细胞信号转导7章Word下载.docx

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⑥调节细胞溶质中溶胶-凝胶状态转变；

⑦高浓度Ca2+可能造成细胞死亡。

长期以来，人们对Ca2+在细胞功能调节上重要意义的认识因为不清楚其作用机理而受到影响。

人们常迷惑不解的是：

一个如此广泛存在的、普通的金属离子为什么具有以及是如何发挥调节细胞功能的作用的？

60年代末期，美籍华人张槐耀（1967）在动物细胞中发现钙调素，即Ca2+的多功能受体蛋白后，人们才真正开始对Ca2+的作用机理有了深刻的认识，提出了Ca2+也可以像cAMP一样作为细胞信使起作用。

这种观点，自70年代以来，在动物细胞已被大量的实验所证实，而自80年代以来，在植物方面也取得一些初步的证据说明Ca2+在植物细胞中具有类似作用。

1.2钙离子成为胞内信使的基础

在细胞环境中，存在多种最普通的离子，如二价的Mg2+、Ca2+，一价的Na+、K+、Cl-等。

在生物进化过程中，为什么特别选择Ca2+作为信使呢？

首先，我们知道，Ca2+不像cAMP一样，本身浓度可又环化酶活化而增高，有PDE活化而减少，Ca2+这样简单的离子不能轻易地产生或消灭。

Ca2+作为细胞信使的基础，首先是在细胞质与胞内钙库（某些细胞器）或胞外Ca2+之间存在浓度梯度。

这种梯度则是靠膜上Ca2+转移系统维持的。

如表7.1，Na+、K+、Ca2+、Mg2+4种离子的胞液浓度中，只有Ca2+浓度在10-5mol/L左右的水平，其它3种离子都在10-3mol/L以上，相差103倍；

而且胞内外的浓度也只有Ca2+相差最大，达2个数量级。

由于胞内Ca2+浓度很低，而胞外Ca2+浓度要高几个数量级，因此，当一种刺激能使胞外即使少量的Ca2+进入细胞溶质时，就令细胞溶质Ca2+浓度大幅增加，继而与一些与Ca2+能够高度亲和的蛋白质或酶结合，使其激活，引起生理反应，从而起到传递胞外信号的作用。

其次，Ca2+本身的特性也更适应于和靶蛋白形成特异及紧密的结合。

如表7.2所列4种金属离子中，其非水合离子半径，K+太大，无法与蛋白质形成紧密的结合；

其它Cl-，HPO42-离子也是如此；

Na+虽然小些，与Ca2+差不多，但它为一价离子，只带一个电荷，因此也只能与蛋白质形成疏松的结合，剩下的只有Ca2+与Mg2+了。

表7.1环境和动物体内几种离子的分布

离子

海水（mmol/L）

人血浆（mmol/L）

哺乳类细胞液（mmol/L）

Na+

490

135—145

12—20

K+

9.8

5.3

150

Ca2+

10

3.2

0.03—0.06

Mg2+

54

1.1

2.8

表7.2几种金属离子的半径

种类

离子半径（Å

）

0.65

0.94

0.98

1.33

Mg2+与Ca2+都是带双电荷的小金属离子，都能与蛋白质比较紧密地结合，为什么Ca2+结合更好呢？

Williams曾研究过这两种离子与蛋白质结合的化学机理，发现二者在与蛋白质结合时，都很容易与6个电子供体，通常为氧原子结合呈八面体排列。

Mg2+由于外形小，总是试图与同它结合的蛋白质中的氧原子拉的很紧，而且形成有规律的形态，例如6个Mg-O键距离差不多，最大相差约为0.012nm，各配位键伸向角大小变化也很微小。

