常见生物相容性实验汇总.docx
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常见生物相容性实验汇总
细胞复苏
材料准备：
培养基、培养皿、70%酒精、一次性吸管、FBS、15ml&50ml离心管
实验步骤：
1.先将培养基配好并复温，在15ml离心管中加入5ml培养基；准备37℃的水
浴，取出冻存管后立即置于水浴中融化，确保细胞全部浸入液面，快速摇动，
1min内使管内的细胞融化，注意不要让水没过管口，液氮会从口子喷出，小
心。
2.把培养基融化后的管子用75%酒精擦拭消毒后，放入安全柜内操作。
3.小心打开冻存管，将细胞悬液转移到有培养基的15ml离心管中。
4.1200rpm离心3min，弃上清，加入6ml含10%FBS的完全培养基，转移至新
培养瓶（小瓶6ml培养基，大瓶10ml培养基）中，做好标记（细胞类型、
传代数、培养基、复苏时间、复苏人），置于CO2培养箱中37℃培养，培养
24h后视情况换液。
5.复苏后细胞生长状况正常后，进行常规培养，最好在第二次传代后冻存若干
管细胞，不可只取不存，在第三次传代后可用于细胞实验。
TIPS：
a.解冻细胞必须迅速，防止细胞低温损伤，慢冻速融。
b.细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。
细胞传代（TE消化法）
实验前准备事项：
1.预热培养用液：
把已经配制好的装有培养基、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入
37℃水浴锅内预热（可以省去）。
2.用75％酒精擦拭双手，生物安全柜经过紫外线照射超过30min，实验前通风
至少开启15分钟让空气循环起来，橱内不要使用火焰灯，它们会影响橱内
空气的流动方式。
3.实验前把可能用到的试剂、吸管及离心管等全部拿到厨内，并正确摆放使用的器械，保证足够的操作空间，不仅便于操作而且可减少污染。
材料准备：
TE消化液、FBS、对应培养基、50ml离心管若干、15ml离心管若干、一次
性吸管若干、培养皿等
实验步骤：
1.观察细胞生长状况后，取出实验所需物品，可在50ml离心管中配制40ml培
养基（4mlFBS+36ml-MEM）待用。
2.用一次性吸管从细胞单层吸出培养基，缓慢加入PBS或者不含血清的培养基
没过细胞，摇晃洗涤培养皿1~2次。
3.再吸出PBS或培养基，吸的越干净越好，6cm（10cm）培养皿中加入600l
（800l）TE（胰蛋白酶），以刚刚没过细胞为宜。
（视细胞种类也可不洗涤
直接加入TE消化液）
4.稍加摇匀，使TE消化液均匀覆盖皿内所有细胞，置37℃条件下温育1~3分
钟。
消化程度以用肉眼观察当培养皿晃动时飘起单层细胞为准，可在显微镜
下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞之间不再连接成片，表明此时细胞消化适度，视细胞不同而调节。
5.消化适度后，加入适量培养基2~3ml于培养皿中终止消化，沿四个方向吹洗
培养皿，确保细胞均从板上消化下来，最后全部转移到15ml离心管中。
6.用吸管将已经消化的细胞轻轻吹打成细胞悬液。
精确配平后放入台式离心机
内1200rpm离心3分钟。
7.弃上清液，加入适量PBS，重悬后1200rpm离心3分钟。
8.弃上清液，先加入2~3ml含10%血清的培养基于15ml离心管中，将适量细
胞重悬液转移至含有培养基的6cm培养皿中进行培养，做好标记（细胞类型、
传代数PxNy、培养基D-L-5、传代时间、传代比例1:
5；操作人），置于CO2
培养箱中37℃培养，清理操作台，处理垃圾，记录笔记。
TIPS：
a.消化适度：
消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸
多因素的影响，消化过程中应该注意培养细胞形态的变化，一旦胞质回缩，
连接变松散，或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。
b.胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散，细胞从平板上脱
落可以用枪头吹打实现，但必须观察到细胞间已经分离。
不同的组织或者细
胞对胰酶的作用反应不一样。
胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用
时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强，针对
不同细胞，建议初次消化时均在显微镜下观察细胞形态以确定消化程度。
使
用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。
因
Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质可降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用
不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：
D-Hanks液。
EDTA可以螯合2价金属离子，
故常用TE溶液。
终止消化时，可用含有血清培养基或者胰酶抑制剂终止胰
酶对细胞的作用，利用培养基稀释也可以达到一定效果。
c.每次传代可以按1:
3~1:
10等比例进行，以ATCC数据建议和实际生长状况考
虑，请协商好细胞需要立即使用还是长期培养，合理保持培养箱中不同细胞
的平板数量。
d.用一次性吸管吹匀细胞时，切勿产生大量气泡，在气泡破裂时产生的剪接力
对活细胞有致命威胁。
建议吸管在吸取液体前尽量排空气体，缓慢松手以吸
取更多液体，继而以合适的力度吹匀细胞。
细胞冻存
材料准备：
TE消化液、FBS、对应培养基、50ml离心管若干、15ml离心管若干、一次
性吸管若干、专用冻存塑料管（1ml）等
实验步骤：
1、将细胞冻存液（10%DMSO+90%FBS）配好并放置冰箱预冷；
2、当10cm培养皿中的RBMSC细胞汇合到80%-90%时，用胰蛋白酶将细胞消
化下来，1200rpm离心，去上清；
3、加入PBS重悬细胞，以洗去残留的胰蛋白酶，1200rpm离心，去上清；
4、加入1ml细胞冻存液重悬后，将细胞重悬液放入冻存管中，冻存管必须将盖
子盖紧，防止液氮侵入，并做好标记（细胞类型、培养代数、培养基、冻存时间、
冻存人、编号）。
按下列顺序梯度降温：
室温→4℃（10~20min）→冰箱冷冻室-20℃
（0.5~1.5h）→低温冰箱-80℃（过夜）→液氮罐-196℃（长期）（冰上转移）。
5、整理，做好冻存记录，在自己的笔记本和冻存记录本上均要记录（细胞信息、
具体冻存位置、管数等）。
TIPS：
a.欲冷冻保存之细胞应在生长良好（logphase）且存活率高之状态，约为80-90%
致密度。
b.细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存
细胞活力。
目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质能
提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减
少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。
复苏细胞应
采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避
免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。
c.从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为
对数生长期细胞。
d.DMSO稀释时会放出大量热能，为了防止局部DMSO浓度过高，请滴加培
养基并且不时摇晃，当然，最佳的是配制好冻存培养基，加入离心管中对细
胞沉淀小心吹打制悬。
e.梯度降温转移细胞时注意放置冰盒上，避免敏感温度变化。
不宜将冻存细胞
放置在0℃～-60℃这一温度范围内过久，低温损伤主要发生在这一温度区内，
是“危险温区”。
f.注意定期检查液氮罐内液氮量，及时添加。
g.专用冻存塑料管，带有螺旋的平底塑料盖，并且可以耐受低温，注意冻存时
拧紧。
细胞计数
材料准备：
細胞計數器、Eppendorf管等实验步骤：
1.制备细胞悬液，可稀释数倍以使每小格的细胞数可数。
2.取洁净的细胞计数板一块，在计数区上盖上一块盖玻片。
3.将悬液摇匀，用移液器吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片
的下边缘滴入一小滴（不宜过多），让悬液利用液体的表面张力充满计数区，
勿使气泡产生，不要使计数区两边平台沾上悬液，以免加盖盖玻片后，造成
计数区深度的升高，可用吸水纸吸去沟槽中流出的多余悬液。
4.静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。
将细胞计数板放置于
显微镜的载物台上，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。
由于生活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。
5.细胞计数时，计数区是由4个16格小方格组成，按对角线方位，数左上、
左下、右上、右下的4个大方格（A、B、C、D）的细胞数，数完计4个大方
格读数的平均数。
为了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记，在计数时，
对沉降在格线上的细胞的统计应有统一的规定。
如细胞位于大方格的粗线上，
