整理凝胶层析法测定蛋白质分子质量Word格式文档下载.docx
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三、实验仪器和实验试剂
（一）器材
1.玻璃层析柱。
2.HL-1型恒流泵。
3.BSE-100型自动部分收集器。
4.8823B紫外检测仪。
5.SPECORD-200紫外分光光度计。
6.TYPE3057PortableRecorder记录仪。
7.100ml试剂瓶。
8.50ml、100ml量筒各一个。
9.50ml、100ml、250ml、500ml烧杯各一个。
10.10ml刻度试管。
11.胶头滴管。
12.玻璃棒。
（二）试剂
1.标准蛋白
（1）牛血清白蛋白：
Mr=67000（上海生化所）
（2）鸡卵清清蛋白：
Mr=45000（美国SIGMA公司）
（3）胰凝乳蛋白酶原A：
Mr=24000
（4）溶菌酶：
Mr=14300
2.未知蛋白样品（由实验室制备）
3.洗脱液0.025mol/LKCL-0.1mol/LHAC
4.蓝色葡聚糖-2000
四、实验操作和具体过程
（一）凝胶的溶胀
称取7gSephadexG-75于250ml烧杯中加入洗脱液100ml，置于室温溶胀2~3天，反复倾泻去掉细颗粒，然后减压抽气去处凝胶孔隙中的空气，沸水浴中煮沸2~3小时（可去处颗粒内部的空气以及灭菌）。
（二）装柱
1.取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。
2.凝胶柱总体积（Vt）的测定：
在距离柱上端5cm处作一个记号，关闭柱出水口，加入去离子水，打开出水口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接受柱中去离子水（水面降至层析柱玻璃筛板），读出的体积即为柱床总体积Vt。
也可以最后走完未知蛋白后再测定Vt。
3.在柱中加入洗脱液（约1/3柱床高度），将凝胶浓浆缓慢倾入柱中，待凝胶沉积约1cm~2cm高度后打开出水口，流速一般用5~6ml/10min。
胶面上升到柱记号处则装柱完毕，注意装柱过程中凝胶不能分层。
然后关闭出水口，静置片刻，待凝胶完全沉降，则接上恒流泵，用1~2倍柱床体积的洗脱液平衡柱子，使柱床稳定。
（三）V0和未知蛋白Ve的测定
按实验要求安装和连接好各种仪器。
把记录仪的记录时间调节到2cm/h，调节恒流泵的速度为5~6ml/10min，紫外检测仪置于0.5A档。
检查无误后再开始下一步操作。
吸去柱上端的洗脱液（切不可搅乱胶面，可覆盖一张滤纸或尼龙网）。
打开出水口，使残余液体降至与胶面相切（但不要干胶），关闭出水口。
用细滴管吸取0.5ml（5mg/ml）蓝色葡聚糖-2000和未知蛋白（8mg/ml）的混合液，小心地绕柱壁一圈（距离胶面2mm）缓慢加入，然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，打开出水口（开始收集！
），待溶液渗入胶床后，关闭出水口，用少许洗脱液加入柱中，渗入胶床后，柱上端再用洗脱液充满后用5~6ml/10min的速度开始洗脱，自动收集器收集时间为5min每管。
最后作出洗脱曲线。
收集并量出从加样开始至洗脱液中蓝色葡聚糖浓度最高点的洗脱液体积即为V0。
继续收集洗脱液，直至未知蛋白洗出，以洗脱液作空白参比，紫外分光光度计280nm处比色，测出最大吸收峰。
注意：
蓝色葡聚糖和未知蛋白洗下来之后，还要用洗脱液（1~2倍床体积）继续平衡一段时间，以备下步实验使用。
（四）标准曲线的制作
1.用洗脱液配制标准蛋白溶液供全班使用，溶液中三种蛋白的浓度各为：
牛血清清蛋白（5mg/ml）、鸡卵清清蛋白（8mg/ml）、胰凝乳蛋白酶原（5mg/ml）、溶菌酶蛋白（5mg/ml）。
2.在装样前应该测定此时的柱床体积，因为该体积可能和上次不同，如果有变化则应在之后的计算中进行修正。