这样一来，蛋白质就难以形成完全满足Mg2+如此严格要求的结合空穴，就好像Mg2+对其结合“对象”要求如此“挑剔”，结构只能“孤立”了自己。

另外，据认为，Mg2+为了与蛋白质建立完整的八面体结构，常较多地以分子中的氧原子为供体，即与水分子结合，这种取代也大大削弱了Mg2+与蛋白质的结合强度。

而Ca2+在与蛋白质结合中，其配位键可以是6个；

也可以是7—8个。

Ca-O键距离差别大，最大差值约为0.054nm，为Mg-O键的4.5倍；

而且各配位键的伸向角也不相同，即采取的是一种不规则结合方式，对蛋白质构象不需要有剧烈变化即可结合。

本身适应性强，结合对象也就易于给它提供结合空穴，因此Ca2+就容易与蛋白质牢固、特异地结合。

据推测，Mg2+浓度只有比Ca2+大100倍时，才能达到像Ca2+与蛋白质一样的牢固结合程度，Ca2+的这种特性，正是它与胞内受体蛋白质结合，作为传递信息的胞内信使的基本条件之一。

2.细胞的钙转移系统

细胞自由Ca2+的分布与转移是形成Ca2+信号的基础，只有对此有所了解之后，才能讨论Ca2+信号产生与终止过程。

2.1

通常细胞钙（总钙）以结合态和自由离子态（Ca2+）两种形式存在。

一般认为大多细胞外Ca2+浓度0.1-10mmol/L。

当然多细胞高等动物体内不同组织器官中，细胞外的Ca2+浓度可以相差数十倍，如无核红细胞较低，肌肉及骨细胞则较高。

细胞内钙分布不均匀，在静止（非激活）状态时，细胞溶质Ca2+浓度估计约为10-8—10-7mol/L，一般代表性取值为0.1μmol/L左右。

细胞溶质中Ca2+如果太高，会使磷酸根沉淀，而后者是细胞能量及物质代谢所必须的，因此Ca2+过高对细胞有害，甚至会致死。

因此有人认为细胞内Ca2+稳态失控是许多外界因素引起细胞坏死的共同机制，所以细胞溶质Ca2+处于极为严格的调节控制之中。

细胞溶质本身对Ca2+缓冲能力提供初步调节，例如有人估计静止胰腺泡细胞中，钙库Ca2+在被激素动员之后释放入细胞溶质可使其从0.1μmol/L左右增加到0.5—1.0μmol/L，但实际上中增加到1.0—0.5μmol/L，细胞内溶质内的许多被蛋白质、核苷酸、酸性磷脂都可以与Ca2+结合形成这种缓冲能力。

许多被称为“钙库”的细胞器，如内质网、线粒体等，其钙含量很高，但有人认为其游离Ca2+浓度并不太高。

如线粒体内Ca2+大致与细胞溶质相当，而内质网Ca2+用荧光指示剂测定结果约为微摩尔浓度水平（0.5μmol/L），比细胞质Ca2+仅高数倍。

它们之所以起钙库的作用，主要是细胞溶质中Ca2+处于不断交换之中，其本身又具有对Ca2+很大的缓冲能力。

钙库Ca2+缓冲能力主要是由于存在一类对Ca2+高容量、低亲和力的贮Ca2+蛋白有关。

它们一方面由于高容量能够降低Ca2+库内自身的自由Ca2+浓度。

防止过量Ca2+造成对Ca2+库本身功能的伤害；

另外一方面由于对Ca2+的低亲和力，故当Ca2+库钙通道开发时，该蛋白能快速地和钙解离，迅速将Ca2+释放到胞质中去，使Ca2+信号准确迅速的传递。

这种蛋白在肌细胞中主要是集钙蛋白（calsepuestrin），非肌细胞中主要是calreticulin，它们都是酸性蛋白，有一很大的酸性末端，可能是高容量低亲和力的Ca2+结合位点，此外，两种蛋白结构完全不同。

在非肌细胞中，还存在一些其它的贮钙蛋白，如二硫异构酶、免疫球蛋白重链结合蛋白（BIP），endoplasmin等；

在肌细胞中小清蛋白（parvalbumin）和calbindin也是贮Ca2+蛋白。

2.2质膜上的钙转移系统

为了维持细胞主要是细胞溶质内低Ca2+浓度，质膜上有两个Ca2+转移系统将Ca2+排至胞外：

高亲和力低容量的Ca2+泵（Ca2+-ATP酶）与低亲和力高容量的Na+-Ca2+交换器。

（图7.1）。

2.2.1钙泵

质膜上的Ca2+泵主要研究模型为红细胞。

Ca2+-AYP酶是一种疏水的膜结合蛋白质，为一单肽链，分子量估计为13.8kD，它具10个跨膜区域，第2-3，第4-5跨膜区之间各有一个大的胞质区域结构，主要由α螺旋及β折叠组成，第4-5跨膜区间的胞质区域有一个活性中心，C末端也处于胞质域，内含CaM结合和激酶磷酸化部位，未活化泵C末端遮蔽了活性中心，C末端也处于胞质域，内含CaM结合和激酶磷酸化部位，未活化泵C末端遮蔽了活性中心，结合上CaM或被激酶磷酸化后可暴露出活性中心而使Ca2+泵活化（图7.1）。