计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。
6.测数完毕，取下盖玻片，喷酒精将细胞计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或
抹擦，以免损坏网格刻度。
洗净后自行晾干、滤纸吸干或用吹风机吹干，放
入盒内保存
7.细胞计数板-计数公式：
计算公式：
细胞数/ml=16小格内细胞总数×104×稀释倍数
1mm
1mm
1mm
细网格线0.006mm
粗网格线
0.014mm
SD幼鼠骨髓间充质干细胞提取
1.准备好已灭菌的手术器械和需要用到的离心管、培养皿等器材，于
紫外照射30min灭菌。
2.先将培养基配好，并在培养皿中加入PBS和10%FBSMedium。
3.将出生7-8天的SD幼鼠处死，喷酒精后放入超净台的培养皿中。
4.左手拿镊子将SD幼鼠后腿脚掌夹起，右手持剪刀沿着SD幼鼠后腿
将皮剪开，且将皮剪至股骨部分，要将皮剪开点，以免沾到毛发。
找到股骨与身体相连的关节处剪断，取出后腿，并将脚掌与胫骨相
连位置的皮剪掉，去除脚掌，余下部分放置于装有PBS的培养皿中。
5.重新取新一套镊子与剪刀，用镊子将腿夹起，在胫骨与股骨关节相
连处用剪刀剪断，得到分离的胫骨与股骨。
6.左手用镊子将胫骨节气，右手持剪刀对骨头进行剔肉，尽量将骨头
上的肉剔干净后，剪断胫骨两端的关节，使胫骨两端相通后放入装
有10%FBSMedium的培养皿中，股骨处理与胫骨相同。
7.用1ml注射器插入到骨髓腔中，并不断用medium进行吹打，直至
腔体发白为止，再用1ml枪头吹打培养皿中的细胞，以免细胞成团。
8.用细胞滤网对培养皿中的细胞悬液进行过滤，去除液体中的组织和
肉末，将滤液放入10cm培养皿中培养过夜。
9.第二天，去除上清液，PBS清洗两次（要沿壁加PBS，以免将贴壁
不牢固的细胞吹起），再加入10%FBSMedium培养。
（由于刚提取
的细胞中含有多种杂质，刚提取的细胞经过过夜培养后，细胞上清
液浑浊属于正常现象，在提取后的两天内，细胞要每天换液，且换
液时候加PBS和10%FBSMedium时候必须缓慢沿壁加入，以免将
细胞吹起。
）
10.2天换液一次，等到细胞长满之后，对细胞进行传代，传至第三代即
可进行冻存和做实验用。
CCK-8
实验目的：
考察合金改性前后对对细胞毒性的变化
细胞：
小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1，大鼠骨髓间充质干细胞RBMSC
实验原理：
在电子耦合试剂存在的情况下，可以被活细胞线粒体内的琥珀酸
脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan）。
细胞增殖越多越
快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。
对于同样的细胞，颜色的深浅和
细胞数目呈线性关系。
颜色的深浅与细胞的增殖成正比，与细胞毒性成反比。
使
用酶标仪在450nm波长处测定OD值，间接反映活细胞数量。
保存条件：
4℃干燥避光保存，有效期一年（推荐）。
-20℃干燥避光保存，
有效期二年。
直接在材料上种细胞的CCK8实验方案
1.准备一个小烧杯，将材料放置于烧杯中，材料正面向上，尽量避免碰到尖锐
物，用75%的乙醇灭菌10min，将材料转移至24孔板中，用PBS清洗两次，
尽量减少清洗时间，再用培养基清洗一遍，加入800l培养基使材料浸没在
培养基中。
（若材料为钛合金，可把75%灭菌后的材料放置于超净台，再用紫
外照射一段时间后，将材料放置于24孔板中，用PBS清洗后，再用培养基
进行清洗。
）
2.取70%-80%对数生长期细胞，胰酶消化后，用PBS洗涤，用含10%胎牛血
清-MEM培养液配成单个细胞悬液，计数，在材料上种细胞，密度为3*104/
孔（可根据材料调整细胞密度），使细胞悬液均匀的铺满整个材料表面（先加
入800l培养基（含血清），观察是否浸没了样品，若不够再加一些。
若有
气泡，戳破。
再以转圈的方式加入200l细胞重悬液至材料表面，轻微震荡），
5%CO2培养箱中培养使细胞贴壁。
每个材料4个复孔。
（若材料为钛合金，
则可将细胞悬液配成配制浓度为2×104个/mL的细胞悬液，分别注入已置入
材料的无菌24孔板，每孔500μL。
48孔板，每孔300l。
）
3.由于镁合金与CCK8会产生假阳性结果，所以在检测吸光度的时候，需要将
细胞消化后再与CCK8进行孵育：
待细胞贴壁后，吸去培养基，加入新鲜培
养基继续分别培养1,3,7天（每天需更换新鲜培养基），弃培养基，PBS洗2
次（PBS需吸干），清洗后，将材料转移至别的空白孔中，每孔加入200l胰
酶消化1-2min后，在显微镜下观察control组的细胞是否消化下来，如没有
消化下来，用枪吹打至细胞完全消化后，每孔加入500l10%胎牛血清-MEM
