植物生理学中各项生理指标的测定方法.docx
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植物生理学中各项生理指标的测定方法
植物生理学中各项生理指标的测定方法
一.实验内容
实验1MDA（丙二醛）含量测定所需试剂：
10%三氯乙酸（TCA）（纯）0.25%硫代巴妥酸（纯）
实验2：
可溶性蛋白含量测定所需试剂：
考马斯亮蓝G-25095%乙醇85%磷酸
实验3：
SOD（超氧化物歧化酶）酶活性测定所需试剂：
dl-甲硫氨酸（Met）NBTEDTA-Na2核黄素
实验4：
CAT（过氧化氢酶）活性（过氧化氢酶）测定所需试剂：
PBS（PH=7.0）30%H2O2
实验五：
Apx（抗坏血酸过氧化物酶）活性（即ASA—POD活性）测定所需试剂：
ASA（分子量167.12）（乙=胺四乙酸=钠）EDTA—Na2PBS（pH7.0）30%H2O
实验6：
ASA（维生素C）含量测定
偏磷酸95%乙醇磷酸4%2,2-二联吡啶FeCl3（或FeCl3·6H2O）
实验7：
GSH（谷胱甘肽,媚力肽GSHGSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸结合而成的三肽化合物）含量测定所需试剂：
NaH2PO4·2H2ODTNB（二硫代硝基苯甲酸）PBS（PH6.8）
实验8：
脯氨酸测定所需试剂：
磺基水杨酸甲苯茚三酮冰乙酸85%磷酸
试验9：
叶绿素含量测定。
80%丙酮
试验9：
GR活性测定
试验10：
过氧化氢含量测定。
三氯乙酸
试验11：
超氧阴离子含量测定
二．酶液和母液提取
1.酶液提取所需试剂：
50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）（内含1%（m/v）聚乙烯吡哆烷酮PVP），0.1mmol/LEDTANa2或EDTA），也可为（内含2%（m/v）PVP），0.2mmol/LEDTANa2或EDTA）（先配制后用缓冲液定容）
2.ASA.GSH母液提取所需试剂：
5%偏磷酸
1．抗氧化酶酶液提取（SOD.POD.CAT）：
1g（根据样品的量,少的可以适当减少）叶片加入预冷5ml.50mmol/L磷酸缓冲液（PH=7.8）
↓
4℃冷冻15000g离心20分钟
↓
上清液即为酶液（5℃下保存一两天内备用，中短期用-20℃保存）
2．ASA.GSH母液提取：
0.1g叶片加入3ml预冷5%偏磷酸溶液
↓
4℃冷冻14000g离心10分钟
↓
上清液即为母液（5℃下保存备用）
（偏磷酸可显著沉淀蛋白质和保护ASA）
酶液提取所需试剂：
PVP（聚乙烯吡哆烷酮）：
1%（1g溶于100ml水），1000ml需称取10g，此处用PBS
EDTA-Na2:
0.1mmol/L（37.2mgEDTA-Na2溶于1000ml蒸馏水），此处用PBS
PBS（缓冲液）配制方法：
①Na2HPO4·12H2O②NaH2PO4·2H2O
取①71.64g，蒸馏水定容至1L，取②31.21g定容至1L，放置4℃冰箱备用
PH=7.8取①91.5ml+②8.5ml=100ml（浓度0.2mol/L）
需要0.05mol/L→将上述溶液烯释至400ml（0.2mol/L*0.1=0.05mol/L*V）
母液提取所需试剂：
5%偏磷酸：
称5g纯偏磷酸，定容至100ml蒸馏水（需加热溶解，温度在50-60℃）偏磷酸有剧毒
（偏磷酸难溶解，先得用研钵提前研碎，后用磁力搅拌器溶解一到两天后再定容）
（现所用为38%HPO3，所以需称65.7895g，定容至500ml）
三．实验步骤
实验1：
MDA含量测定
1.1所需试剂：
10%三氯乙酸（TCA）（纯）称10g定容至100ml
0.25%硫代巴妥酸（纯）称0.25g用10%TCA定容至100ml
（配制时，可一次完成，先配TCA，不要定容，再加入硫代巴比妥酸，然后定容，若难溶解，可以在磁力搅拌器上微热）
1.2步骤：
取0.3g叶片，加4ml磷酸缓冲液研磨，
加入4ml0.25%的硫代巴比妥酸（溶于10%的三氯乙酸）溶液
↓摇匀
95℃加热15分钟
↓快速冷却
3000g离心15分钟
↓
取上清测定OD532，OD600，OD450值
↓