已知质膜Ca2+泵至少是由4个基因组成的家族，转录时的剪切将进一步增加Ca2+泵亚型的数

图7.1质膜钙泵结构与活化模型

目。

钙泵分解1个ATP分子可将1-2个Ca2+跨膜转移到胞外，同时以1：

2比例将H+转移到胞内，使离子交换结果为电中性，因此质膜两侧膜电压差就不会影响Ca2+的转移，因为此酶转移Ca2+、水解ATP时都需要Mg2+存在，有人称它为Ca2+-Mg2+-ATP酶。

Ca2+泵在转移Ca2+时一个主要的特点是它与Ca2+亲和力很高。

在胰腺泡细胞膜上的Ca2+泵有人估计Ka为0.2-0.8μmol/L，即细胞溶质内Ca2+稍微增加一点即与Ca2+结合而被转移出去；

但它的转移容量不高，有人估算在Ca2+浓度为0.1-1μmol/L时，转移Ca2+量仅占细胞全部转移Ca2+量的0.2%—3.6%。

因此质膜Ca2+在调节胞内Ca2+稳态时主要起一种灵敏的微调作用。

目前不仅在红细胞，而且在许多动植物细胞中都发现存在质膜Ca2+泵，而且从红细胞提出的Ca2+—ATP酶亦已重组入大豆磷脂质体，重组的脂质体Ca2+泵能够积累Ca2+和水解ATP，其比值为1，运作最大速率为1.5μmol/（L·

mg蛋白质·

min）。

质膜Ca2+泵活性受下列数种机理的调控：

第一，钙调素激活：

这是一个最主要的调节机制。

胞内Ca2+在浓度增加时与CaM结合并使其活化，将Ca2+排出细胞。

这是一种反馈调节机制。

第二，二磷酸肌醇磷脂（PIP2）激活：

当细胞受到某些激素刺激时，使PIP2水解。

首先，PIP2减少使Ca2+泵活性降低，Ca2+排出量减少；

其次PIP2水解产物IP3将胞内钙库内质网Ca2+释放出来，使细胞溶质Ca2+增加。

这重双重效应据说还具有记忆效应，对神经细胞十分重要。

第三，有限水解活化：

胰蛋白酶将Ca2+泵蛋白切去C端一个肽段后，不但不影响其活性，反而使其活化，估计是由于切去了一个抑制肽后，使活性中心暴露出来之故。

第四，PKC和依赖cAMP的激酶（PKA）均可使钙泵C末端CaM结合区域磷酸化而移开，暴露出活性部位而活化。

Ca2+泵调节机制如此复杂，与数个胞内信使系统都有关系，说明它在细胞生命活动中十分重要。

2.2.2Na+-Ca2+交换器

质膜上第二种将Ca2+移出胞外的系统是Na+-Ca2+交换器，它主要存在于兴奋性细胞如神经细胞和肌细胞。

发现这种交换器最初的证据之一是胞外Na+浓度会影响Ca2+的移出，这种转移Ca2+系统与Ca2+泵不同，不能直接利用ATP为能源，它的驱动力有两种：

第一：

利用胞内外Na+的浓度梯度。

此梯度大约为10：

1，因而只能勉强地将Ca2+移出胞外。

由于胞内外Na+浓度差是Na+-K+泵维持的，故可以认为Na+-Ca2+交换器在间接地利用ATP为能源。

第二，精确的动力学研究发现Na+-Ca2+交换器排出1个Ca2+，交换进入3个Na+。

这种净入1个正电荷的效应，使交换器增加了另一个能量来源——膜电位，因此细胞质膜两边内负外正的电压梯度可以驱动交换器。

总之Na+-Ca2+交换器是靠着化学梯度和电位梯度二者结合驱动的。

Na+-Ca2+交换器与Ca2+泵另外的区别是亲和力低而交换容量大，一般认为交换器是在胞内Ca2+浓度为1—5μmol/L时（比静止时大10倍）才能达到最大交换量的一半；

