浅论整合子与大肠埃希菌耐药基因水平转移关系的研究进展.docx

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浅论整合子与大肠埃希菌耐药基因水平转移关系的研究进展

浅论整合子与大肠埃希菌耐药基因水平转移关系的研究进展

　　【关键词】整合子;大肠埃希菌;水平转移

　整合子可特异性捕获或切除基因盒导致基因盒的移动，也可在接合性质粒、转座子、整合型噬菌体或细菌染色体间移动并且通过这些可移动元件在同种和不同种菌属间传播成为了目前大肠埃希菌广泛耐药的重要原因。

目前细菌抗生素耐药和多重耐药已成为全球关注的问题。

大肠埃希菌（Escherichiacoli,），是存在于人和动物肠道中的正常菌群，也是引起临床感染最常见和最重要的革兰氏阴性杆菌之一，从上个世纪70年代报道其出现抗药性至今，大肠埃希菌的耐药状况日益严峻。

人们在对于耐药机制的研究中发现，整合子是一种与耐药基因水平转移密切相关的克隆表达载体，是耐药基因储存和转移的重要结构。

1991年Hall等人正式提出了基因盒整合子（Genecassette）系统的概念。

基因盒整合子系统是一种具有位点特异性重组功能的可移动元件，由两个保守区及其间的基因盒构成，在事例酶的催化下可捕获和表达外源基因，并通过接合性质粒、转座子、整合型噬菌体或细菌染色体在同种和不同种菌属间传播，使细菌耐药性广泛播散，是细菌多重耐药快速发展的重要原因。

　　1基因盒整合子系统

　　基因盒整合子系统由5保守末端（5CS）、3保守末端（3CS）和中间的可变区组成，系水平基因传递系统（horizontalgenetransfer,HGT）。

5CS包括1个整合酶基因（intI）、1个附着位点attI和启动子;3CS结构因整合子的类型不同而异;可变区可有数量和功能不同的基因盒。

基因盒是较小的可移动基因元件，常以环状形式独立存在，也可被整合到整合子中的DNA单元。

基因盒的基本结构是由一个单基因和一个位于其下游的短的回文序列attC组成。

多个基因盒可插入到同一个整合子上，为细菌产生多重耐药性提供了可能。

　　整合子介导的基因水平转移

　　基因盒整合子系统能够使细菌从环境中获取适应环境变化所需基因的同时去除掉那些会造成自身代谢冗余的基因，进而达到基因组的最优化配置，细菌对抗生素产生抗性也是适应环境的一种表现。

整合子可整合数量不等且互不相同的耐药基因，一旦细菌对某种抗生素产生耐药基因，该耐药基因就可能被整合子捕获，继而使耐药性得以散播。

整合子的水平转移可解释耐药基因的扩散和多重耐药菌株的产生。

　　当耐药基因成为可移动基因盒的一部分时，可通过事例酶单个基因盒的移动、含重置基因盒、大转座子的扩散、不同菌种间含整合子的接合质粒的移动等机制进行水平转移，大大增强耐药基因的扩散[1]。

不同菌株的相同整合子可位于不同的DNA元件上，或者在整合子的外延序列中存在一些差异，使其有更高的移动性。

接合是基因水平传递最常见的方式，耐药基因的水平传播主要是依靠接合性质粒，在接合过程中整合子可发生基因盒的捕获或丢失。

通过接合水平转移的整合子可引起人类与动物之间大肠埃希菌对抗菌药物抗性的播散。

　　基因和基因组学研究表明，基因水平转移在增加菌种的遗传多样性、获得新的生物学性状及新的微生物种的形成及其基因组的进化过程中具有非常重要的作用。

另外，通过质粒、噬菌体或整合子的基因水平转移可推进微生物间的协同合作。

在细菌耐药机制的研究中发现，基因盒整合子系统与细菌基因组的进化有着密切的联系。

　　整合子的分类及常见耐药基因

　　目前在130多种耐药基因盒已被确认，其中的基因主要为耐药基因，编码对多种抗菌药物、消毒剂及防腐剂等的耐药性。

整合子根据其编码整合酶的DNA序列不同可分为9类，其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ类与细菌耐药基因传播密切相关。

在大肠埃希菌的研究中目前发现了Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ类整合子，其中以Ⅰ类整合子最为常见。