按公式求MDA浓度=6.45×（OD532-OD600）-0.56OD450（μmol/L）
可溶性糖浓度=11.71×OD450（mmol/L）
最后计算MDA含量（μmol/gFW）=[4×（MDA浓度x）×10-3/0.1]
同时，可测得可溶性糖含量（mmol/gFW）=4×（可溶性糖浓度χ）×10-3/0.1
（用多波长测定，在测定之前一定要矫正基线，公式中的参数可以直接在分光光度计上输入）
注意：
以0.25%的硫代巴妥酸溶液作空白调零
MDA含量测定的改进
1.可以用做酶活性时提取的酶液来直接测定MDA含量，用量可以定为1.0、1.5或2.0（较好）ml。
2.硫代巴妥酸溶液改为0.5%的硫代巴比妥酸（溶于20%的三氯乙酸）溶液。
实验2：
可溶性蛋白含量
（参照Bradford方法测定），以BSA作为标准蛋白（牛血清蛋白）
2.1所需试剂及配制：
牛血清蛋白（BSA），考马斯亮蓝G-250，95%乙醇，85%磷酸
考马斯亮蓝G-250蛋白染色剂的配制：
称取100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，最后蒸馏水定容到1L，混匀，放置过夜，过滤后贮放在棕色瓶中，常温下可放置一个月。
●标准曲线制作：
①标准溶液配制：
称取10mg牛血清蛋白标准液，溶于蒸馏水，定容至100ml，制成100μg/ml的标准液，4℃下保存备用。
（必须是牛血清蛋白向水中溶解，不能颠倒）
②取6支具塞试管（10ml），按下表配制含0-100μg/ml的牛血清蛋白液各1ml（★调零管）
★1
2
3
4
5
6
蛋白标准液（ml）
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
蒸馏水（ml）
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
蛋白含量（μg）
0
20
40
60
80
100
③各试管加入5mlG-250染色剂，翻转混合，放置2分钟，595nm比色，绘制过原点标准曲线（方程式）。
（相关系数要两个9以上）
2.2步骤：
①标准曲线（参考邹琦）（595nm比色）
注意：
制作通过原点的标准曲线，以含0μg蛋白质液调零
②取0.1g样品，加5ml蒸馏水提取，5000g离心10分钟，取上清1ml测定
③1ml样液+5mlG-250液盖塞翻转混合数次，最后595nm比色，直接从标准曲线读含量。
（此方法反应十分迅速，2分钟即达到平衡，其结合物在室温下1小时内保持稳定）
实验3：
SOD酶活性
3.1步骤：
1.取50μl酶液
①加入2ml39mmol/L甲硫氨酸（Met）
②2ml0.225mmol/LNBT,（氮蓝四唑）
③1ml0.6mmol/LEDTA-Na2（①②③可以配制在一个试剂瓶里）
④1ml0.012mmol/L核黄素，摇匀。
（现配现用）
2．（人工培养箱内）4000Lχ日光灯下放置30分钟后，温度控制在30℃，于暗处终止反应。
（用大烧杯套着小烧杯，将试管放在同心圆内，每隔5min转过90度，转四次。
对照（不加酶液）每次至少对称地放3支，调零的不照光和不加酶液）
3．560nm处测吸光值，酶活性以抑制NBT光反应50%为一个酶活单位表示。
（实验中可将除酶液和核黄素外其它试剂按比例混合好后，一次加入5ml，然后依次加入核黄素和酶液，以不加酶液的照光管为对照。
）
3.2所需试剂：
dl-甲硫氨酸（Met）39mmol/L1.1638g/200ml
NBT0.225mmol/L（0.01840克）/100ml0.0368g/200ml
EDTA-Na20.6mmol/L0.0223g/100ml
核黄素0.012mmol/L0.0045g/L或0.0045g/100ml用时稀释10倍
各试剂溶液均在用前配置，配置好后均应避光保存，尤其是核黄素，必须随用随配，避光保存。
试验进行时一次性加5ml的反应混合液配置方法：
Met+NBT+EDTA-Na2
200mll+200ml+100ml
SOD酶测定时，酶液量50μl偏少，改为100μl为佳，另外反应时间30分钟过长，改为20分钟适合。
SOD活性（酶单位u/gFW）=（A0-A1）*V/A0*0.5*FW*a
A0---对照照光管光吸收值；A1---样品管光吸收值。