3.按（三）的操作方法加入上述标准蛋白溶液0.5ml，以5~6ml/10min的速度洗脱并收集洗脱液。
注意控制每管的流速为1.5~1.8ml/3min/管。
此时把紫外检测仪置于0.2A档。
4.用紫外分光光度计逐管测定A280，并确定各种蛋白的洗脱峰最高点，然后量出各种蛋白的洗脱体积Ve。
5.以A280为纵坐标，Ve为横坐标画出标准蛋白的洗脱曲线。
6.以Kav为纵坐标，LogMr为横坐标作标准曲线。
7.以Ve为纵坐标，LogMr为横坐标作标准曲线。
8.在标准曲线上查出未知蛋白的LogMr，其反对数便是待测定蛋白质的分子质量。
9.在实验完毕后，必需将凝胶回收处理，以备下次使用，严禁将凝胶丢弃或倒入水池中。
五、实验结果和讨论
（一）实验结果的原始数据
（1）恒流泵设定流速：
5.4ml/10min（测定蓝色葡聚糖+未知蛋白）
5.8ml/10min（测定标准蛋白）
（2）自动部分收集器设定：
3.2ml/5min55s/管（测定蓝色葡聚糖+未知蛋白）
3.2ml/5min30s/管（测定标准蛋白）
（3）层析柱内凝胶总体积Vt（即柱床体积）：
Vt=99ml（测定蓝色葡聚糖+未知蛋白）
Vt=98.4ml（测定标准蛋白）
（4）洗脱液A280吸光度测定数据：
具体数据请见下表（表1和表2）
表1蓝色葡聚糖+未知蛋白A280吸光度测定数据
（蓝色消失后测得各管吸光值如下）
管号
0（对照）
a
b
c
d
e
f
A280
0
g
h
i
J（最蓝）
1
2
3
0.022
4
5
6（最大）
7
8
9
10
0.042
0.101
0.153
0.146
0.096
（3）安全现状评价。
0.053
0.023
表2标准蛋白质A280吸光度测定数据
三、规划环境影响评价牛血清清蛋白、鸡卵清清蛋白、胰凝乳蛋白酶原
（3）介绍评价对象的选址、总图布置、水文情况、地质条件、工业园区规划、生产规模、工艺流程、功能分布、主要设施、设备、装置、主要原材料、产品（中间产品）、经济技术指标、公用工程及辅助设施、人流、物流等概况。
1
第1页2
3
4
（一）环境影响经济损益分析概述5
6
7
同建设项目安全评价相关但又有不同的还有：
《地质灾害防治管理办法》规定的地质灾害危险性评估，《地震安全性评价管理条例》中规定的地震安全性评价，《中华人民共和国职业病防治法》中规定的职业病危害预评价等。
（4）化工、冶金、有色、建材、机械、轻工、纺织、烟草、商贸、军工、公路、水运、轨道交通、电力等行业的国家和省级重点建设项目；
0.000
-0.001
1.直接市场评估法-0.001
（四）规划环境影响评价的审查0.000
（2）环境影响后评价。
0.002
8
9
10
11
12
13
14
-0.002
0.069
0.420
0.252
0.143
0.137
15
16
17
18
19
20
21
0.139
0.150
0.186
0.235
0.264
0.293
0.346
22
23
24
25
26
27
28
0.401
0.407
0.348
0.241
0.144
0.075
0.032
29
30
31
32
33
34
35
0.013
0.007
0.005
0.008
0.006
（5）凝胶层析洗脱体积数据记录：
洗脱体积请见下表（表3和表4）
表3蓝色葡聚糖+未知蛋白洗脱体积数据
蓝色葡聚糖+未知蛋白
洗脱峰
最高峰值所在管号
洗脱体积
第一洗脱峰
J
35.2ml
第二洗脱峰
59.7ml
表4标准蛋白质洗脱体积数据
标准蛋白质（牛血清清蛋白、鸡卵清清蛋白、胰凝乳蛋白酶原）
11
35.5ml
23
70.0ml
第三洗脱峰
32
97.4ml
1.实验数据的处理
（1）凝胶层析柱柱床体积Vt：
测蓝色葡聚糖+未知蛋白时：
Vt=99ml
测标准蛋白时：
Vt=98.4ml
（2）利用表1中的数据作标准蛋白的洗脱曲线。