培养液终止消化，1200rpm离心5min，弃上清，加入400l10%CCK8的不
含血清的培养基（10%CCK8溶液须提前配置好），避光培养4h，终止培养，
于酶标仪450nm波长测定其吸光度。
（其他材料：
待细胞贴壁后，吸去培养
基，加入新鲜培养基继续分别培养1,3,7天，弃培养基，PBS洗2次（PBS需
吸干），清洗后，将材料转移至别的空白孔中，每孔加入400l10%CCK8的不
含血清的培养基（10%CCK8溶液须提前配置好），避光培养4h，终止培养，
于酶标仪450nm和650nm波长测定其吸光度。
）
4.实验对照组：
种3*104/孔细胞于24孔板中，加入培养基分别孵育1,3,7天后，
弃培养基，PBS洗2-3次（PBS需吸干），每孔加入与实验组相同体积的
10%CCK8溶液，避光培养4h，测定450nm的吸光度。
（若为镁合金的control
组，则应将control组中的细胞消化下来，再与CCK8进行孵育。
）
5.空白对照：
在空白孔中加入与实验组相同体积的10%CCK8溶液，避光培养
4h，测定450nm的吸光度即为空白对照。
备注：
①一个方块材料为1cm2，一块材料消耗1ml培养基
②在材料上培养细胞时，需每天进行换液，防止镁合金腐蚀对细胞造成影
响。
③当在培养箱内培养时，培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发，由于体积
不准确而增加误差。
一般情况下，最外一圈的孔只加培养基，不作为测定
孔用。
④特别重要的是，在加入CCK8之前，必须把材料转移至其他空白孔中，
以免贴壁在材料外的细胞造成的实验误差。
材料浸提液CCK8的实验方案
1、对材料先进行封胶处理，封胶时底面只弄一次，尽量平整、薄。
封胶完毕后，
在干燥箱中存放3天，多余的胶用手术刀切掉，尽量使底部保持平整。
在用于浸
泡之前，用2000#砂纸对WE43再次进行打磨，以去除表面的氧化膜。
2、准备一个小烧杯，在烧杯中灭菌，材料正面向上，尽量避免碰到尖锐物。
将
材料于75%的乙醇中灭菌10min，再用PBS清洗3次，转移至24孔板中，加入
培养基后在桌面来回动10-20s。
2
3、材料与a-MEM+双抗培养基在5%CO2，37℃条件下孵育3天（1ml/cm）。
4、提取上层液在4℃中保存，使用前用0.22m的滤头过滤除菌（加过双抗可不
灭菌），离心去上清液（液体有挥发就补齐），4℃保存，材料回收。
5、细胞用-MEM培养基+10%FBS+100U/ml双抗培养。
6、取70%-80%对数生长期细胞，胰酶消化后，用PBS洗涤，用含10%胎牛血
清-MEM培养液配成单个细胞悬液，计数，在96孔板上种细胞，密度为5*103/
孔，5%CO2培养箱中培养24h使细胞贴壁。
6.24h后吸去培养基，每孔加入材料提取液90l+10lFBS（10%）。
进一步稀释
成50%，25%，10%的提取溶液，以加入90l培养基和10lFBS位对照组，每
一样品设5个复孔。
7.37℃培养1,3,7天，弃提取液，PBS洗2-3次，每孔加入100l不含血清的
10%CCK8培养4h，终止培养，于酶标仪450nm波长测定其吸光度。
8.空白对照：
在空白孔中加入与实验组相同体积的10%CCK8溶液，避光培养4h，
测定450nm的吸光度即为空白对照。
9.按细胞增值度法计算细胞相对增值率（Relativegrowthrate，RGR），并按表1
的要求，将RGR值转化成六级，评定材料毒性。
RGR（%）=（材料组吸光度-空白组吸光度）/（对照组吸光度-空白组吸光度）×100%
表1分级标准和评定结果
0级
1级
2级
3级
4级
5级
RGR（%）
≧100
75-99
50-74
25-49
1-24
0
评定结
合格
合格
结合细胞
不合
不合格
不合格
果
形态综合
格
评价
注意事项：
由于使用96孔板进行检测，如果细胞培养时间较长，一定要注意蒸发问题。
一
方面，由于96孔板周围一圈最容易蒸发，可以采取弃用周围一圈的办法，改加
相同量的PBS、水或培养液；另一方面，可以把96孔板置于靠近培养箱内水源
（例如一些抗氧化剂）会干
用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。
细胞CCK8实验结果参照下图：
如图所示，相同浓度浸提液与细胞共培养1天和3天后，100%WE43浸提
60%和40%左右，而钕元素等离子
WE43100%浸提液与细胞共培养1天和3天后，细胞存活率分别为90%和
100%左右，且在低浓度情况下钕元素等离子注入WE43能够促进细胞增殖，表
WE43具有良好的生物相容性。
Improvementofcorrosionresistanceandbiocompatibilityofrare-earthWE43
magnesiumalloybyneodymiumself-ionimplantation,CorrosionScience94（2015）142–155.
