黄酮标准曲线绘制的实验报告.docx

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黄酮标准曲线绘制的实验报告

黄酮标准曲线绘制的实验报告

1.总黄酮的测定

1.1实验仪器

电子天平AR2140;

紫外可见分光光度计UV2754;

型数控超声波清洗器KQ3200DB;

超级恒温槽;

RotavaporR200旋转蒸发仪;

FD21C250冷冻干燥机2

1.2试剂及药品

芦丁标准品

硝酸铝国产分析纯（配成5%）

亚硝酸钠国产分析纯（配成10%）

氢氧化钠国产分析纯配成（配成1mol/L）

95%乙醇，无水乙醇国产分析纯（配成60%乙醇50%乙醇）

DPPH·（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，二苯代苦味肼基自由基）

Vc（Ascrobicacid，维生素C，抗坏血酸）

没食子酸对照品：

基准纯。

大青叶子采摘于海南大学东坡湖畔

1.3实验步骤：

1.3.1准备工作及波长的确定

样品60℃烘干粉碎机粉碎，过20目筛，装入试剂瓶中备用。

根据查阅文献总黄酮在波长为510nm处吸收值最大。

1.3.2参照品芦丁标准溶液的制备

精密称取120℃干燥至恒重的芦丁标准样品37.5mg置于100mL烧杯中,用60%乙醇溶解后定容至25mL容量瓶中,摇匀，即可得1.5mg/mL的芦丁标准溶液。

1.3.3标准品的测量及绘制标准曲线

精密吸取芦丁标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL,分别置于10mL容量瓶中，并定容至刻度线。

得到0.0mg/ml、0.15mg/ml、0.3mg/ml、0.45mg/ml、0.6mg/ml、0.75mg/ml、0.9mg/ml的标准品溶液，分别取1ml到试管中各加5%亚硝酸钠溶液0.3mL摇匀,放置6min,加10%硝酸铝溶液0.3mL摇匀,放置6min,加1mol/L氢氧化钠溶液4mL,再用60%乙醇溶液稀释至刻度,放置15min后,分别在510nm处测定其吸光度（Tai,Cai&Dai,2011）。

（以试剂空白做参比）

以吸光度A为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线。

用最小二乘法进行线性拟合,得c与A的线性回归方程以及相关系数R2。

序号

浓度（ug/ml）

吸光度

1

0

0

2

15

0.180

3

30

0.349

4

45

0.546

5

60

0.727

6

75

0.884

7

90

1.063

表1-1：

芦丁标准曲线测定数据

图1-2：

芦丁标准曲线

1.3.5样品的测试

根据查阅文献总黄酮在波长为510nm处吸收值最大。

取黄酮提取液，取提液2ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线则稀释5倍。

取稀释好的溶液4份1ml置入10ml的比色管中，其中一份用60%的乙醇定容，作为参比溶液。

其余各份各加5%亚硝酸钠溶液0.3mL摇匀,放置6min,加10%硝酸铝溶液0.3mL摇匀,放置6min,加1mol氢氧化钠溶液4mL,再用60%乙醇溶液稀释至刻度,放置15min后,分别在510nm处测定其吸光度。

代入标准曲线回归方程可得浓度数据（以芦丁为参比）,三次结果取平均值。

经换算后得样品中总黄酮含量。

样品总黄酮含量（mg/g）=X*n*V1/（V*W）

式中：

X—测出的浓度，mg/mL;（直接代入，不用换算。

）

n—稀释倍数，量纲为1;

VI—样液总体积，mL;

V—测定时取样体积，mL;

W—样品质量，g。

2.总分含量的测定

2.1实验仪器

ALZO4型电子分析天平:

上海梅特勒一托利多仪器有限公司;

DELA犯O型pH计:

上海梅特勒一托利多仪器有限公司;

723可见分光光度计:

上海菩华科技仪器有限公司;

DK一512型电热恒温水浴锅:

上海森信实验仪器有限公司;

容量瓶（250mL，10OmL，25mL）、比色管管（10mL）;

