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表面电荷密度也被报道了是通过成骨细胞和神经母细胞瘤细胞的取向从而影响集落形成。

[11,12]

当具有相反电荷的基团时，如脱乙酰壳多糖和藻酸盐的聚合物，在水性条件下混合，它们自发地结合形成聚电解质复合物（PEC）。

PECs组成主要包括至少两种相反电荷的聚合物[13]。

聚合电解质复合物形成的驱动力是带相反电荷的聚合物之间的熵和强烈的静电吸引力。

脱乙酰壳多糖可作为一种三维组织的生长的非蛋白质基质。

潜在地，它可以提供生物细胞组织增生和重建的引物[14]。

但是，脱乙酰壳多糖具有非常低的机械完整性，并降解地十分迅速。

许多研究已经进行了基于壳聚糖设计和制造的混合系统[15-17]，通过化学修饰的氨基和/或羟基基团，以实现改进机械性能，以及改进的生物性能[18-20]。

藻酸盐被认为是阴离子聚电解质。

壳聚糖和藻酸盐在动物研究中已被证明具有生物相容性，生物降解性的和生物功能性[21-24]。

聚电解质复合物的生物材料，特别是基于多糖的，具有的伤口愈合，药物递送和组织工程应用的潜能[17,21,25]。

PECs在已经开发的微胶囊，水凝胶，薄膜和泡沫[26-28]等方面产生了不同的生物材料。

近日，在维尔马报。

报道一种新的方法来合成PEC支架和薄膜[15]。

此方法允许更好地控制成分，混合和PECs的结构，其中后者可通过改变pH值来控制。

在较高的pH（〜8），以纳米胶体颗粒形式存在，而在低pH值（〜4），以纤维状的PECs的形式（图1）存在。

目前壳聚糖/海藻酸钠基薄膜包括PEC纤维。

另外，室温和基于水加工条件的PECs将有可能减轻与生物活性剂结合。

两者的机械性能的表面电荷特性影响其生物反应。

因此，在这里，我们报道其机械性能和脱乙酰壳多糖/藻酸盐类膜的表面电荷的测量。

这是对壳聚糖/海藻酸盐基生物材料表面电荷测量的第一项研究。

图1.壳聚糖/海藻酸钠溶液图光学图像。

如图所示（A）ChiAlgi60，（B）ChiAlgi80和（C）ChiAlgi90纤维结构为聚电解质配合物。

2.材料和方法

2.1材料

脱乙酰壳多糖（脱乙酰化，>

75％，分子量为300千道尔顿-400kDa的）和藻酸钠（分子量12KDa的-40KDa的）购自Sigma-Aldrich化学品公司。

所有这些化学品均是购自igma-Aldrich化学品公司。

2.2试验

使用Nanoscope-IIIA控制器并配备了J型压电扫描仪的多模AFM测量AFM力曲线（VeecoMetrologyGroup,SantaBarbara,CA）。