细胞骨架和DAPI染色（细胞粘附测试）
定义：
细胞骨架是由蛋白质丝搭建起的骨架网络结构,主要包括微管，微丝，中
间纤维。
它们对细胞形态的维持，细胞的生长、运动、分裂、分化、物质运输、
能量转换、信息传递、基因表达等都起到重要作用。
实验目的：
比较材料表面改性前后早期细胞直接粘附的状态
细胞：
小鼠胚胎成骨细胞MC3T3-E1
原理：
利用抗原-抗体反应原理，就是以一抗作为探针，它与目的蛋白作用并连
接，再用带有荧光（或同位素）标记的二抗与一抗作用，最后显色，发光位置就
有目的蛋白。
罗丹明荧光物质标记的鬼笔环肽可特异的与真核细胞的F-actin结
合，从而显示微丝骨架在细胞中的分布。
DAPI为一种荧光染料，可以穿透细胞
膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，在荧光显微镜下可以看到到
细胞核的形态变化，固定过和没有固定过的活细胞均可用DAPI染色。
实验方案：
1.准备一个小烧杯，将材料浸没在装有乙醇的小烧杯中灭菌10-15min。
将材料
放置24孔板中用PBS震荡洗两次，培养基洗一次。
材料放置孔板中部。
2.细胞以5*104/孔接种，使细胞悬液均匀的铺满整个材料表面，孵育5h。
（先
加入800l培养基（含血清），观察是否浸没了样品，若不够再加一些。
若有
气泡，戳破。
再加入200l细胞重悬液至材料表面，轻微震荡。
）（若材料为
钛合金，则可将细胞悬液配成配制浓度为2×104个/mL的细胞悬液，分别注
入已置入材料的无菌24孔板。
）
3.细胞孵育5h后，弃去培养液，用PBS震荡清洗两次（24h时间点：
加入新鲜
培养基继续培养24h后，弃上清，用PBS振荡清洗两次），3.7%甲醛（PBS
中）在室温下固定5min，吸出固定液，PBS清洗2次。
4.加入0.1%（体积比）TritonX-100（PBS中）破膜5-8min，弃去TritonX-100
上清液，PBS洗3次。
5.在暗室中，取5l6.6M罗丹明标记的鬼笔环肽用PBS稀释至200l（终浓度
为165nM，加入鬼笔环肽（覆盖即可，用完可以回收利用），室温避光孵育
40min，吸出染液，用PBS清洗洗3次。
6.加入DAPI溶液室温下染色3-5min，弃去染液，用PBS洗3次，加入PBS，
荧光显微镜观察，并拍照记录。
省染料的做法：
取封口膜一块，滴加染料在封口膜上，倒扣材料，使细胞直
接接触染料染色，注意过程中染料不能干。
正置荧光显微镜观察法：
取干净载玻片，将材料放在载玻片上（事先泡在PBS
中，取出时用吸水纸轻轻拭干，有细胞的表面朝上放置）。
打开显微镜，荧光，
电脑。
先在显微镜以（X100）即（10倍物镜）观察整体情况。
荧光：
1通道：
DAPI，2通道：
FITC，3通道：
罗丹明
观察：
1.细胞骨架形态是否发生变化
2.肌动微丝是否出现增粗
3.细胞间连接是否增多
4.细胞形态：
多角形变成梭形，伪足明显增多
注意：
DAPI和鬼笔环肽具有剧毒性，在使用的时候应尽量小心，一定要带手套
操作，避免将染料弄到皮肤上。
细胞骨架和DAPI荧光染色图片结果如下图：
如上图所示，在1h的时候，纯钛上的细胞基本上呈现球形状态没有铺展，而其
他三种实验组，细胞有部分铺展在材料表面，且存在有丝分裂期的细胞。
同时，
在4h的时候，与纯钛相比，其他三种实验组均能够明显看到材料表面上的细胞
明显铺展，且在Zn/Ag-PIII材料表面上细胞的微丝更明显，说明Zn/Ag-PIII材料
表面更适合细胞生长。
细胞在四种材料上培养24h后，均能发现细胞上的微丝结
构，且细胞与细胞
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