　　细菌携带基因盒与其耐药表型有较好的对应关系，说明整合子介导了细菌相应的耐药性。

在季胺类化合物（qac）基因家庭中，qacE△1是qacE的缺失型，3CSqacE△1sul1基因扩增结果可作为Ⅰ类整合子阳性株的检出方法。

qac家庭表达细菌多种化合物外排泵，包括：

季胺类、双胍类及碱性染料。

　　sul1、sul2或sul3基因可介导磺胺类药物耐药[10]。

有研究报道表明，在医院血培养分离的135株大肠埃希菌中，几乎一半的菌株含有整合子和sul基因，并且sul基因在不同的结构中被检测出，对抗生素抗性的传播起决定性作用[11]。

　　二氢叶酸还原酶（dhfr）基因家庭中多以基因盒插入Ⅰ、Ⅱ整合子，尤其以高频插入到含sul1的Ⅰ类整合子中，传递对甲氧苄啶嘧啶类（TMP）的耐药性。

SeputienéV等人对采集于临床患者、健康动物及患病动物不同部位的共456株大肠埃希菌对甲氧苄啶类耐药情况及drf基因流行分布进行研究，结果显示在Ⅰ类或Ⅱ类整合子里dfr基因在基因盒中携带率达73%以上[12]。

　　编码β内酰胺类抗生素的基因字类繁多，bla（VIM）基因作为位于一种180kb接合质粒上Ⅰ类整合子的一部分，编码金属β内酰胺酶，最近发现了一种VIM4样的名为VIM19酶，能水解青霉素类、头孢菌素类及碳青霉烯类药物，且具有高于VIM1对青霉素的催化效率[13]。

另外有研究指出，携带有bla（CTXM14）和bla（CTXM15）的大肠埃希菌有可能获得对碳青霉烯类药物的耐药[14]。

　　aad编码氨基糖苷腺苷基转移酶，介导对氨基糖苷类耐药：

aac编码氨基糖苷类乙酰基转移酶，aac（6′）ibcr与产ESBLs大肠埃希菌高水平对喹诺酮和氨基糖苷类耐药有重要的关系[15]。

　　2整合子介导的大肠埃希菌耐药

　　以往常用大肠埃希菌天然耐药机制中的基因突变和耐药性质粒介导细菌耐药性来解释多重耐药[16]，但对于没有接触过抗生素的病原菌也会出现抗生素耐药的这种情况，可用基因盒整合子系统来解释。

大肠埃希菌通过该系统，在整合酶的作用下，不断地从周围环境捕获耐药基因，通过启动子作用得以表达，使细菌具有耐药性或多重耐药性[17]。

致病菌和非致病菌在人类与动物之间共存，耐药基因可通过可移动遗传元件相互传递，甚至扩散到整个生态系统。

　　健康人粪便中大肠埃希菌的耐药

　　大肠埃希菌作为人体固有菌群得以长期存在，是其耐药株的最大储存库，临床感染的大肠埃希菌多来源于肠道，由于人可不断排出其耐药株，通过污染周围环境在人与畜、人与人之间传播，因此研究和监测其在健康人群的耐药状况对临床致病菌的控制和细菌耐药性的传播有着重要作用和意义。

大多数学者认为出现多重耐药的主要原因是抗菌药物的广泛应用和不合理应用，除了抗菌药物与细菌耐药的研究外，也有研究是否与人类日常生活中密切接触有关的相关性问题。

目前已有不少关于健康人肠道大肠埃希菌携带整合子及健康人可作为很多抗菌药物耐药基因储藏库[18]的报道，甚至在农业、家禽养殖业等生态领域均出现了整合子的身影。

另外，耐药基因可通过非致病性大肠埃希菌与沙门菌[19]等致病菌高效交换其耐药基因，从而获得相应的耐药性。

HoPL等人对来自可食性动物和人的粪便、泌尿道感染病人的174株大肠埃希菌进行研究发现，动物粪便株中Ⅰ类整合子的携带率较另外两种来源的菌株高[20]。

因此推测，健康人群大肠埃希菌的这些耐药基因可能是通过整合子由可食性动物中的细菌而获得的。

　　可食性动物中大肠埃希菌的耐药

　　由于抗生素对动物生长的促进作用，多种抗生素常添加于动物饲料中，小剂量、长时间接触诱导细菌耐药性产生[21]。

耐药基因可从动物源细菌通过食物链转移给人，这样耐药基因和源于正常人体内的耐药菌株在肠道正常菌群中积聚，粪便中含有整合子的耐药菌排入环境中，导致自然界耐药菌大量增加。

