Western Blot常见问题及处理总结Word文档下载推荐.docx

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可以加大抗原上样量、这就是最主要得、同时也可以将一抗稀释比例降低。

6、胶片背景很脏,有什么解决方法?

减少抗原上样量,降低一抗浓度,改变一抗孵育时间,提高牛奶浓度、

７、目标带就是空白,周围有背景,就是为什么？

您得一抗浓度较高,二抗上HＲP催化活力太强,同时您得显色底物处于一个临界点,反应时间不长,将周围底物催化完,形成了空白即“反亮现象”。

将一抗与二抗浓度降低,或更换新底物。

8、我得胶片就是一片空白,就是怎么回事？

如果能够排除下面得几个问题那么问题多半出现在一抗与抗原制备上。

ａ）　二抗得HRP活性太强,将底物消耗光;

b）　ECM底物中H２O2,不稳定,失活;

ｃ）ＥCＬ底物没覆盖到相应位置;

d）二抗失活。

9、我在显影液中显影1分钟与5分钟后,底片漆黑一片,就是什么原因呢？

ａ）　可能就是红灯造成得,胶片本来就被曝光了,可以在完全黑暗得情况下操作.瞧就是否有改善、;

ｂ）显影时间过长。

10、DＡB好还就是EＣＭ好？

DAB有毒,但就是比较灵敏,就是HRＰ　最敏感得底物;

ＥCM结果容易控制,但被催化时灵敏度差一点,但如果达到阀值,就特别灵敏,可以检测pg级抗原。

要瞧您实验得情况。

１1、抗原检测出得分子量比资料上得大,就是怎么回事?

ａ）抗原形成了二聚体。

增多巯基乙醇量,煮沸变性时间延长,可以打开二聚体、b）蛋白本身得修饰如:

糖基化,磷酸化等

１2、蛋白转移不到膜上,但胶上有,同时Mａｒkｅｒ　转上去了,为什么?

可能就是:

ａ）样品浓度过低;

b）转移时间不够,。

13、磷酸化抗体得检测样本制备时就是否一定要加NaF等?

NａF就是一种广谱磷酸化酶得抑制剂,一般最好加。

但就是不加也可以,大部分时候就是不用加得。

1４、要验证某个细胞上有无该蛋白得存在,需要做免疫组化与ｗeｓｔernｂｌot试验不?

做这两个试验时得一抗与二抗可以共用不?

①　免疫组化可以用来进行定位,但就是不能精确定量,而且有时会有假阳性,不易与背景区分;

Ｗesternbｌoｔ可以特异性检测某个蛋白质分子,进行定量,但就是不能定位、

②两种实验得一抗有时候不能通用,公司得产品说明一般都会说明可以进行什么实验,在免疫组化时,就是否适合石蜡切片或者冰冻切片。

15、做WesｔernＢｌｏt时,提取蛋白后冻存（未加蛋白酶抑制剂）,用得博士德得一抗,开始还有点痕迹,现在越来越差,上样量已加到120μg,换了个saｎta　cloz得一抗仍不行。

就是什么原因？

蛋白酶抑制剂单加PMSF行不？

怀疑就是样品问题,可能就是:

1,样品不能反复冻融;

2,样品未加蛋白酶抑制剂、同时,建议检查Wｅstern　Ｂlot过程,提高一抗浓度、对于加蛋白酶抑制剂来说,一般加PMSＦ就可以了,最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。

1６、细胞水平要做wesｔernbloｔ,多少细胞提得蛋白够做westeｒｎblot?

一般5×

10^６就足够了

17、同一样品能同时提RNＡ又提蛋白么？

这样对westernblｏt有无影响？

能,没有问题。

１8、同一蛋白样品能同时进行两种因子得ＷesternBlot检测不？

当然可以,有得甚至可以同时测几十种样品。

1９、如果目标蛋白就是膜蛋白或就是胞浆蛋白,操作需要注意什么？

如果就是膜蛋白与胞浆蛋白,所用得去垢剂要温与得多,这时最好加上NaＦ去抑制磷酸化酶得活性。

20、我得样品得蛋白含量很低,每微升不到1微克,但就是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上,就就是在转膜后染胶发现有得孔所有得蛋白条带都在,只就是颜色变淡了,有什么办法可以解决？

您可以加大上样量,没有问题,还有转移时您可以用减少电流延长时间,加２０％甲醇、

21、想分离得蛋白就是分子量20０ｋd得,ＳDＳ—PAGE电泳得分离胶浓度多大合适？

积层胶得浓度又该用多少？

这么大分子量得蛋白容易作Ｗesteｒn　Ｂｌot不？

200kd得蛋白不好做,分离胶用7％,积层胶　3.５%、

22、如果上样量超载,要用什么方法来增加上样量？

可以浓缩样品,也可以根据您得目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。

一般地,超载30%就是不会有问题得。

如果已经超了不少了,而且小分子量得也要,可以考虑加大胶得厚度,可以试试1。

5mｍ得、

２3、蛋白变性后可以存放多久?