V---样液总体积（ml）5mlFW---鲜重（g）1ga---测定用样品的量（ml）0.1ml
实验4：
CAT活性（过氧化氢酶）
4.1所需试剂：
①PBS（PH=7.0）50mmol/L（61份50mmol/lNa2HPO4,39份50mmol/lNaH2PO4）
②15mmol/LH2O2（以30%H2O2配）
（取85.2μL30%H2O2，以50mmol/LPBS（（PH7.0）定容至100ml）
4.2步骤：
1.3ml50mmol/LPBS（PH7.0）加入50μl酶液
（加比色杯的盖子摇2-3下，让酶液与缓冲液充分分散）
再加入5μl15mmol/LH2O2摇匀（加比色杯的盖子摇2-3下，让酶液与缓冲液充分分散）。
2．240nm处作时间扫描（每0.5分钟测1次，共测3分钟）
3．CAT活性以每分钟消耗1μmol的H2O2为一个酶活单位。
活性计算改动：
（以每分钟OD值减少0.01为一个酶活单位u）（2005和2006年均是按OD值减少0.01算的）（以每分钟OD值减少0.1为一个酶活单位u）
注意：
以PBS作空白调零50mmol/L
实验5：
APX活性（抗坏血酸过氧化物酶）（即ASA—POD活性）
5.1所需试剂：
ASA（分子量167.12）0.3mmol=0.052836（g）
（乙=胺四乙酸=钠）EDTA—Na2（以PBS配成0.1mmol/L=0.0372（g）/L）
50mmol/LPBS（pH7.0）
9mmol/LH2O2（以30%H2O2配制）
（51μl30%H2O2定容至100ml）
计算为：
K1=2.8，K2=3，K3=-1，K4=100
可得到总取样（5ml酶液或1g样）的最终活性。
酶活性单位为μmol/g（鲜重）·min
以后APX活性测定可参考沈文飚：
抗坏血酸过氧化物酶活性测定的探讨
3ml反应液中含50mmol/LPBS,pH7.0,0.1mmol/LEDTA（或EDTA—Na2），0.1mmol/LH2O2，0.5（或0.3）mmol/LAsA，最后加入适量酶液（20、50、100ul均可）启动反应，连续记录测定室温下290nm吸收值的变化。
以不加H2O2作为对照，H2O2本身对AsA的氧化作用在测定时间内由于吸收值变化太小可忽略不计。
室温下每分钟氧化1umolAsA的酶量作为一个酶活性单位（U）（吸光系数为2.8mmol/Lcm）
5.2步骤：
1.配反应液（50mmol/LPBS（pH7.0），内含0.1mmol/LEDTA—Na2，含0.3mmol/LASA）
2.样品池加入3ml反应液，加入50μl酶液，最后加入5μl9mmol/LH2O2
（盖上比色杯的盖子摇匀，2—3次）
在290nm处作时间扫描，每10秒测一次，共测30秒。
（注意：
在测定中消光值应该是不断减小的）
3.根据OD290值变化，计算单位时间内AsA消耗量，（ASA氧化消耗量按消光系数2.8mmol/L·cm。
），酶活性以单位时间每消耗1μmol的ASA为一个酶活单位，最后计算样品的APX活性（单位为：
U/g（鲜重）·min）。
（活性计算改动）根据OD290值变化，计算单位时间内AsA减少量（ASA氧化量按消光系2.8mmol/L·cm），并计算样品APX终活性。
酶活性单位为μmol/g（鲜重）·min
实验6ASA含量测定
6.1步骤：
1.取样品母液0.2ml,1.4ml，75mmol/lNaH2PO4溶液（pH值7.4）（2.34gNaH2PO4·2H2O定容至200ml，用NaOH将pH调至7.4）混合；（75mmol/lNaH2PO4溶液亦可用150mmol/lNaH2PO4溶液稀释1倍得到）
2.依次加入
（1）10%偏磷酸（26.3158g38%偏磷酸定容至100ml）0.4ml;
（2）44%磷酸（26ml85%磷酸+41ml蒸馏水）0.4ml;
（3）4%2,2’----二联吡啶（称取4.0g2,2-二联吡啶用70%酒精定容至100ml）0.4ml;
70%酒精配制（95%乙醇70份重量+蒸馏水25份重量）
3%FeCl30.2ml（称取5.0gFeCl3·6H2O定容至100ml），摇匀，于37℃保温1.0h（5）测525nm波长下的光吸收值
4.以标准曲线方程计算ASA含量
6.2标准曲线的制作：