AFM针尖（NovascanTechnologies公司）通过二氧化硅珠（直径5微米和0.17牛顿/米2的弹簧常数）进行了预改性。

机械测试使用的是EnduraTech，ELF3200。

BrukerEquinox55FTIR光谱仪（布鲁克光谱公司，比尔里卡，MA）用于FTIR分析。

傅立叶变换红外光谱均被收集在传输（4000-400cm-1）和衰减全反射（ATR）模式（4000-600cm-1）中。

所有测量均通过4cm-1的分辨率进行共加入100次扫描。

2.3壳聚糖海藻酸钠薄膜的制备

该脱乙酰壳多糖溶液（1％w/v）的是用含有100微升的乙酸的30毫升的去离子水溶解0.3克壳聚糖而制备的。

该海藻酸钠溶液（1％w/v）的是用30毫升的去离子水溶解0.3克海藻酸钠而制备的。

脱乙酰壳多糖溶液逐滴于藻酸钠溶液使这两种溶液混合在一起。

下一步将混合溶液进行超声处理，空气干燥24小时，制成薄膜。

这些膜的脱乙酰壳多糖/藻酸盐比率分别为60/40的（壳聚糖海藻酸钠60）80/20（壳聚糖海藻酸钠80）和90/10的（壳聚糖海藻酸钠90）。

制备的膜的厚度是用数字测径器进行测量的。

2.4PEC含量测定

每个壳聚糖海藻酸钠的2毫升溶液在6000rpm下离心3分钟。

除去上清液后，加入1ml去离子水到残余物溶液中并混合。

此过程重复3次，以除去可溶部分。

残余PEC在50℃干燥和最终质量标记作为PEC组成。

2.5力数据集的数据分析

原子力显微镜（AFM）是一种用于表面分析高度无创的技术。

它也被广泛地用于确定表面电势[29-31]。

表面电位测量间接的通过AFM实验的力曲线确定。

在该技术中，力被测量为尖部-表面分离的函数。

除了静电相互作用，AFM力曲线分析也被应用到分子识别，蛋白质折叠和范德华相互作用[32,33]。

图2显示了一个典型的AFM力曲线的示意图。

收集力曲线（FV）的数据集，或力的映射，使用的是Nanoscope控制软件（版本NS3A，数字仪器）。

力映射涉及力曲线集合的每个点的规则间隔排列在两维（X-Y）的扫描区。

此FV数据集是偏转与位移曲线上的x-y平面（样品表面）的三维阵列。

力曲线的收集是通过移动垂直压电直到悬臂偏转达到触发值。

力曲线的接近部分终止在这一点上，与AFM针尖后退到预定的距离（在z扫描尺寸）。

在样品的二维（X-Y）扫描每个点重复进行这一过程。

FV测量在32微米×

32微米，间隔2微米（总计256点）的的区域内进行。

进针和退针曲线均被记录。

在每个点力曲线是1000次进针和退针曲线的平均水平。

在0.1mM，pH7.4的NaOH维持NaCl的溶液的收集FV数据集。

在力曲线中，x轴对应于悬臂和样品表面之间的高度，并且y轴对应于悬臂的偏转。

该曲线被分成三个区域（图2）。

C区域对应最初的悬臂运动，那里没有表面和针尖的相互作用。

尖端更接近表面，长程静电相互作用引起的尖端（区域B）的偏转。

由于表面电荷被反荷离子在含水条件下的吸附中和，AFM测定的力，基本上是针尖的反离子和样品表面之间的静电相互作用。

悬臂进一步向下移动，最终尖端与样品表面接触，并且尖端与样本的压缩引起了尖端（区域A）的进一步的偏转。

从AFM试验获得沿z轴运动与偏转曲线的示意图。

（A）材料表面的探针压痕和变形的线性度;

（B）由于表面电荷引起探针偏转的非线性区域;

（C）探针初始无偏转运动。

2.6表面电荷密度的测定

由于静电力是由AFM针尖和样品表面的双层之间的相互作用造成的，这些力可通过泊松-波尔兹曼方程来建模。

泊松-波尔兹曼方程的双层被描述为：

其中ψ为表面电位，e是基本电荷，β=1/（KT）是逆热能，并且k-1被定义为K2=2βe2n/（εε0）的德拜长度，由此n是在本体一价盐数量浓度并且εε0是水的介电常数。

泊松-玻耳兹曼方程可以通过考虑恒流充电（CC）或恒电位（CP）的边界条件[34,35]来解决。

另一种方法是用分析方程获得表面电荷密度[31]。

基于电解液中两个电极平面的电压表达式，Butt推导出介于半球形电极头与平面样品间的双电层电力，力F被描述为：

其中，R是尖端半径，L为德拜屏蔽长度，σtip和σsample分别针尖与样品电荷密度，并且z是针尖-样品的分离。

这个推导需要几个假设，包括小的表面电位，针尖-样品的分离比德拜长度大，并且尖端半径与分离相比，R»