烧杯、移液管、吸耳球。

2.2试剂及药品

没食子酸对照品：

基准纯，购于上海分析试剂厂，置50℃真空干燥箱真

空中干燥4h。

乙醇为工业级，蒸馏水，其他试剂均为分析纯。

2.3Folin—Ciocalteu比色法测定总酚酸含量

3.3.1Folin—Ciocalteu试剂的配制

称取20g钨酸钠和5g钼酸钠于圆底烧瓶中，用140ml蒸馏水溶解，加入10ml85％的磷酸溶液和20ml浓盐酸，文火回流10h，然后加入3g硫酸锂及15ml双

氧水，加热沸腾15min至亮黄色，不得带微蓝和绿色。

冷却，移入250ml容量瓶中，定容，贮于棕色瓶中，4℃冰箱保存。

2.3.2对照品溶液制备

准确称取15．00mg干燥的没食子酸，加蒸馏水适量，超声溶解，放冷，以蒸馏水定容至50ml，制成0.3mg/mL没食子酸的溶液，作为对照品溶液。

将0.3mg/mL的没食子酸标准溶液分别配制成0.0mg/mL，0.03mg/mL，0.06mg/mL，0.09mg/mL，0.12mg/mL，0.15mg/mL、0.18mg/mL、0.21mg/mL的溶液，分别取1mL置于10mL的容量瓶中，加入2ml福林试剂，充分摇匀，加入0．75ml7.5％碳酸钠溶液．混匀，以蒸馏水稀释至刻度。

振荡一下，静置2h（Guo&Wei,2011）。

同时制作空白管。

为消除供试品溶液本身颜色的干扰，同时制作不加显色剂的对照管。

于765nm波长处测定吸光度值。

2.3.3标准曲线的制备

以吸光度A为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线。

用最小二乘法进行线性拟合,得c与A的线性回归方程以及相关系数R2。

序号

浓度（ug/ml）

吸光度（WL765.0）

0

0

0

1

3

0.132

2

6

0.284

3

9

0.411

4

12

0.582

5

15

0.712

6

18

0.843

7

21

1.013

表3-1：

没食子酸标准曲线测定数据

图3-1：

没食子酸标准曲线

2.3.4样品的测定

取提液2ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线则稀释5倍。

取稀释后溶液1ml四份,分别置于10mL比色管中，加入2ml福林试剂，充分摇匀，加入0．75ml7.5％碳酸钠溶液．混匀，以蒸馏水稀释至刻度。

振荡一下，静置2h。

同时制作空白管。

为消除供试品溶液本身颜色的干扰，同时制作不加显色剂的对照管。

于765nm波长处测定吸光度值。

总酚酸含量计算：

多酚含量（mg/100g）=

3.清除DPPH·的能力的测定

3.1.实验仪器、药品及试剂

2.1.1实验仪器

ALZO4型电子分析天平:

上海梅特勒一托利多仪器有限公司;

DELA犯O型pH计:

上海梅特勒一托利多仪器有限公司;

723可见分光光度计:

上海菩华科技仪器有限公司;

DK一512型电热恒温水浴锅:

上海森信实验仪器有限公司;

容量瓶（250mL，10OmL，25mL）、比色管（10mL）;

烧杯、移液管、吸耳球。

3.1.2试剂及药品

DPPH·（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，二苯代苦味肼基自由基）；

Vc（Ascrobicacid，维生素C，抗坏血酸）为分析纯；

无水乙醇，蒸馏水

3.2.1配制DPPH溶液

配制0.06mMDPPH试剂，放入冰箱4℃进行冷藏，以备用。

3.2.2参照品Vc标准溶液的制备

准确称取17.6mgVc到100mL的烧杯中用无水乙醇溶解后，置于50mL的容量瓶中定容至刻度线及可以得到2mmol/L的母液，分别量1、2、3、4、5、6ml至10ml的比色管中用无水乙醇定容至刻度线，则可以得到0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1mmol/L、1.2mmol/L的溶液。

从以上比色管中分别取0.1ml溶液置于试管中再加入3.9ml的DPPH，反应30min,在517nm测出吸光值（Thoo&Ho,2010），用无水乙醇代替待测液作为对照，用无水乙醇作空白，重复三组。

