粮油标准化技术委员会下达的制定标任务，计划编号为-T-469。

由全国粮油标准化技术委员会归口，本国家标准的制订工作由黑龙江省出入境检验检疫局于2007年提出申请，由黑龙江省出入境检验检疫局和九三粮油工业集团有限责任公司负责研究和起草。

（二）制定本标准的目的和意义

大豆异黄酮是一类从大豆中分离的主要活性物质，是一类含有多个酚羟基的多酚化合物的总称，目前发现的大豆异黄酮共有12种（见图1）：

大豆黄素（Daidzein）、染料木素（Genistein）、大豆素（Daidein）及其相应的糖苷。

研究表明，其中异黄酮苷元被认为是大豆生物活性物中最具有医疗价值的活性成分，包括抗肿瘤、抗氧化和保护心血管作用，能够缓解和减轻女性更年期不适症状，改善骨质疏松等作用。

图1大豆异黄酮的结构式

由于大豆异黄酮具有显著的医疗保健作用，近年来在食品、医药等行业被广泛应用，以大豆异黄酮开发的产品在我国保健品行业中逐渐增多。

由于大豆异黄酮随着大豆及其制品在生产加工过程中加工方法或提取方法的不同，种类和含量也发生改变，对于大豆异黄酮种类和含量的检测，国家目前尚未制定统一的标准。

因此，为了使大豆异黄酮含量的测定方法标准适用性更广泛，使企业和流通领域在执行标准的过程中更加便于操作，建立一种专属和灵敏的测定各种异黄酮化合物的方法具有重要的意义。

（三）主要起草人及工作简况

《大豆异黄酮含量的测定》国家标准的制定由全国粮油标准化技术委员会总负责。

本标准的研制工作由黑龙江出入境检验检疫局和九三粮油工业集团有限责任公司共同承担完成，起草组主要成员有：

高勇、王乐、刘雨奇、……等，负责本标准制定的各项工作。

在标准的编制过程中，起草组成员之间多次通过电话、电子邮件等形式就标准中的问题进行沟通和探讨。

本标准的研制过程主要分为资料收集、课题研制和标准编写阶段。

主要工作过程分述如下：

1、资料收集和研究计划制订：

通过搜索互联网、查阅文献资料等手段收集当前国内外有关大豆异黄酮含量的测定的各种规范、标准和文献。

结果为目前国内还没有有关大豆异黄酮含量测定的各种规范和标准。

2、课题研制阶段：

通过课题组集中讨论的方式确定标准制定原则及基本框架，进行了大量细致和深入的实验研究，总结实验结果编制成标准的草稿。

3、根据GB/《标准化工作导则第1部分：

标准的结构与编写规则》、GB/《标准编写规则第4部分：

化学分析方法》的规定进行本国家标准的编制工作，组织部分食品生产和食品监督检验领域的专家对标准初稿进行审阅，根据审阅意见进行修订。

经过审阅和修订过程，形成“工作组征求意见稿”。

二、标准编制原则及主要内容

（一）标准编制原则

按全国粮油标准化技术委员会关于粮油检验方法标准的编制指导思想及原则作为本标准的编制原则。

新标准要适应建立社会主义市场经济体制和粮食流通体制改革的总体要求以及我国加入世界贸易组织的需要。

为市场服务，为企业服务，逐步建立健全粮食流通标准体系。

制、修订国家标准要有利于促进产业升级和产品结构的调整、推动技术进步和技术创新、推动与国际惯例接轨。

（二）编制依据和本标准主要内容

本标准遵循GB/T《标准化工作导则第1部分：

标准的结构和编写规则》和GB/T《标准编写规则第4部分：

化学分析方法》的编写规则。

本标准的主要内容有范围、规范性引用文件、原理、试剂与材料、仪器、测定步骤、计算和大豆异黄酮标准液相色谱图。

（三）新旧国家标准水平对比

目前没有国家标准。

（四）本标准的技术路线

本标准起草工作组查阅了大量国内外与异黄酮含量测定方法相关的资料，对三种固体大豆及其制品中异黄酮的含量进行了测定，优化了样品前处理方法和高效液相色谱的仪器工作条件，对线性范围、回收率和精密度等相关指标进行了检测。

三、实验结果与分析

实验样品与标准样品：

本次实验样品为大豆、豆奶粉、豆豉三种。

本实验的大豆异黄酮标准样品分别为：

①大豆甙（Daidzin）纯度≥98%（来源：

Sigma公司），②染料木甙（Genistin）:

纯度≥99%（来源：

Fluka公司），③大豆黄素（Daidzein）：

纯度≥98%（来源：

Sigma公司），④染料木素（Genistein）：

纯度≥98%（来源：

Sigma公司），⑤黄豆黄素（Glycitin）：

纯度≥98%（来源：

Wako公司），⑥黄豆黄素甙元（Glycitein）：

纯度≥98%（来源：

Wako公司）。

（一）样品前处理方法的研究

为了尽可能多地将大豆及其制品中含有的大豆异黄酮提取出来，做到损失少，提取后残留量低，更加接近真实值，对样品前处理方法进行了研究。

1．NaOH皂化提取法：

称取样品5g（精确至0.01g）置于100mL三角瓶中，加入40mL甲醇-水（80+20，V/V）溶液，在65℃水浴中振摇2h，冷却至室温，加2mol/LNaOH溶液3mL，振荡20min，加1mL冰乙酸，摇匀，转移至离心管中离心10min（3000rpm/min）。

将上清液转移至50mL容量瓶中，用提取液稀释至刻度，摇匀。

吸取上清液5mL置于10mL刻度试管中，加纯水4mL和10%冰乙酸，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，取适量于离心管中离心10min（3000rpm），取上清液过µm滤膜，供液相色谱分析。

2．盐酸水解提取法：

称取样品5g（精确至0.01g），加30mLL盐酸溶液，混匀，于沸水浴中回流3h，冷却后用L盐酸溶液定容至50mL容量瓶中,混匀。

取5mL水解样液用乙醇溶解后定容至25mL，摇匀，用µm滤膜过滤后供液相色谱分析。

3.超声辅助提取法：

称取样品5g（精确至0.01g），置于250mL碘量瓶中，用90ml90％的甲醇-水（9+1V/V）超声提取，温度为60℃，超声提取30min。

样品经10000r/min离心10min，吸取上清液，定量转移至250ml的容量瓶中，最后用少量90％甲醇洗涤碘量瓶和离心管，合并滤液及洗液，用90％甲醇定容至刻度，经μm滤膜过滤后供液相色谱分析。

三种样品前处理方法得出的大豆异黄酮总量见表1。

表1三种不同样品前处理方法测定的大豆异黄酮总量（g/kg）

样品名称

总异黄酮含量

豆豉

豆奶粉

大豆

NaOH皂化提取法

盐酸水解提取法

超声辅助提取法

由表1可以看出利用超声辅助提取法测出的大豆异黄酮含量最高最接近真实值，提取方法简单易操作。

利用NaOH皂化提取法和盐酸水解提取法测出的大豆异黄酮含量低，实验处理步骤繁琐，大豆异黄酮损耗多。

查阅文献资料发现超声辅助提取法为科研机构普遍采用的样品前处理方法，因此,本标准采用此方法进行试验和研究。

1）超声提取次数对大豆异黄酮提取效率的影响

考虑到随着超声提取时间的延长，样品温度逐渐升高会对某些大豆异黄酮结构产生破坏，本实验在一定超声提取时间和超声温度下,只考虑超声提取次数对测定结果的影响。

称取豆豉和豆奶粉样品5g（精确到0.01g），置于500mL碘量瓶中，加入90mL90％甲醇水溶液，在温度为60℃下，超声提取4次，每次提取30分钟，以10000r/min离心10min，上清液转移至250mL的浓缩瓶中，分别进行浓缩，最后定容至50mL。

提取后取20µL进行高效液相色谱进行测定，结果见表2。

表2不同超声提取次数对大豆异黄酮提取效率的影响（mg/kg_）

样品

1次

2次

3次

4次

豆豉

豆奶粉

由表2可见，随着提取次数的增加大豆异黄酮的测定结果逐渐变大，提取3次和提取4次的结果相差不大，本实验确定提取次数为3次。

每次30min。

2）超声提取温度对大豆异黄酮提取效率的影响

称取豆豉和豆奶粉样品5g（精确到0.01g），置于500mL碘量瓶中，加入90mL90％甲醇水溶液，分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃温度下超声提取30分钟，以10000r/min离心10min，上清液转移至250mL的浓缩瓶中，分别进行浓缩，最后定容至50mL。

提取后取20µL待测液进高效液相色谱进行测定，结果见表3。

表3不同超声提取温度对测定结果的影响（mg/kg_）

样品

30℃

40℃

50℃

60℃

70℃

豆豉

豆奶粉

由表2可见随着提取温度的增加，大豆异黄酮的测定结果逐渐变大，在60℃和70℃的条件下，结果相差不大，为了防止高温对大豆异黄酮的结构产生影响，本实验确定提取温度为60℃。