z。

尽管有这些近似值，该实验测量通过力依赖的针尖-样品的分离，尖端半径，电解质浓度和pH成功的进行了描述。

它已被广泛应用于Si3N4和硅探针尖和无机表面以及脂膜之间的静电相互作用[37]。

半径R，硅珠尖被给定2.5微米，力F和校准的针尖的偏转的值和弹簧常数使用胡克定律计算。

σtip是硅珠表面电荷并已知为-7.1×

10-3C/m，Z是沿z轴针尖的运动，εε0和λ分别取为7.08335×

10-10和9.1×

10-8m。

由于脱乙酰壳多糖和藻酸盐包含相反电荷的官能团，以不同的比例将它们混合改变薄膜的表面电荷特征。

原子力显微镜（AFM）是用于确定表面电荷密度。

在pH值7.4和0.1毫米离子强度水条件下 

AFM直接测量壳聚糖/海藻酸钠膜和硅胶珠之间的力。

离子强度用加入的NaCl维持。

硅石珠是在含水条件下带负电荷的。

硅珠和薄膜之间的力是通过悬臂的偏转确定的。

在区域C中的数据被用于标准化所述偏转轴线的曲线（图3）， 

而B是含有表面电荷的偏转数据，A是包含数据表面压痕的数据。

区域C线性部分的平均偏转被确定并且用于标准化的力的曲线，如图所示，3A。

然后，线性拟合被用于偏转值，并且将这些值与实际数据点进行比较。

该识别到的线性区域被淘汰（图3C）和曲线进行标准化于z轴线（图3D）。

分析方程（方程

（2））用于拟合数据，以确定所述的表面电荷密度。

使用MATLAB程序进行所有这些步骤。

2.7力曲线的弹性模量的测定

弹性模量可以从力曲线的区域A确定。

对无限刚性的样品，悬臂的偏转是相同的z方向上的压电的移动。

然而，在柔软的样品上，压痕导致的偏转较小。

软样品上的压痕可通过减去坚硬的样品悬臂偏转在来确定。

由于胡克定律是连接的悬臂和通过悬臂的力常数k所施加的加载力的偏转，该加载力可以写成asF=kd。

通过绘制压痕与装载力，并与赫兹模式确定弹性模量。

一个半径R为的无限硬球（AFM针尖）触摸软平面表面的赫兹模型给出的加载力F和压痕δ之间的的关系如下：

其中E是杨氏模量，ν是软材料的泊松比。

2.8统计分析

使用GraphPadPrism软件LaJolla,California，Tukey多重比较检验之后进行单因素方差分析进行统计分析，如果P<

0.05显著则被认为有显著差异。

3.结果

3.1在壳聚糖海藻酸钠溶液中的PEC组分

PEC在壳聚糖海藻酸钠60，壳聚糖海藻酸钠80和壳聚糖海藻酸钠90的组分内容示于图4.PEC在壳聚糖海藻酸钠60，壳聚糖海藻酸钠80和壳聚糖海藻酸钠90中被发现的含量分别是69.2±