－80℃,一两年没有问题。

最关键两条:

不要被蛋白酶水解掉;

不要被细菌消化掉（也就是被酶水解了）。

24、我所测定得蛋白分子量就是1０5KD,按理说分离胶应当采用７。

5％,但资料却要求分离胶与浓缩胶均采用11％得配方,不知为何?

上述提到得两种凝胶均可以使用,因为105KD得蛋白在上述两种胶得线性分辨范围内,但需注意条带位置。

25、二抗就是生物素化得抗体,三抗就是亲与素生物素体系,不知采用这样得方案后,封闭液就是否要作调整,能否再用5％得脱脂奶粉呢？

好像有资料说脱脂奶粉会影响亲与素生物素得生成,就是不?

解答:

不能使用脱脂奶粉,因为脱脂奶粉中含生物素,用BＳＡ代替应该好一点.

２６、问一般一次上样得蛋白总量就是多少,跟目得蛋白得表达量有关系不？

WestｅrnBlot一般上样3０-10０微克不等,结果跟目得蛋白得丰度、上样量、一二抗得量与孵育时间都有关系,也与显色时间长短有关。

开始摸条件时,为了拿到阳性结果,各个步骤都可以量多一点时间长一点,当然背景也就出来了。

要拿到好得结果,如果抗体好得话比较容易,抗体不好得话就需要反复地试了,当然有得不适合Wesｔｅrn　Bloｔ得怎样做也不行、

２7、做组织样品得ｗesteｒn得时候,怎样处理样品?

必须进行研磨、匀浆、超声处理,蛋白质溶解度会更好,离心要充分,膜蛋白需用更剧烈得方法抽提,低丰度膜蛋白可能还要分步抽提（超速离心）。

还有一点就就是组织中得蛋白酶活性更强,需要注意抑制蛋白酶得活性（加入ＰMSF）。

28、问大分子量蛋白2０0KD,在做wesｔern要注意什么呢?

做200kd蛋白得Westerｎ　Blot时要注意,分离胶最好选择>

７％得;

剥胶时要小心;

转移时间需要相应延长;

要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。

29、有什么方法可以提高上样量？

ａ）可以浓缩样品;

增大上样体积来增大上样量;

b）用5倍得上样缓冲液来稀释变性

３０、蛋白得上样量有没有什么具体得要求？

上样量要根据实验得要求来定,如果要求就是定量与半定量得WesｔｅrｎBlot则上样量要均等,如果只就是要定性,则没有太大得关系,　尽量多上就行了,但就是不要超载。

31、一抗,二抗得比例就是否重要?

比较重要,调整好一抗,二抗得比例,可以去掉部分非特异得本底、

32、要做磷酸化某因子WesterｎBｌｏt,其二抗有何要求？

对二抗无要求,要瞧您实验条件来选择,一般推荐用ＨＲP标记得二抗。

33、免疫组化与WestｅrｎBｌot可以用同一种抗体不？

免疫组化时抗体识别得就是未经变性处理得抗原决定簇（又称表位）,有些表位就是线性得,而有得属于构象型;

线性表位不受蛋白变性得影响,天然蛋白与煮后得蛋白都含有;

构象型表位由于受蛋白空间结构限制,煮后变性会消失。

如果您所用得抗体识别得就是蛋白上连续得几个氨基酸,也就就是线性表位,那么这种抗体可同时用于免疫组化与Weｓtｅrn,而如果抗体识别构象形表位,则只能用于免疫组化。

34、Weｓｔern　Ｂlot中抗体得可以重复应用不?

抗体工作溶液一般不主张储存反复使用,但就是如抗体比较珍贵,可反复使用2-3次。

稀释后应在２—３天内使用,4度保存,避免反复冻融。

３5、在做Wesｔern　Bloｔ时,PＶDＦ膜用甲醇浸泡得目得?

PVＤF膜用甲醇泡得目得就是为了活化PVDF膜上面得正电基团,使它更容易跟带负电得蛋白质结合,做小分子得蛋白转移时多加甲醇也就是这个目得、

３6、检测同一抗体得磷酸化与非磷酸化得抗原可以在同一张膜上不？

可以。

37、转膜后经丽春红染色得条带,为什么大蛋白分子得一端得转膜好象不就是很好,为什么?

这就是正常得,大分子得蛋白转移得慢,您延长转移时间与电流,大分子一端就会好得多,但就是小分子得就有可能会变淡。

３８、做ＷestｅrnBｌoｔ时,同样得抗体免疫组化能做出,而WｅｓternBloｔ却不能？

这多半就是抗体得问题,要瞧抗体得说明,就是否能做WesternBlｏｔ与免疫组化。

3９、如果就是６×

8转印膜,要加多少一抗?