以收集管数（由于每管收集的体积为3.2ml，所以管数X3.2ml即为洗脱体积）为横轴，以280nm的吸光度值为纵轴，做出连续的平滑曲线，如下图1所示。
图1标准蛋白洗脱曲线
从此图中可以看到三个吸收峰分别在第11管、第23管和第32管左右出现，由于三种标准蛋白的分子量依次减小，而分子量大的蛋白会先洗脱出来，所以其中第一个峰为牛血清白蛋白（Mr=67,000）的吸收峰，第二个峰为鸡卵清清蛋白（Mr=45,000）的吸收峰，第三个峰为胰凝乳糖蛋白酶原A（Mr=24,000）的吸收峰。
未知蛋白的洗脱体积Ve也通过量筒测出。
各蛋白有效分配系数Kav和洗脱体积的计算和标准曲线的绘制
根据有效分配系数的计算公式，
， 其中凝胶柱的总体积在两次测量时是可能是不同的，所以在计算未知蛋白的有效分配系数和标准蛋白的有效分配系数时，应分别采用不同的凝胶柱床的总体积Vt=99ml和Vt’=98.4ml，不过由于在实际实验中我们两次进行凝胶层析的柱床体积相差很小（体积差不到0.6ml），所以可以认为柱床体积是稳定的。
而外水体积（即蓝色葡聚糖的洗脱体积）Vo＝35.2ml。
数据计算结果见下表5。
蛋白质种类
分子量Mr
洗脱体积Ve（ml）
有效分配系数
Kav
分子量对数
LgMr
牛血清蛋白
67,000
35.5
0.004746835
4.826074803
鸡卵清蛋白
45,000
70.0
0.550632911
4.653212514
胰凝乳糖蛋白酶原A
24,000
97.4
0.984177215
4.380211242
未知蛋白
59.7
0.384012539
表5原始数据计算汇总表
由于在一定的分子质量范围内，Kav与lgMw成线性关系：
，其中b, c为常数。
以标准蛋白质的分子量的lg值即lg（Mr）为横坐标，以有效分配系数为纵坐标，对Kav和lgMr做线性拟合，结果见下图3：
图3有效分配系数Kav与蛋白质分子量的lgMw值线性拟合的标准曲线
线性拟合方程为Kav=-2.1418lgMw+10.408，相关性系数的平方R2=0.9624，线性程度很好。
根据这一标准曲线可以由未知蛋白的有效分配系数Kav计算未知蛋白的分子量。
根据同样的原理洗脱体积Ve也是和lgMw成线性关系的，以标准蛋白质的分子量的lg值即lg（Mw）为横坐标，以洗脱体积Ve为纵坐标，对Ve和lgMw做线性拟合，结果见下图4：
图4洗脱体积Ve与蛋白质分子量的lgMw值线性拟合的标准曲线
线性拟合方程为Ve=-135.36lgMw+692.99，相关性系数的平方R2=0.9624，线性程度很好。
根据这一标准曲线可以由未知蛋白的洗脱体积Ve计算未知蛋白的分子量。
2.未知蛋白分子质量的计算
未知蛋白质的有效分配系数为Kav=0.384012539,根据标准曲线的线形拟合公式可以计算出未知蛋白的lgMr=4.680169699,所以未知蛋白的分子量的值为Mr=47,882。
未知蛋白质的有效分配系数为Ve=59.7ml,根据标准曲线的线形拟合公式可以计算出未知蛋白的lgMr=4.678560875,所以未知蛋白的分子量的值为Mr=47,704。
以上结果汇总为下表6
未知蛋白
Kav
47,882
4.680169699
Ve
47,704
4.678560875
表6最终计算结果汇总表
3.实验结果的讨论
（1）对未知蛋白质分子量计算结果的讨论。
根据有效分配系数Kav计算得到的未知蛋白质分子量为Mr=47,882，根据洗脱体积Ve计算得Mr=47,704。
二种方法所得到的数据基本一致，两者相差178，相对差值约为0.4%，在实验过程所允许的范围之内。
但是，理论上讲两种计算方法的结果应该是一致，造成误差的原因可能是第一次层析蓝色葡聚糖和未知蛋白之后，凝胶洗脱不充分，并且第二次层析标准蛋白这个过程中凝胶柱床Vt很可能发生变化。
而且由于同样的原因，外水体积Vo也会发生变化。
因此，两次层析实验过程中凝胶的物理性质即相关物理参数并不完全一致，导致由分配系数Kav和由洗脱体积Ve分别计算的Mr不一致。
