使用RNAscope技术探索HBVDNAcccDNA以及mRNA在肝组织中的分布Word文档下载推荐.docx

使用RNAscope技术探索HBVDNAcccDNA以及mRNA在肝组织中的分布Word文档下载推荐.docx

《使用RNAscope技术探索HBVDNAcccDNA以及mRNA在肝组织中的分布Word文档下载推荐.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《使用RNAscope技术探索HBVDNAcccDNA以及mRNA在肝组织中的分布Word文档下载推荐.docx（8页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

rcDNA进入肝细胞核中解脱正链3′端连接的末端蛋白、负链5′端的RNA残段（图一）;

依赖宿主细胞的DNA聚合酶补齐两条链上的缺口,并进一步折叠、扭曲形成超螺旋结构的cccDNA,并以cccDNA为模板转录为不同大小的mRNA（3.5Kb、2.4Kb、2.1Kb、0.8KbmRNA）,从而翻译各种病毒蛋白。

其中3,5Kb的pgRNA作为逆转录模板,利用病毒的逆转录酶合成全长的基因组负链DNA,再以负链DNA作为模板,通过病毒DNA聚合酶的作用,合成正链DNA,与负链DNA一起组成新的HBVrcDNA。

新合成的HBVrcDNA一方面进入细胞核内,转化为新的cccDNA,补充细胞内的cccD2NA库,使每个肝细胞中保持大约5～50个cccDNA分子;

另一方面与病毒蛋白装配成新的完整HBV,释放至细胞外,再感染健康的肝细胞（见图1）[1]。

InHBVgenome,theincompleteplusstrandhasavariable3‘-endbutadefined5’-endaroundposition1600nearDR2,whilethecompleteminusstrandhasdefined5‘-and3’-endswithaterminalredundancyof9bases[27].Thereisagaparoundposition1800nearDR1（Fig.1）.

图一HBV基因组结构。

HBV基因组有部分单链，部分双链，以及部分的三DNA链在病毒粒子中。

各HBV正义链的长度会有很大的不同，但是负义链有固定的5‘-和3’-端靠近1800左右的位置。

圆圈，引物酶；

钻石圈，DNA聚合酶。

2.传统HBVcccDNA的常用检测方法

根据cccDNA与rcDNA在结构和理化特性上的不同,可以建立检测cccDNA的方法:

（1）rcDNA能与蛋白质共价结合,cccDNA则不能。

（2）rcDNA的双链是不对称的,全长的一链与病毒mRNA互补,为负链,较短的一链为正链。

在正链和负链上均存在缺口,两链DNA通过5′端250～300个互补碱基的氢键作用形成部分环状结构,而非超螺旋结构;

cccDNA的两条链均是完整的,形成超螺旋结构。

（3）由于正链和负链上均有缺口存在,rcDNA可以被一些能够切除单链或含有缺口DNA的核酸酶如Plasmid2SafeTMATP2dependentDNase、绿豆核酸酶（mungbeannuclease）等降解成寡核苷酸或单核苷酸,而cccDNA则由于双链结构完整,不会被上述酶降解[2,3]。

（一）Southernblot

HBVcccDNA以往多用Southernblot方法进行检测,该方法是分子生物学的经典方法,但对操作者的技术要求较高,且步骤繁琐,灵敏度较低[4]。

图二Primerselection.PCRwasperformedtoselectprimerpairswhichcanspecificallyamplifyDNAfragmentfromHBVcccDNAbutnotgenomicDNAinthePCR.The106copiesofcccDNAfromaplasmidcontainingHBVgenomewereusedastemplateinlane1,2,3,7,8,9,13,14,and15;

while1.6×

106copiesofvirusDNAisolatedfromHepAD38conditionmediumwereusedastemplateinlane4,5,6,10,11,12,16,17,and18.Primerpairs:

1,4,HBV_CCC_F1/HBV_CCC_R1;

2,5,HBV_CCC_F1/HBV_CCC_R2;

3,6,HBV_CCC_F1/HBV_CCC_R3;

7,10,HBVCCCF2/HBV_CCC_R1;

8,11,HBVCCCF2=HBV_CCC_R2;

9,12,HBVCCCF2=HBVCCCR3;

13,16,HBVCCCF3=HBVCCCR1;

14,17,HBVCCCF3=HBVCCCR2;

15,18,HBVCCCF3=HBVCCCR3.

HBV_CCC_F1:

5’-ACTCTTGGACTCBCAGCAATG-3’;

HBV_CCC_F2:

5’-TGTTCACCAGCACCATGC-3’;

HBV_CCC_F3:

5’-GCGGWCTCCCCGTCTGTGCC-3’;

HBV_CCC_R1:

5’-CTTTATACGGGTCAATGTCCA-3’;

HBV_CCC_R2:

5’-ACAGCTTGGAGGCTTGAACAG-3’;

HBV_CCC_R3:

5’-GTCCATGCCCCAAAGCCACC-3’.