因此，食物链对细菌耐药性的产生和传播是一个不可忽视的环节。

大肠埃希菌的耐药基因可以通过整合子，尤其是Ⅰ类整合子，在动物和人类之间水平转移，进一步加快和扩大细菌抗药性的播散。

　　有研究对采集于不同超市的79株来自可食性动物样本中大肠埃希菌进行分析显示，食物样本可作为编码ESBLs基因和可能通过食物链将整合子传递给人的贮存库[22]。

Ⅰ型整合子及其基因盒的存在与否明显影响着大肠埃希菌的耐药性和多重耐药率、耐药谱，是在基因水平监测多重耐药性的重要指标，同时也为兽医更好的应用抗菌药物[23]以及临床科学防治提供了依据。

也有研究发现，自然环境中的有些菌株在做整合子检测时同样获得了阳性信号并且所携带的基因盒无明显差异，而自然环境中抗生素压力并不明显存在，说明耐药基因的传递不仅仅依整于选择压力，可能与食物链有着密切关系。

目前，食物链中的大肠埃希菌耐药及多重耐药菌株都非常普遍。

　　临床产ESBLs大肠埃希菌的耐药

　　超广谱β内酰胺酶（extendedspectrumβlactamases,ESBLs）是由细菌质粒介导的能水解甲氧亚氨基β内酰胺抗生素并可被β内酰胺酶抑制剂（如克拉维酸）所抑制的一类β内酰胺酶。

ESBLs属于Ambler分子分类法中的A类、Bush功能分类法中的第二群2be亚类。

按照编码基因的同源性，将ESBLs分为TEM型、SHV型、OXA型、CTMM型和其它型。

ESBLs主要产生于大肠埃希菌和克雷伯菌属，编码ESBLs的绝大多数基因在质粒上，极少位于染色本上，质粒介导的产ESBLs是导致革兰阴性菌对β菌酰胺酶抗菌药物耐药的重要机制。

整合子是细菌基因组中保守的、自我位移有缺陷[24]，常通过接合性质粒等元件作为共同的移动工具。

整合子的分布可借助于转化、转导及接合等方式在同种属甚至不同种属细菌的不同元件间不断转移，导致更多的细菌产生ESBLs，并通过整合和重组使多种耐药基因群聚产生多重耐药。

细菌整合子的携带与多重耐药性高度一致，而不同耐药质粒的整事子插入区可携带相同的耐药基因盒，也间接反映了整合子耐药基因盒的频繁流动性及抗菌药物选择压力下所产生的耐压性积聚现象。

另外，β内酰胺类药物可促使ESBLs基因拷贝数增加而导致细菌高产ESBLs。

　　有研究表明，产ESBLs菌株随整合子的有无表现出对β内酰胺类耐药的差异，可能与整合子阳性株中存在某些水解能力更强的ESBLs型别有关。

产ESBLs菌株中blaSHV、blaCTX、blaTEM基因与整合子相关性的研究发现，整合子在3种ESBLs基因中的阳性比例接近，但经质粒与整合子共同转移的频率中blaCTX的最高，提示blaCTX和整合子位于同一转移单位元件上[25]。

另外，含有整合子的产ESBLs菌株在播散过程中，除了β内酰胺类抗菌药物所起到的筛选作用外，整合子上其它耐药基因所对应的抗菌药物也会起到筛选ESBLs基因的作用，在医院内多样的抗菌药物压力下，ESBLs的播散速度和范围会大大增加。

2002年，Hanson等从1株沙门菌携带的质粒上同时发现了ESBLs和AmpC基因，被命名为产超超广谱β内酰胺酶（ESACs）菌株，已经成功将ESBLs和AmpC酶拼命起来共同应对抗菌药物的攻击;最近，在澳大利亚第一次发现了携带有blaNDM1基因并且表达CTXM15的多重耐药大肠埃希菌[26]，可见细菌的耐药性越来越强。

　　有些抗生素在临床治疗中应用较少或已被停用，整合子携带的编码其抗性的基因盒虽有可能被整合酶剪切下来，但并不一定会丢失。

当细菌被再次暴露于这些抗生素环境中，整合子能通过遗传记忆的方式，利用启动子附近的整合酶将基因盒区域3′端的基因盒重新配置，恢复对抗生素的抗性。

　　3结语

　　大肠埃希菌耐药状况已经十分普遍，目前在临床患者、健康人、可食性动物甚至是农业、家禽养殖业等多个领域均有涉及。

基因盒整合子系统成为多种细菌耐药机制的研究重点[27]，同时为耐药基因水平转移及多重耐药性的快速播散提供了条件。

对于如何降低或阻断整合子捕获耐药基因和耐药基因的水平转移过程，进而控制细菌耐药性及多重耐药性的传播还需进一步的研究和探讨，从而能更好地指导合理应用抗菌药物，减少药物选择压力的产生，为新抗生素的研究创造条件。

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