不过，由于总体上凝胶的各种性质并没发生明显的变化，所以最终所测得的未知蛋白分子质量相差很小。
（2）关于加样后加洗脱液引起的实验误差的分析
加样操作过程产生的方法误差：
因为加入样品后即开始收集，而我们最后计算洗脱峰位置是根据收集的管数乘以每管计算得到的设定收液体积。
所以在样品渗入胶床后停止收集液体再加入少许洗脱液润洗管壁的时间内我们没有收集液体，但自动收集器仍在记时，所以该管液体量应该少于设定的每管收液体积。
在数据处理过程中，我们对该管仍按设定的每管3.2ml计算。
所以该时间段直接产生测量误差。
其大小主要取决于操作者的熟练程度。
所以我们在实验中应该尽量缩短该时间。
（3）实验中可能造成结果误差的原因分析。
第一，在实验相关参数测定中的系统误差和偶然误差。
由于在测量柱床体积Vt，外水体积Vo，洗脱体积Ve时使用了量筒等测量工具，所以由于这些工具所带来的系统误差是很难完全避免的。
同时，由于本次实验中每次层析实验只进行了一次，所以人为测量中的偶然误差也是很可能出现的。
所以，如果能够多次重复实验，并将每次实验的结果取平均值，应该能够在一定程度上使得最终测定的未知蛋白质分子量更加准确。
第二，由于两次进行凝胶层析时所设定的恒流泵流速不同，因此可能导致在两次层析过程中分离效果不同，从而导致最终结果的误差。
第一次层析过程中由于两个洗脱峰的间距较大，所以使用了2.75ml/5min/管的速度；
而第二次前两个洗脱峰的间距很小，为使得两个洗脱峰能够充分分离，所以使用了1.6ml/3min/管的速度。
因此，洗脱速度的不同可能导致两次实验的层析效果有一定的差别。
由于这个差别，将用测定标准蛋白所得的标准曲线应用于未知蛋白时可能会产生误差。
第三，我们所测的洗脱体积和实际洗脱体积一般情况下是不一致。
这是因为我们在用量筒测定体积时是把整管的收集液加入量筒中，所以所得体积一般不是洗脱峰峰值所对应的实际洗脱体积。
不过由于两次层析时每管的体积只有2.75ml和1.6ml，所以最终体积的误差最多不会超过一个收集管的体积。
因此在这个误差范围内，实验中用量筒测得的洗脱体积不会和实际体积有显著的差别。
（4）实验中注意事项
各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。
注意恒压瓶内的排气管应无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产生，则表示恒压瓶不漏气。
操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。
装柱要均匀，不过松也不过紧，最好也在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此而压紧凝胶。
但也不宜过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降。
始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。
也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。
洗脱用的液体应与凝胶溶胀所用液体相同，否则，由于更换溶剂引起凝胶容积变化，从而影响分离效果。
洗脱速度保持3-6ml/min，如果在洗脱速度太高，样品与凝胶将具有更少的时间来达到平衡，从而导致较差的分离。
太低的洗脱速度，样品的扩散不能被忽略，并且将需要更多的时间。
操作压过大可使流速变慢，此外还可以导致凝胶胶面下降，柱床容积的改变，相应测出Vt，Vo，Ve等也改变，造成实验结果的误差。
使用部分收集器时，将其转盘调节到最外圈，从第一管开始，否则会造成转换臂的转动与转盘不同心，以致洗脱液流到管外。
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