蚌埠学院酪氨酸酶的提取Word下载.docx
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为最大吸收波长吸光度的变化，
T:
为时间（min），
K:
为多巴红的摩尔吸收系数，
V:
为加入酶的体积，
进而计算出原料（土豆）中酶的活性：
。
A:
为原料中酶的活性（注意此处A不是吸光度A），
V0:
为原料所得的酶溶液的总体积，
m:
为原料总质量。
二、实验目的
1、认识生物体中酶的存在和催化作用，了解生物体系中酶促反应的特点与有机合成的不同和相同之处，认识一些生物化学过程的特殊性。
2、掌握生物活性物质的提取和保存方法，学会使用仪器分析的手段研究催化反应，特别是生物化学体系中催化过程的基本思路和方法。
三、仪器和试剂
1、仪器：
分光光度计（含比色皿）、离心机、天平、豆浆机、容量瓶、秒表、烧杯、胶头滴管、玻璃棒。
2、试剂：
酪氨酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠、盐酸、新鲜苹果（或土豆）、去离子水。
四、实验步骤
1、溶液配制
1.1酪氨酸溶液的配制
酪氨酸在中性水溶液中溶解度较小，因而配制过程中需加入一定量盐酸溶解。
首先称取一定量的酪氨酸配制0.1mol/L酪氨酸储备液，在实验过程中稀释至0.02mol/L，使用时需要加入一定量的NaOH调节其pH接近中性。
1.2缓冲溶液的配置
0.2mol/LKH2PO4：
称取2.7219gKH2PO4,去离子水溶解，转移至100ml容量瓶中，定容，摇匀，既可；
0.2mol/LNaOH：
称取0.8009gNaOH，去离子水溶解，转移至100ml容量瓶中，定容，摇匀，既可。
以一定的体积比配置pH=6.0和pH=7.2的KH2PO4-NaOH缓冲溶液。
体积比如下表：
表1.1KH2PO4-NaOH缓冲溶液的体积比
pH
KH2PO4与NaOH的体积比
6.0
5∶0.570
7.2
5:
3.500
2、酶的提取
取新鲜苹果，清洁后切碎，称取20.0g置于豆浆机中，加入7.5mLpH=7.2的磷酸缓冲溶液，打开电源，收集滤出提取液，立即高心分离5min，倾出上层清液保存于冰箱中，提取液为棕色，在放置过程中不断变黑。
3、酪氨酸最大吸收波长确定
取2.5mL酶提取液用pH=7.2的缓冲溶液稀释至10mL比色管中，摇匀。
取0.4mL已稀释过的土豆提取液，加2.6mLpH=6.0的缓冲溶液，加入2.0mL酪氨酸溶液，摇匀。
反应约数分钟后，于分光光度计上扫描绘制酪氨酸的吸收光谱图。
表1.2最大吸收波长的确定
波长（nm）
430
440
450
460
470
480
485
490
500
510
520
吸光度
0.460
0.496
0.530
0.540
0.560
0.575
0.585
0.576
0.569
0.551
0.515
吸收光谱的绘制如下：
图1.1酪氨酸吸收光谱的绘制
由图1.1可知酪氨酸的最大吸收波长为485nm。
4、酶活性测量
分别取0.4mL稀释过的提取液于10mL比色管中，加入5.0mLpH=6.0的缓冲溶液，再加入4.0mL酪氨酸溶液，同时开始计时，用分光光度计在450nm处测定吸光度。
开始6min内每分钟读一个数，以后隔2min读一个数，直至吸光度变化不大为止。
以吸光度对时间作图，从直线斜率求出酶的活性。
表1.3酶活性随时间的变化测试
时间/min
1
2
3
4
5
6
7
0.146
0.154
0.156
0.159
0.164
0.166
0.17
8
10
12
14
16
18
20
0.172
0.18
0.186
0.191
0.198
0.205
0.206
22
24
26
28
30
32
34
0.204
5、酶活性因素测量
影响酶的活性的因素研究