3）提取溶剂对大豆异黄酮提取效率的影响

大豆异黄酮易溶于甲醇、乙醇等有机溶剂和稀碱中。

查阅国内外文献发现大多数科研机构均用甲醇提取大豆异黄酮，本实验发现甲醇对大豆异黄酮溶解效果好、提取率高，为了使实验合理和易于操作，设计第一次超声提取用90ml90％的甲醇-水（9+1V/V）,第二次和第三次提取用60mL90％的甲醇-水（9+1V/V）。

（二）测定方法的研究

国内外测定大豆异黄酮的方法主要有紫外分光光度法，气相色谱质谱联用法，免疫检测法，高效液相色谱法，高效液相色谱-质谱联用法，毛细管电泳法。

紫外分光光度法只适合测定总异黄酮含量，气相色谱-质谱联用法需对样品进行衍生后测定，步骤繁琐。

高效液相色谱-质谱联用法、毛细管电泳法仪器价格昂贵,很难普及。

免疫检测法抗体制备不易。

高效液相色谱法是目前被广泛认可的检测方法。

1色谱工作条件的测定

1）检测波长的选择:

参考各文献比较了245nm、254nm、260nm等几个不同波长的峰,结果表明,260nm下灵敏度高,六种大豆异黄酮的响应值均较其它波长下要好，这与文献报道基本一致，所以本实验最后确定260nm为检测波长。

2）流动相的选择：

流动相选择的原则是可以使样品中各组分达到良好的分离，能保护色谱柱，延长仪器寿命，价格经济易得。

本文试验六种流动相对大豆异黄酮分离的影响，分别是含%醋酸的乙腈/水、含%三氟醋酸的乙腈/水、含10mmol/L醋酸铵的乙腈/水（pH3～）、含10mmol/L醋酸铵的甲醇/水（pH3～）、含醋酸的甲醇/水、%冰醋酸水溶液和%冰醋酸乙腈溶液。

结果发现%冰醋酸水溶液和%冰醋酸乙腈溶液按表4梯度洗脱时，六种大豆异黄酮的分离效果较好。

表4.梯度洗脱表

时间，min

%乙酸水溶液

%乙酸乙腈溶液

0

90

10

70

30

60

40

0

100

0

100

90

10

90

10

3）色谱柱的选择：

本实验共用了三种C18色谱柱（粒径5μm），分别为4.6mmx150mm、4.6mm×250mm和4.6mm×300mm三种型号。

实验发现4.6mmx150mm型柱分离效果不好，大豆甙和黄豆黄素两个峰重叠，其他峰峰间距较短。

4.6mm×250mm和4.6mm×300mm型柱，六种大豆异黄酮分离状况良好，没有杂质干扰，但是4.6mm×300mm型分离时间长，且效果和4.6mm×250mm差不多，所以本方法使用此型号（4.6mm×250mm，5μm）色谱柱；

在上述色谱条件下，色谱保留时间约为：

大豆甙、黄豆黄素、染料木甙、大豆黄素、黄豆黄素甙元、染料木素，色谱图见图2。

图2大豆异黄酮（大豆甙、黄豆黄素、染料木甙、大豆黄素、黄豆黄素甙元、染料木素）标准色谱图

（三）标准溶液配制及标准曲线的绘制

分别称取大豆甙、染料木甙、大豆黄素、染料木素、黄豆黄素、黄豆黄素甙元6种标准品10mg（精确到0.00001g），用60％甲醇（V/V）振摇溶解并定容至10mL，此溶液浓度均为mL的标准溶液，作为储备液。