清除率=[（Ac-Ai）/Ac]×100%

式中，Ac：

0.1mL无水乙醇加3.9mLDPPH溶液的吸光度；

Ai：

0.1mL待测液加3.9mLDPPH溶液的吸光度。

3.2.3标准曲线的绘制

3.2.2测试数据及标准曲线的绘制

序号

C（mmol/L）

吸光度

清除率/%

0

0

0

1

0.2

0.529

14.92

2

0.4

0.424

30.90

3

0.6

0.32

46.73

4

0.8

0.209

63.62

5

1

0.11

78.69

6

1.2

0.02

92.39

表3-1：

VC标准曲线测定数据

以吸光度A为纵坐标,浓度c为横坐标,绘制标准曲线。

用最小二乘法进行线性拟合,得c与A的线性回归方程以及相关系数R2。

图3-1：

VC含量与吸光度的关系

图3-1：

VC含量与清除率的关系

3.2.4样品的测定

取提液4ml至10ml的比色管中用60%的乙醇定容至刻度线则稀释2.5倍。

取稀释后溶液0.1mL三份,分别置于10mL试管中，再分别加入配置好的DPPH溶液3.9mL,摇匀，反应30min后，分别在517nm处测定其吸光度。

代入标准曲线回归方程可得浓度数据（以Vc为参比）,三次结果取平均值。

经换算后得样品自由基清除率。

4.清除ABTS+自由基能力的测定

4.1ABTS+自由基的配制

准确称取0.19215gABTS于50mL的容量瓶中，用无水乙醇定容，摇匀，浓度7mmol/L；7mmol/LABTS+.与2.45mmol/L的高硫酸钾等体积混合，在室温、避光黑暗的条件下静置过夜反应12~16h，形成ABTS+自由基储备液。

该储备液在室温，避光的条件下稳定。

用前用无水乙醇稀释成工作液，于波长734nm处测得其吸光度为0.7000（±0.02），再装入棕色试剂瓶中，放入冰箱4℃进行冷藏，以备用。

4.2标准曲线的绘制

4.2.1参照品Vc标准溶液的制备及测试

准确称取8.8.mgVc到100mL的烧杯中用无水乙醇溶解后，置于50mL的容量瓶中用无水乙醇定容至刻度线及可以得到1mmol/L的母液，分别量1、2、3、4、5、6、7、8ml至10ml的比色管中用无水乙醇定容至刻度线，则可以得到0.1mmol/L、0.2mmol/L、0.3mmol/L、0.4mmol/L、0.5mmol/L、0.6mmol/L、0.7mmol/L、0.8mmol/L的溶液。

从以上比色管中分别取0.1ml溶液置于试管中再加入3.9ml的DPPH，反应30min,在517nm测出吸光值，用无水乙醇代替待测液作为对照（Zhu&Lian,2011），用无水乙醇作空白，重复三组。

清除率=[（Ac-Ai）/Ac]×100%

式中，Ac：

0.1mL无水乙醇加3.9mLABTS+自由基溶液的吸光度；

Ai：

0.1mL待测液加3.9mLABTS+自由基溶液的吸光度。

4.2.2测试数据及标准曲线的绘制

序号

C（mmol/l）

吸光度

清除率/%

1

0

0.00

2

0.1

0.57

12.04

3

0.2

0.493

23.92

4

0.3

0.422

34.88

5

0.4

0.351

45.83

6

0.5

0.276

57.41

7

0.6

0.2

69.14

8

0.7

0.118

81.79

9

0.8

0.035

94.60

表4-1：

Vc浓度与吸光值和清除率的数据

图4-1Vc浓度与其吸光值的关系

图4-2：

Vc浓度与其清除ABTS能力的关系

5.还原能力的测定

5.1实验试剂

磷酸盐缓冲溶液（配成PH6.60.2mol/l）;

K3Fe（CN）6溶液（配成1%）;

三氯乙酸（配成10%）；

FeCl3（配成0.1%）；

没食子酸

无水乙醇

5.2标准曲线的绘制

5.2.1试剂的配制

磷酸盐缓冲溶液（pH6.60.2mol/L）：

准确称取7.16g的磷酸氢二钠至100mL的烧杯中用蒸馏水溶解后，置于100mL的容量瓶中用蒸馏水定容，即可得到0.2mol/L的磷酸氢二钠，同样的方法配制0.2mol/L的磷酸二氢钠。

准确量取37.5mL的0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和62.5mL的0.2mol/L磷酸二氢钠溶液至烧杯中，用pH校正既可以得到磷酸盐缓冲溶液（pH6.60.2mol/L）。