（1）酸度条件试验：
取0.40mL稀释过的提取液，调节溶液至不同的pH值，考察pH对催化活性的影响。
（2）抑制剂的影响：
取0.40mL稀释过的提取液，加硫代硫酸钠、或EDTA或铜试剂等试剂，考察各试剂对催化活性的抑制作用。
同时同批作一个未加抑制剂的作为对照试验。
（3）温度条件试验：
取0.40mL稀释过的提取液在不同的温度条件下进行操作，考察温度对催化活性的影响。
（4）酶浓度的影响：
分别取不同含量（0.2、0.3、0.4、0.5和0.6ml）的提取液，测试不同酶含量对酶催化的影响。
（5）底物含量的影响：
分别取不同含量（1.0、1.5、2.0、2.5和3.0ml）的L-络氨酸体积，测试不同酶含量对酶催化的影响。
五、数据记录及结果讨论
1、绘制酶加入量的动力学曲线：
以吸光度为纵坐标，时间为横坐标，可得出在加入酶的作用下，酪氨酸转换的动力学过程，再由直线部分得出转换速率，即可计算酶的活性。
图1.2酶活性的测量
由直线斜率求出酶的活性：
提取液酶活性（α/（min•mL））
原料酶活性（A/（min•g））
3.33×
108
2、影响酶的活性的因素研究：
3.0
8.2
吸光度A
0.343
0.473
0.539
0.525
图1.3pH值对酶活性的影响
由图1.3可知，在pH=2或10时，溶液吸光值基本不变，这说明酶在此环境下已经失去活性，而丧失其催化效果。
（2）抑制剂EDTA对酶活性的影响：
取0.40mL稀释过的提取液，加EDTA试剂，考察各试剂对催化活性的抑制作用。
EDTA体积/ml
1.00
2.00
3.00
0.427
0.397
0.423
0.432
图1.4EDTA对酶活性影响
由图1.4可知，当加入EDTA后，吸光度明显下降；
当EDTA的浓度体积大于1ml时，吸光度有逐渐上升。
（3）温度对酶活性的影响：
温度（T/℃）
40
50
60
0.346
0.260
0.227
图1.5温度对酶活性的影响
由图1.5可知，温度不同时，酶的反应活性也不同，说明酶参与反应时有一个最适当温度。
（4）酶浓度对酶活性的影响：
提取液体积/ml
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.196
0.267
0.402
0.606
0.609
图1.6酶含量对没催化效果的影响
由1.6可知，当溶液中酶的含量增加时，曲线斜率也增加，这表明酶浓度高，其反应活性也高；
但当酶含量增加到一定程度，即过量时，吸光度不随提取液体积变化，说明底物在前一阶段是过量的。
（5）底物含量对酶活性的影响：
L-络氨酸体积/ml
1.0
1.5
2.0
2.5
0.339
0.358
0.458
0.596
0.615
图1.7底物含量对酶催化效果的影响
由图可知，当底物的量较少时，吸光度较小，说明由络氨酸转变为的多巴红的量不多；
随着底物的增加，吸光度增加，产生的多巴红增加，并且增加速度放缓。
六、思考题
1、影响酶活性的因素有哪些？
答：
酶是一种活性蛋白质。
因此，一切对蛋白质活性有影响的因素都影响酶的活性。
酶与底物作用的活性，受温度、pH值、酶液浓度、底物浓度、酶的激活剂或抑制剂等许多因素的影响。
2、提取物在放置过程中为何会变黑？
它们的组织中都含有酪氨酸和酪氨酸酶，酶存在于物质内部，当内部物质暴露于空气中，在氧的参与下将发生反应，生成黑色素。
3、热处理后酶的活性为何会显著降低？
酶的催化作用，只有在一定温度下才能表现出来。
酶的作用速度与温度的关系为：
当酶蛋白没有因受热而变性时，温度每升高10℃，反应速度增加一倍左右。
通常酶的作用速度随温度升高而加速，但温度升高到一定限度后，酶的活性就要钝化，直至完全失活。
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