-20℃保存备用。

将储备液逐级稀释成μg/mL、μg/mL、μg/mL、μg/mL、μg/mL标准系列，按优化后的色谱条件测定。

以大豆异黄酮浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性回归方程和相关系数见表5。

由表5可见六种大豆异黄酮的线性关系良好。

表5大豆异黄酮线性方程和相关系数

大豆甙

Y=+007X++004

R＝

黄豆黄素

Y=+007X++004

R＝

染料木甙

Y=+007X++003

R＝

大豆黄素

Y=+007X++004

R＝

黄豆黄素甙元

Y=++004

R＝

染料木素

Y=+007X++004

R＝

（四）方法的测定低限、回收率和精密度

1方法的测定低限

测定低限是采用添加法进行实测情况确定的，六种大豆异黄酮方法的测定低限均为kg。

三种基质LC-VWD的标准品图、测定低限图和基质的空白图参见（图3～9）,可满足测定要求。

2回收率和精密度

按优化后的样品前处理方法和高效液相色谱工作条件，采用添加标准溶液法对大豆、豆豉、豆奶粉三种样品分别进行回收率实验，结果见表7。

（五）、实验室间验证试验

本方法以大豆、豆豉为样品，分别添加kg、10mg/kg、30mg/kg三个水平，经吉林出入境检验检疫局、中国检验检疫科学研究院、辽宁出入境检验检疫局、黑龙江省质量监督检测研究院和农业部谷物及制品监督检验测试中心（哈尔滨）五家单位验证，其平均回收率和相对标准偏差结果分别见表8～9。

由表8～9可见，本方法的室间回收率、精密度试验结果符合检测要求。

表7不同样品基质中六种大豆异黄酮的回收率和精密度（n=6）

名称

大豆甙

添加水平

mg/kg

10mg/kg

30mg/kg

测定值

（mg/kg）

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

大豆

1

2

3

4

5

6

平均值

RSD（%）

名称

黄豆黄素

添加水平

mg/kg

10mg/kg

30mg/kg

测定值

（mg/kg）

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

大豆

1

2

3

4

5

6

平均值

RSD（%）

名称

染料木甙

添加水平

mg/kg

10mg/kg

30mg/kg

测定值

（mg/kg）

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

大豆

1

2

3

4

5

6

平均值

RSD（%）

名称

大豆黄素

添加水平

mg/kg

10mg/kg

30mg/kg

测定值

（mg/kg）

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

大豆

1

2

3

4

5

6

平均值

RSD（%）

名称

黄豆黄素甙元

添加水平

mg/kg

10mg/kg

30mg/kg

测定值

（mg/kg）

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

大豆

1

2

3

4

5

6

平均值

RSD（%）

名称

染料木素

添加水平

mg/kg

10mg/kg

30mg/kg

测定值

（mg/kg）

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

大豆

1

2

3

4

5

6

平均值

RSD（%）

名称

大豆甙

添加水平

mg/kg

10mg/kg

30mg/kg

测定值

（mg/kg）

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

豆

粉

1

2

3

4

5

6

平均值

RSD（%）

名称

黄豆黄素

添加水平

mg/kg

10mg/kg

30mg/kg

测定值

（mg/kg）

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

豆

粉

1

2

3

4

5

6

平均值

RSD（%）

名称

染料木甙

添加水平

mg/kg

10mg/kg

30mg/kg

测定值

（mg/kg）

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

豆

粉

1

2

3

4

5

6

平均值

RSD（%）

名称

大豆黄素

添加水平

mg/kg

10mg/kg

30mg/kg

测定值

（mg/kg）

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

豆

粉

1

2

3

4

5

6

平均值

RSD（%）

名称

黄豆黄素甙元

添加水平

mg/kg

10mg/kg

30mg/kg

测定值

（mg/kg）

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

豆

粉

1

2

3

4

5

6

平均值

RSD（%）

名称

染料木素

添加水平

mg/kg

10mg/kg

30mg/kg

测定值

（mg/kg）

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

豆

粉

1

2

3

4

5

6

平均值

RSD（%）

名称

大豆甙

添加水平

mg/kg

10mg/kg

30mg/kg

测定值

（mg/kg）

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

豆

豉

1

2

3

4

5

6

平均值

RSD（%）

名称

黄豆黄素

添加水平

mg/kg

10mg/kg

30mg/kg

测定值

（mg/kg）

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

豆

豉

1

2

3

4

5

6

平均值

RSD（%）

名称

染料木甙

添加水平

mg/kg

10mg/kg

30mg/kg

测定值

（mg/kg）

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

豆

豉

1

2

3

4

5

6

平均值

RSD（%）

名称

大豆黄素

添加水平

mg/kg

10mg/kg

30mg/kg

测定值

（mg/kg）

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

豆

豉

1

2

3

4

5

6

平均值

RSD（%）

名称

黄豆黄素甙元

添加水平

mg/kg

10mg/kg

30mg/kg

测定值

（mg/kg）

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

豆

豉

1

2

3

4

5

6

平均值

RSD（%）

名称

染料木素

添加水平

mg/kg

10mg/kg

30mg/kg

测定值

（mg/kg）

回收率

（%）

测定值

mg/kg

回收率

（%）

测定值

mg/kg