5.2.2标准溶液的配制及测试

用没食子酸做标准曲线其浓度范围在50—300ug/ml，准确称取50mg没食子酸到100mL烧杯中用无水乙醇溶解后，置于容量瓶中用无水乙醇定容至刻度线，得到0.5mg/ml的母液，在分别取1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL至10mL的容量瓶中用无水乙醇定容至刻度先，得到50ug/ml、100ug/ml、150ug/ml、200ug/ml、250ug/ml、300ug/ml的溶液，取不同浓度的待测液或样品1ml于试管中，依次加入PH6.6磷酸盐缓冲溶液（0.2mol/l）2.5ml和1%K3Fe（CN）6溶液2.5ml后混合均匀，混合液于50℃水浴20min,再加入10%的三氯乙酸2.5ml。

于（3000r/min）离心10min,取2.5ml的上清液再依次加2.5ml蒸馏水和0.1%的FeCl30.5ml混合均匀，静置10min在700nm处测定吸光值，通过在700nm下的吸收值来测量提取物的还原能力，吸光值越高表明还原力越强，EC50的计算是吸光值为0.5时的浓度（Roy&Laskar,2011）。

5.2.3测试数据及标准曲线的绘制

Testset

gallicacidconcentrationug/ml

Absorbency

1

0

0

2

50

0.59

3

100

1.1

4

150

1.527

5

200

2.073

6

250

2.579

7

300

3.1

表5-1：

没食子酸的质量浓度和吸光值的数据

图5-1：

没食子酸的质量浓度与其吸光值的关系

6.超氧自由自测定

6.1实验试剂

1实验试剂

Tris-Hcl缓冲液（配制PH8.2050mmol/L）

邻苯三酚（配制3mmol/L）

VC

无水乙醇

6.2标准曲线的绘制

6.2..1试剂的配制

Tris-HCl（pH8.250mmol/L）缓冲溶液：

取0.6057g三羟甲基氨基甲烷（Tris），蒸馏水溶解定容至50mL容量瓶；取0.309mL分析纯盐酸溶液至100mL的容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，即得0.1mol/L盐酸溶液；分别取配置好的Tris50mL和0.1mol/L盐酸溶液22.9mL于100mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，用pH计进行校正即可以得到Tris-HCl（pH8.250mmol/L）缓冲溶液。

邻苯三酚：

配制10mmol/L的稀盐酸，取0.310mL分析纯盐酸溶液至1000mL的容量瓶中用蒸馏水定容至刻度线；取焦性没食子酸0.0095g，至25mL的容量瓶中用10mmol/L的稀盐酸溶液定容至刻度线。

6.2.2标准溶液的配置及测试

精密称取Vc标准样品0.0300g置于100mL烧杯中,用纯净水溶解后定容至100mL容量瓶中,即可得0.3mg/mL的Vc标准溶液。

将0.3mg/mL的Vc标准溶液分别配制成0.0mg/mL，0.03mg/mL，0.06mg/mL，0.09mg/mL，0.12mg/mL，0.15mg/mL，0.18mg/mL,0.21mg/mL,0.24mg/mL,0.27mg/mL,0.3mg/mL的溶液，分别加入4.5mL的Tris-HCl（pH8.250mmol/L）缓冲溶液于10mL的试管中，再加入1mL不同浓度样品或待测液，25℃反应10min，再加入25℃预热的邻苯三酚0.1mL（3mmol/L用10mmol/L的盐酸配制），迅速摇匀，于325nm出测定，加入邻苯三酚即开始计时，每隔30s读取一次，至5min，做好记录。

邻苯三酚的自氧化速率以无水乙醇代替样品，Tris-HCl缓冲溶液作空白。

清除率%=[（△Ac-△Ai）/△Ac]×100%

式中，△Ac：

邻苯三酚自氧化速率；

△Ai：

加入待测液后邻苯三酚自氧化速率。

6.2.3测试数据及标准曲线的绘制

吸光值

自氧化速率

抑制率

序号

时间min

1st

5th

邻苯三酚0.1ml

0.142

0.411

0.06725

1

浓度ug/ml

0

0

0

0

0

2

30

0.032

0.246

0.05350

20.45

3

60

0.015

0.179

0.04100

39.03

4

90

0.012

0.13

0.02950

56.13

5

120

0.007

0.074

0.01675

75.09

6

150

0.006

0.025

0.00475

92.94

表6-1：

Vc的质量浓度与吸光值和抑制率的的数据

图6-1：

Vc的质量浓度与其清除超氧自由基关系