但其交换量大，如在一个心脏细胞内，每秒钟能将3×

109个Ca2+排出胞外。

所以Na+-Ca2+交换器主要在兴奋性细胞受到刺激后从胞内除去大量的Ca2+。

2.2.3离子通道

Ca2+从胞外内流是通过质膜钙离子通道。

离子通道是一种膜结合蛋白，它通过构象变化呈开发或关闭态，从而控制Ca2+流动。

在钙通道关闭时，胞外Ca2+以非特异渗漏形式（亦称渗漏Ca2+通道）进入细胞，数量甚微；

钙通道开放时，Ca2+以扩散形式按一定的扩散压差从胞外涌入胞内。

目前已知的质膜Ca2+通道种类较多，但对其分子结构大多还不完全清楚，因此仅根据控制启闭的因素主要分为电压门控及激动剂-受体门控通道两类。

电压门控钙通道（voltage-gatedCa2+channel）受控于膜电压的变化。

但也能被神经递质、G蛋白、信使依赖激酶所调控。

当细胞处于静止状态，即膜电位为胞内-90mV左右时，钙通道处于关闭态；

当细胞受到刺激引起初始去极化作用时，首先是膜上对电位敏感的Na+通道开放，Na+进入细胞使胞内进一步去极化；

当去极化到-30mV左右时，钙通道开放；

而膜电位进一步改变达到+40mV时，其它离子的作用（如K+外流）使膜电位由回到-90mV，钙通道重又关闭。

电压门控钙通道开放时间大约1μs，允许大约3000个Ca2+通过。

它们又分为四种：

一种为低阈值，即在-60mV弱去极化时则可开放，形成的单通道电流值小（100μmol/LBa2+条件下电导值约8pS），而且开放时间短，呈瞬时状态，因此称为T型（transienttype）。

另一种为高阈值（-10mV才激活），形成的电流值大（单通道电导值约15-25pS），开放时间长，称L型（longtype）。

T型有时亦叫快通道（fastchannel），L型亦叫慢通道（slowchannel），以上两种广泛存在于各种细胞。

神经细胞中存在特有的第三者类型——N型；

阈值0mV，持续时间及电流值处于T和L型之间。

第四种亦存在于神经细胞，相对较高阈值激活，介导神经递质释放。

四种类型钙通道对通道阻断剂的反应也不同，如L型对二氢吡啶类的异博定，硫氮唑酮（diletianzen）等阻断剂敏感，而T型则不敏感，N型对W-conotoxi敏感，P型对蜘蛛毒素FTX敏感。

图7.2骨肌细胞质膜L型Ca2+通道模型

质膜L型Ca2+通道蛋白已从骨肌细胞中纯化并在脂质体中重组成有功能的离子通道。

这种离子通道由α1、α2、β、γ、δ5个亚基组成。

其中最主要的是α2亚基，它组成离子通道孔，212kD的α1肽链包括Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ4个重复结构，每个含7个跨膜区域。