一抗得稀释度就是有说明得,根据您得一抗瞧瞧就知道了,但就是那么大得膜孵育体积一般最少为３—５ml。

40、上下槽缓冲液有何要求,怎样才能达到最佳效果、

无特殊要求。

但我们一般就是上槽放新鲜得缓冲液,下槽可以就是重复使用过一两次得缓冲液

41、跑电泳得时候配得胶总就是“缩”就是什么原因呢?

就是有得成分不对不？

没什么问题,就就是您胶里得水分被蒸发了。

过夜时拿保鲜膜包起来,在里面加点水保持湿度就可以了;

也可能母液（３0％聚丙酰胺）有问题,您可以重新配制一份观察;

能够替换得试剂,尽量换一下,选用好得试剂。

４2、蛋白质得分子量跨度很大,如要分离小２1KＤ,中至６6KD,大至170KD,可以一次做好不？

这么广得分布不好转移,一般建议:

2１kｄ与66kd可以一起转,１２％SＤS—ＰAGE,　湿转120mA,4５—6０min就可以了,可以根据您实验室得经验调节;

170kｄ用7％SDS－ＰＡＧE,200mA9０—12０ｍｉn。

4３、不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上,转移效率低怎么样解决?

可以考虑:

转移缓冲液中加入２０％甲醇（就是指终浓度）,因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率,但可增加蛋白质与NC膜得结合能力,甲醇可以防止凝胶变形,甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间;

转移缓冲液加入终浓度0。

1％ＳDS,也就是为了增加转移效率;

用优质得转移膜,或使用小孔径得ＮC膜（0、2微米）、

４4、我用得就是可视mａrｋｅr,但就是电泳总跑不全8条带,请问什么原因？

怎样改善？

胶用过8％,1０％,1２%,都就是这样、ｍarker就是新买得。

一般来说,就是小分子量Ｍaｒker跑走了,增加胶浓度或减少电泳时间试试瞧。

当然梯度胶也就是不错得选择、

4５、就是否WesteｒnBlot实验半定量一定要加ＡCTIＮ内参？

对于发表文章得实验最好加内参,实验严谨。

４６、核内抗原ＷeｓｔernＢlot内参选择什么合适？

可以选用组蛋白,组蛋白在细胞核中得表达就是很稳定得,有很多都可以当成内参,在网上查查就可以选出您要得内参。

4７、做半定量WesterｎＢlｏt,内参β—ａcｔiｎ,GＡPDH哪个好?

选用betａ—acｔｉn就可以。

48、想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则不？

受不受组织来源得影响？

胞膜与胞浆有区别不？

一般来说提取时加入广谱得蛋白酶抑制剂就可以了,操作时保持低温。

除非有文献特别指明用特殊得方法,一般来说都没有区别。

4９、转膜后得脱脂奶粉封闭液就是５％得TＢST脱脂奶粉"

其中ＴBSＴ最后那个T就是Tweｅn不,浓度多大？

就是Tｗeｅn,配方如下:

Tris-Ｂuffｅｒed　SalｉneTwｅen-2０（TBST）,NaCl:

８g,Ｔrisbａse:

2。

４2ｇ加水８0０mｌ溶解,加500—１00０ｕl　得Tween-20,　用HCl调节pH　至7。

4,加水定容至　１L。

5０、封闭,一抗,二抗时得温度有没有什么规定呢,比如在室温里做,或者要在4度下？

均可在室温进行,如果时间不够,一抗孵育可以先在室温进行一个小时,然后４度过夜。

５1、请问一下PVDF膜与硝酸膜结合蛋白得原理就是什么？

一般而言,硝酸纤维素膜就是通过疏水作用来与蛋白质相联,这样得话,反复洗几次后,蛋白容易掉下来,结果较差。

ＰVDF膜主要通过它膜上得正电荷与蛋白接合,同时也有疏水作用,但相对较弱。

这样得话,PVDF膜与蛋白接合较牢,不易脱落,结果较好。

52、怎样才能把胶跑得非常漂亮,泳道都能很直,上样得量与灌胶就是否很重要,电压有什么要求?

影响跑胶跑得质量,有以下几个因素:

１、电压,小得电压会使胶得分子筛效应得到充分发挥。

电压越小,条带越漂亮,浓缩胶55v,分离胶７５ｖ就能跑得很好。

２、胶得均匀度,胶越均匀,条带越窄,分离越均匀、倒胶之前,一定要充分混匀,玻璃板一定要干净,双蒸水隔离时,一定要比较轻地加上去,避免稀释上层得分离胶、

53、为什么提高大分子量蛋白得转移得时候,小分子量蛋白会丢失一些哪？

什么原因？

小分子得蛋白在转移过程中,会透过膜去,所以大分子得上去以后,有一部分小分子得就透过去了。