（二）普通PCR

基于rcDNA的正链和负链上均存在缺口,故可以设计跨越两个缺口的引物,使rcDNA不被扩增,cccDNA由于有完整的双链可以被有选择地扩增[2,3]。

（三）Real-TimequantitativePCR

He等[3]建立了实时荧光定量检测cccDNA的方法。

他们将具有发光基团和淬灭集团的TaqMan探针设计于负链缺口的下游,与负链互补。

在上游引物的引导下,若负链是完整的,Taq酶则到达Taq2Man探针所结合的位点,利用其5′→3′的外切酶活性将探针切断,从而3′端的淬灭集团失去对5′端发光集团的抑制作用,产生荧光信号。

若负链含有缺口,由于上游引物引发的链延伸不能通过负链缺口,故不能产生荧光信号。

这样,cccDNA和rcDNA得以区分开来。

此方法变普通PCR法的终点监测为实时动态检测,不需对PCR反应产物进行开盖检测,从而减少了PCR产物污染的可能（见图3）。

图三RT-qRCR检测cccDNA

（四）入侵检查（InvaderAssay）

入侵检查是近年来刚开始应用的技术。

其基本原理是目标DNA设计一对探针,一个探针称为初始探针（primaryprobe）,另一个称为入侵探针（invaderprobe）,初始探针的5′端一段寡核苷酸序列不与目标DNA互补,入侵探针3′末端的单个碱基不与目标DNA互补，Flap核酸内切酶I（FlapendonucleaseI）将初始探针5‘端不与目标DNA互补的寡核苷酸序列剪切下来，之后此段寡核苷酸序列与具有发光基团和淬灭集团的FRET（FluorescenceResonanceEnergyTransfer）探针相结合,从而产生荧光信号,能够被实时荧光PCR仪器检测[5]。

DKHW等[6]根据此原理,分别设计了与HBVDR2区正链下游、负链上游相结合的两种入侵探针,这样当正链、负链均为完整时产生两种荧光信号,从而检测cccDNA;

rcDNA由于正链含有缺口,只能产生一种荧光信号,得以和cccDNA相区分（见图4,5）。

整合型HBVDNA在DR2区的5′端也是一段完整的序列,但整合多发生在112bp的DR区[6,7],WongDK等[6]据此认为用入侵检查技术测到整合型HBVDNA的几率应该很低。

图四入侵检测技术原理示意图

图五入侵检查检测cccDNA

（五）最新型的RNAscope技术

RNAscope®

专利技术是近年来最火的RNA原位杂交技术，是RNA原位杂交（ISH）领域的一项重大进步。

由AdvancedCellDiagnostics公司（Newark,CA）开发，通过专利的双“Z”探针设计和信号放大系统，使RNA原位杂交具有高度特异性、单分子检测的敏感性并有极高的信噪比，能够在单细胞水平同时定量多个RNA的表达，在获得单细胞中单拷贝RNA表达数据的同时提供完整的组织形态学信息。

袁正洪教授[8]团队利用RNAScope®

技术根据HBV各核酸的特点设计了3组探针可以分别识别HBV的totalDNA，cccDNA，mRNA（图六），但是效果还有待评估，特别是免疫染色印迹法标记HBVHBsAg抗原和HBVRNA重合度很差，并不符合RNA与蛋白之间的表达关系。

图六

探针组1与HBV正义链（nt1930-2900）互补，可以和HBVDNA的正链以及pgRNA杂交

探针组2与HBV负义链（nt2957-837）互补，只和HBVDNA结合

探针组3对应HBV正链的缺失段（nt1090-1690），与HBV-DNA负链互补，使用RNAse去除mRNA后可以专门用于检测cccDNA。

图七免疫染色印迹法标记HBVHBsAg抗原和HBVRNA重合度很差

实验目的

目的一，利用RNAScope®

技术设计两套与袁正洪教授组不同的HBV1b和HBV2a的DNA，cccDNA，mRNA探针，并与袁正洪教授组的结果相比较

目的二探索各核酸在乙肝病人肝组织内各个不同时期的分布

目的三对比IFN治疗反应不同病人之间各核酸表达与分布的不同

Reference

1.SeegerC,MasonWS（2000）HepatitisBVirusBiology.Microbiology&

MolecularBiologyReviews64:

51.

2.AddisonWR,WaltersKA,WongWW,WilsonJS,MadejD,etal.（2002）Half-LifeoftheDuckHepatitisBVirusCovalentlyClosedCircularDNAPoolInVivofollowingInhibitionofViralReplication.JournalofVirology76:

6356-6363.

3.HeML,WuJ,ChenY,LinMC,LauGK,etal.（2002）AnewandsensitivemethodforthequantificationofHBVcccDNAbyreal-timePCR.Biochemical&

BiophysicalResearchCommunications295:

1102.

4.LiXM,YangYB,HouHY,ShiZJ,ShenHM,etal.（2003）InterruptionofHBVintrauterinetransmission:

aclinicalstudy.Worldjournalofgastroenterology9:

1501.

5.KwiatkowskiRW,LyamichevV,DeAM,NeriB（1999）Clinical,genetic,andpharmacogeneticapplicationsoftheInvaderassay.MolecularDiagnosis4:

353-364.

6.WongDK,YuenMF,YuanH,SumSS,HuiCK,etal.（2004）QuantitationofcovalentlyclosedcircularhepatitisBvirusDNAinchronichepatitisBpatients.Hepatology40:

727.

7.MasonAL,XuL,GuoL,KuhnsM,PerrilloRP（1998）MolecularbasisforpersistenthepatitisBvirusinfectionintheliverafterclearanceofserumhepatitisBsurfaceantigen.Hepatology27:

1736-1742.

8.ZhangX,LuW,ZhengY,WangW,BaiL,etal.（2016）InsituanalysisofintrahepaticvirologicaleventsinchronichepatitisBvirusinfection.JournalofClinicalInvestigation126:

1079.