ⅡⅢ重复单位之间结构与心肌、骨肌兴奋收缩偶联有关；

ⅢⅣ重复单位含二氢吡啶和异博定等结合部位。

β亚基为膜内侧外周蛋白（57kD）；

γ亚基为跨膜亚基（25kD）；

α2/δ亚基由二硫键连在一起。

其中α2为膜外侧蛋白亚基而δ为跨膜亚基（125kD）。

激动剂-受体门控Ca2+通道（receptorgatedCa2+channel）主要由激素、神经递质等配体激动剂结合于其受体后调控。

如N-甲基-D-天冬氨酸受体Ca2+通道是在递质结合和膜去极化情况下Ca2+进入神经细胞的通道；

ATP受体调节Ca2+通道是ATP结合于其受体后，阳离子与Ca2+进入并激活平滑肌的通道。

质膜上还有一种机械操纵型Ca2+通道，又称为牵张激活Ca2+通道，它对机械牵张敏感，主要与血管内皮细胞感受血液压力，分泌相关因子以影响血管紧张状态有关。

2.3内质网钙转移系统

尽管质膜上钙转移系统可以使Ca2+进入或排出细胞，但在某些类的细胞，Ca2+释放与排除必须迅速进行，因此靠近Ca2+作用位点的细胞内膜系统能更好地完成转移任务。

首先因为细胞内膜系统表面的运送能力大；

其次运送Ca2+时耗能较少，因为细胞内钙库与细胞溶质的Ca2+浓度梯度比质膜两侧要小得多，实际计算也表明内质网与线粒体在运送Ca2+的数量上远远超过质膜。

2.3.1内质网Ca2+泵

内质网或肌浆网也存在类似质膜上的Ca2+泵，它靠水解ATP将细胞溶质Ca2+逆浓度梯度泵入内质网。

肌浆网含有丰富的Ca2+泵，常作为Ca2+泵研究模型。

肌浆网Ca2+泵单体分子量为10-110kD，不对称地分布于膜内外，其氨基酸序列亦已基本上搞清楚，其结构与质

图7.3肌细胞中的膜Ca2+转运系统

Ca2+泵相似。

Ca2+泵活性需要Mg2+，但与Ca2+亲和能力最高，如据胰腺泡细胞内质网Ca2+泵研究表示其亲和常数为0.1-0.2μmol/L，因此对Ca2+很敏感。

血小板等内质网Ca2+泵蛋白已被提纯及重组成功，而且测定表明分解1个ATP可以泵人2个Ca2+。

心肌肌浆网上发现，依赖CaM和cAMP的蛋白激酶可以活化Ca2+泵，但不是直接作用于Ca2+泵分子，而是通过与屏蔽Ca2+泵活性中心的受磷酸蛋白（phospholambin），使其磷酸化而令其从Ca2+泵活性中心移开，暴露活性中心，而使Ca2+泵活化。