2.9％，29.8±

0.6％和18.2±

2.2％。

4个样本组分计算平均值。

4.壳聚糖/海藻酸钠薄膜上的PEC含量。

统计分析确定的平均值作为统计地显著（p<

0.01）。

3.2含水条件下的重量增加

由于生物材料需要体内水的条件,生物材料的溶胀行为是他们成功的一个重要标准。

通过在α-MEM（最低必需培养基）中浸泡长度和宽度大约0.5厘米壳聚糖海藻酸钠膜1小时如图5进行测定溶胀行并显示浸泡聚糖海藻酸钠膜1小时后，重量增加。

因为壳聚糖和藻酸盐是亲水性的，膜显著的吸收水。

在它们的初始重量上ChiAlgi60，ChiAlgi80和ChiAlgi90分别得到93.5±

6.6％，217.1±

22.1％和的396.8±

67.5％。

观察到重量增加的同时脱乙酰壳多糖浓度也增加。

用于该研究的样本数为4。

图5.壳聚糖/海藻酸钠薄膜的溶胀行为。

3.3ChiAlgi膜的机械性能

脱乙酰壳多糖/藻酸盐薄膜切割成尺寸10mm的长度和5mm宽的带材。

数字测径器测量的膜的厚度被认为是80微米。

机械试验是在张力和在生理条件下进行的。

弹性模量计算从应力-应变曲线的初始线性部分。

机械试验之前，薄膜浸泡在α-MEM培养基1小时。

ChiAlgi60，ChiAlgi80和ChiAlgi90的弹性模量被发现分别为2.6±

0.14兆帕，1.9±

0.27兆帕，0.93±

0.12兆帕（图6）。

5-6样品各组合物被用于测定弹性模量。

图6生理条件下壳聚糖/海藻酸钠样本的弹性模量。

在微观层面，ChiAlgi薄膜的机械性质进行了研究。

微压痕试验是用原子力显微镜（AFM）进行的。

数据的获得来自于每个薄膜式超过（32×

32平方微米）的用于计算弹性模量的表面区域。

AFM的力弯曲确定的弹性模量示于图7。

ChiAlgi60，ChiAlgi80和ChiAlgi907.的弹性模量被发现是5.4±

2.9千帕，6.57±

3.7千帕和68.1±

16.9千帕。

，从AFM实验计算的弹性模量结果显示的与宏观力学测试相比下降了两个数量级。

图7AFM力曲线确定潮湿条件下壳聚糖/海藻酸钠基于薄膜的弹性模量。

3.4ChiAlgi表面电荷分布

图8和图9分别显示ChiAlgi60和ChiAlgi80表面电荷密度分布。

ChiAlgi60和ChiAlgi80均显示表面负电荷密度。

ChiAlgi90没有表现出远距离的吸引力和排斥力。

力的表面电荷密度分析显示在所有样本中均有非均匀电荷分布。

ChiAlgi60和ChiAlgi80平均表面电荷密度分别是-0.46mC/m2和-0.32mC/m2。

图8.在潮湿条件下AFM曲线确定的ChiAlgi60的表面电荷密度分布。

统计分析测定的平均值作为统计地显著（p<

0.01），不计ChiAlgi60和ChiAlgi80膜（p<

0.05）。

图9.在潮湿条件下AFM曲线确定的ChiAlgi80的表面电荷密度分布。

3.5FTIR研究

为了进一步了解在体积的差异和表面所有ChiAlgi薄膜的机械性能，我们进行了傅里叶变换红外光谱（FTIR）中的传输衰减和传输反射（ATR）模式的实验。

FTIR在传输模式以提供大量的体积信息为主，而ATR提供表面信息。

图10和11示出了在传输和ATR模式的脱乙酰壳多糖，藻酸盐，ChiAlgi90，ChiAlgi80和ChiAlgi60的1250-900cm-1红外光谱。

1085cm-1位置的带起源于反对称伸缩的C-O-C糖苷键和1035cm-1位置的带源自C-O骨架震动的拉伸。

这两个键分别存在于藻酸盐和脱乙酰壳多糖，并具有红外活性。

但是，C-O伸缩带在藻酸盐更为突出，而由于C-O-C伸缩带在脱乙酰壳多糖更突出。

我们比较了在传输和ATR模式下，所有的薄膜的这两个波段的相对强度来研究在体积和表面组成的差异。

图10.分辨率为4cm-1情况下1200-900cm-1范围内传输模式下脱乙酰壳多糖，藻酸盐，ChiAlgi60，ChiAlgi80和ChiAlgi90傅里叶变换的红外光谱。

图图11.分辨率为4cm-1情况下1200-900cm-1范围内ART模式下脱乙酰壳多糖，藻酸盐，ChiAlgi60，ChiAlgi80和ChiAlgi90傅里叶变换的红外光谱。