内质网转移Ca2+分别占总量的69%，90%和47%。

被泵入的Ca2+可以氧化钙或磷酸钙形式存在，也可被集钙蛋白等Ca2+高亲和力蛋白所结合，因而内质网可富集高达5mmol/L的总钙。

内质网Ca2+泵也有几个亚类，分别在不同组织或器官的细胞存在。

Thapsigargin是非肌细胞内钙泵抑制剂，可使胞质Ca2+迅速增加。

2.3.2内质网钙离子通道

内质网释放Ca2+已证实也是通过钙通道。

肌浆网Ca2+通道蛋白已经提纯，并重组入脂双层获得成功。

研究表明Ca2+通道电流值很高（50μmol/LCa2+时电导值为100pS），即释放Ca2+能力很强。

内质网Ca2+通道调节机制至少有两个：

第一，质膜肌醇磷脂分解产物IP3为内质网膜受体（IP3R）介绍后引起Ca2+通道开放。

第二个机制存在于肌浆网。

肌浆网与T小管（质膜在肌细胞中的内陷物）存在紧密联系，在兴奋-收缩偶联过程中，T小管去极化直接引起肌浆网Ca2+通道的开放。

这种Ca2+通道因为对一种植物碱ryanodine敏感，文献上称为ryanodine受体（RyR）钙通道。

IP3R离子通道受体存在于大多数细胞中，它由同源四聚体组成。

图7.4显示其亚基单链结构，其C端是数个跨膜区域，组成离子通道孔，其它大部分游离于胞质中，N末端有IP3结合部位，箭头所示部位是cAMP依赖磷酸化位点。

此类受体包括IP3R1（a与b）——IP3R4等几个同功酶。

IP3介导此离子通道开放是量子化的，具“全或无”特性。

在无Ca2+条件下，IP3几乎不能诱导其受体通道开放。

巯基试剂、ATP能促进IP3介导的Ca2+释放；

肝素（heparin）是IP3R的专一性竞争性抑制剂，Mg2+与H+亦能非竞争地抑制其开放。

IP3R被cAMP依赖的蛋白激酶磷酸化时，使其对IP3的敏感性下降。

Ryanodine受体（RyR）离子通道存在于肌细胞。

它是同源四聚体、单链分子量比IP3R大得多，同样在C端有跨膜结构，其余大部分伸入胞质。

星号标记处为cAMP和CaM依赖激酶磷酸化位点（图7.4）。

咖啡因、腺嘌呤核苷酸、Ca2+及ryanodine促进通道开放，而Mg2+、过高浓度的Ca2+、ryanodine、钙红、CaM等抑制其开放。

此通道原由微量ryanodine促使开放而命名，近年来才了解到其真正胞内的激活者或调节物是cADP核糖（cADPR），它是NAD+在ADP核糖环化酶作用下产生（并脱去一个烟酰胺），进而cADP核糖可被cADPR水解产生ADP核糖（见图7.5）。

cADPR作为激动剂作用于RyR离子通道诱导Ca2+释放是海胆卵中发现的，后来证明也存在于一些哺乳类动物中。

图7.4IP3R与RyR受体离子通道单链结构模型

自1987年发现cADPR以来，进一步大量的工作表明cADPR不仅是RyR的激活剂还是一个第二信使，而且细胞内存在一个与肌醇磷酸脂代谢产物IP3敏感Ca2+释放系统并列的NO-cGMP-cADPR敏感的Ca2+释放系统。

图7.6比较了这两个系统信号转导过程。

在cADPR系统中，NO作为胞外刺激原进入细胞，激活胞质中的cGMP环化酶产生cGMP，后者再激活ADPR环化酶由NAD+产生cADPR，作用于RyR释放Ca2+。

此系统已知也存在于哺乳动物处肌细胞外的其它细胞中。

图7.5cADPR的结构与代谢（引自Calione等）

图7.6cGMP在胞内钙库释放中的作用模式

S：

胞外刺激；

ADPRC：

环腺苷-磷酸化酶；

RYR：

ryanodine受体；

IP3R：

IP3受体R：

质膜受体

2.4线粒体钙转移系统

如果说内质网起着细胞内Ca2+灵敏而快速调节作用的话，那么线粒体则起着持久的、大容量的调节作用。

在60年代初就已发现线粒体这个细胞呼吸器具有积累和释放Ca2+的作用。

如果将线粒体分离出来，放在含微摩尔浓度的Ca2+介质里，无论加入Ca2+或加入EGTA（Ca2+螯合剂），线粒体都能最终使介质达到一个固定值（如0.8μmol/L）。

线粒体在稳定Ca2+的作用时，往往在小于1μmol/LCa2+浓度时不起作用，而在防止细胞大幅度波动上，它则起重要的作用。

线粒体吸入Ca2+依靠单一运送器（图7.7）它也是一种存在于膜上的蛋白质，其能量是来自线粒体呼吸代谢形成的膜电位，它在线粒体内膜之内高达-180mV。

这种膜内的负电位，使带正电荷的Ca2+顺电位梯度向内移动，而且多数人认为运送器并不同时交换其它离子。

当细胞溶质中Ca2+达到25μmol/L左右时，运入Ca2+才达到最大值的一半，因此它对Ca2+亲和力很低。

但由于线粒体运送膜面积很大（常达到整个细胞的90%左右），在细胞溶质Ca2+高浓度时它的运送量很大，甚至超过内质网。

如有些资料估算，当介质Ca2+浓度为0.1，1和10μmol/L时，线粒体运送Ca2+量分别为0，6.4%和51%。

图7.7线粒体内膜Ca2+转移系统

ET：

电子转移系统；

c：

细胞溶质；

m：

线粒体内

3.钙信号的产生、终止及传递途径

3．1钙信号的产生与终止

钙信号的产生与终止是细胞内Ca2+增减、波动的结果。

当某种外界刺激达到细胞表面时，处于质膜上及内质网（或肌浆网）膜上钙通道开放，胞外或内质网钙库Ca2+释放至细胞溶质，使细胞溶质内的Ca2+浓度增高，是钙信号产生的途径。

在某些细胞，质膜Ca2+通道的开放是产生Ca2+信号的主要途径。

如神经终端，Ca2+是释放神经递质的信号。

神经细胞动作电位到达终端，引起电压门控Ca2+通道的开放使