4.讨论

基于聚电解质复合物的壳聚糖和海藻酸钠显示具有高潜力的组织工程和药物输送的应用。

机械性能和表面电荷特性都能影响其生物反应。

在这项工作中，我们研究了机械性能和脱乙酰壳多糖/藻酸盐类膜的表面电荷。

这是对这些生物材料的表面电荷测量的第一项研究。

机械试验是在37℃和pH7.4进行模拟生理条件下进行的。

结果表明：

随着脱乙酰壳多糖比例的增加弹性模量降低。

在该薄膜的弹性模量所观察到的趋势是由于PEC纤维的相对含量和吸收的液体决定的。

膜的总PEC组分与弹性模量的趋势相同。

因此，我们的结论是该纤维的PEC潜在是作为增强剂强化湿的条件下的膜。

MEM的吸收导致肿胀和会影响这些薄膜的力学响应。

由于具有较高的PEC含量的样品将包含低级游离氨基与水分子相互作用，他们预计吸收较少量水，如图4所证实的结果。

膜的表面的弹性模量是用原子力显微镜力显微镜来确定。

从AFM实验确定的弹性模量表现出与体积弹性模量相比低两个数量级较低。

我们推测，在弹性模量下降的出现是由于在体积和薄膜表面的化学成分的差异。

研究体积和表面之间的成分差别，我们在传输和ATR模式进行FTIR。

在FTIR，透射谱主要是提供大量的体积信息，而ATR谱主要提供表面信息。

由图10和11比较FTIR光谱，我们观察到C-O条带在ATR谱（图11）出现，这表明在高浓度的海藻酸钠中表面比体积更加突出。

随着脱乙酰壳多糖比例的增加此带的强度减少。

表面高的藻酸盐的存在会导致表面比体积更多的水吸收，因此与体积相比比具有更低的弹性模量相比。

表面更高的海藻酸钠的存在也与AFM表面电荷测量的研究结果一致。

原子力显微镜研究展现了ChiAlgi60和ChiAlgi80负电荷的表面和负电荷的表面中性表面。

这些样品的表面由于存在于藻酸钠羧酸基团的存在展现出负电荷密度。

这些羧酸基团在水性条件下离解这有助于负电荷聚合成物;

脱乙酰壳多糖含有氨基基团并且这些基团的质子化产生正电荷，在溶液中的聚合成物。

当脱乙酰壳多糖和藻酸盐混合在一起在溶液中，由于它们的电荷的互补性质，它们自发地结合在一起，形成PEC。

聚合物混合物的最终电荷是由未反应的官能团的质子化/去质子化决定的。

聚合物的质子化或去质子化量取决于其pKa或pKb值的值。

脱乙酰壳多糖的pKb值范围从4.0到6.0[38]，所以在pH7.4脱乙酰壳多糖的氨基没有质子化。

另一方面，的pKa为藻酸钠范围为3.38至3.65[39]，所以在pH7.4藻酸盐的羧基高度去质子。

所以，在pH7.4，相比于脱乙酰壳多糖导致在表面电荷中性，甚至在含有90％脱乙酰壳多糖膜表面电荷也中性，藻酸盐被高度电离。

5.结论

在这项工作中，我们通过改变壳聚糖/藻酸盐类的比例研究了壳聚糖/藻酸盐类膜的表面电荷的变化和机械性能。

拉力和生理条件下的机械试验，显示出与增加脱乙酰壳多糖的浓度在弹性模量的降低。

我们观察到的增加的水吸收，并降低在PEC含量与降低弹性模量。

影片的弹性模量也由AFM力曲线确定。

拉力和生理条件下的机械试验，显示随着脱乙酰壳多糖的浓度的增加弹性模量的降低。

我们观察到的水吸收的增加，并降低了PEC含量和弹性模量。

薄膜的弹性模量也由AFM力曲线确定。

我们观察到与宏观力学实验相比弹性模量下降两个数量级。

表面电荷密度使用AFM力曲线的分析模型来确定。

ChiAlgi60和ChiAlgi80的表面电荷密度，发现分别是-0.46mC/m2和-0.32mC/m2。

ChimAlgi90没有表现出长程静电相互作用。

傅立叶变换红外光谱实验表明表面比体积内含有更高的藻酸盐。

表面更高的藻酸盐的存在有望引起与体积相比表面更高的溶胀，因此引起了弹性模量的下降。

FTIR结果也与AFM表面电荷测量一致。

致谢

本项研究是由新泽西委员的脊髓研究所（批准号：

08-3080-SCR-E-0）支持。

建议，我们的实验室成员包括刘若英宫博士，米歇尔L.Previtera博士和乌代Chippada博士的方案，讨论和建议都非常有帮助，在此也一并感谢。

我们还要感谢罗格斯大学化学系基因中心的博士在FTIR实验援助。