（1）称取10mgASA分析纯，以5%偏磷酸定容至100ml,成100微克/毫升的标准液；
（2）按下表取8支试管，按照表中的程序加液
试管编号
1
2
3
4
5
6
7
8
标准液（ml）
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
5%·偏磷酸（ml）
0.20
0.18
0.16
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
ASA含量（微克）
0
2
4
6
8
10
12
14
按前面步骤1、2所述依次加入各反应液，最后测525nm波长下的光吸收值，作过原点标准曲线，求线性方程。
实验7：
GSH含量测定
7.1步骤：
1.取样品母液0.2ml，加入150mmol/LNaH2PO4溶液（pH7.7）（11.70gNaH2PO4·2H2O定容至500ml用氢氧化钠调pH至7.7）2.6ml
2.混匀再加入0.2mlDTNB溶液（=硫代硝基苯甲酸DTNB75.3mg溶于30ml0.1mol/L磷酸缓冲液pH6.8）摇匀。
[实际配置时，称75.3×2=150.6mg，即0.1506gDTNB溶于60mlPBS中]
3.在30℃保温5分钟，测定412nm波长下的光吸收值。
【有些文献（如龚吉蕊、於丙军）方法同样用DTNB显色，都是在常温下显色30分钟因此可将反应时间适当延长至10分钟】
7.2根据标准曲线（GSH）方程，计算GSH含量。
标准曲线制作：
1.称取100mgGSH分析纯，以5%偏磷酸定容至100ml，成1mg/ml即1000ug/ml的标准液。
2.参照实验6标液方法。
试管编号
1
2
3
4
5
6
7
8
标准液（ml）
0
0.02
0.04
0.06
0.08
0.10
0.12
0.14
5%·偏磷酸（ml）
0.20
0.18
0.16
0.14
0.12
0.10
0.08
0.06
GSH（微克）×
0
2
4
6
8
10
12
14
正确GSH含量（微克）
0
20
40
60
80
100
120
140
3.以GSH含量为0的溶液调零，制作过原点标准曲线（及方程）
所需试剂：
NaH2PO4（150mmol/L）→称23.41gNaH2PO4·2H2O定容至1L（或称5.85定容至250ml）
DTNB（二硫代硝基苯甲酸）0.1mol/LPBS（PH6.8）（参照邹琦的书）
实验8：
脯氨酸测定
8.1步骤：
1.取0.5g叶片，用5ml3%磺基水扬酸溶液提取，匀浆液在沸水浴浸提10分钟，冷却后，以3000g离心10分钟，上清液待测。
2.取2ml待测液，加入2ml蒸馏水，再加入2ml冰乙酸和4ml2.5%茚三酮溶液，置沸水溶显色60min，冷却后，加入4ml甲苯充分振荡提取红色物后，静置后，取甲苯相（将移液枪的量程调至3.0ml吸取甲苯相，注意不要将枪伸到水相中。
）测定520nm，波长处的吸收值，依据标准曲线计算含量。
8.2标准曲线制作：
1.标准液配制；准确称取25mg脯氨酸，用蒸馏水溶解后定容至250ml，其浓度为100μg/ml，再取10ml此液，蒸馏水定容至100ml，即为10μg·ml-1的脯氨酸标准液。
（脯氨酸标准液最好现用现配，放在冰箱也易变性）
2.取7支20ml具塞试管按下表加入各试剂
1
2
3
4
5
6
7
标准脯氨酸（ml）
0
0.2
0.4
0.8
1.2
1.6
2.0
H2O（ml）
2
1.8
1.6
1.2
0.8
0.4
0
冰乙酸（ml）
2
2
2
2
2
2
2
显色液（ml）
4
4
4
4
4
4
4
脯含量（ug）
0
2
4
8
12
16
20
3%磺基水杨酸（ml）
2
2
2
2
2
2
2
3.置沸水浴中显色60min。
冷却后（以后步骤同前）依据测定值绘制造原点标准曲线（以脯含量为0的试管作空白调零）为方程。
8.3所需试剂：
★3%磺基水杨酸水溶液（称3g磺基水杨酸，蒸馏水定容至100ml）
★甲苯★85%磷酸★冰乙酸
★2.5%酸性茚三酮显色液称取2.5g茚三酮，加入60ml冰乙酸和40ml6.0mol/L磷酸。
贮于棕色瓶，4℃下2~3日有效。
实际配置时，需称10g，配制400ml（其中冰乙酸240ml，磷酸160ml6mol/L磷酸液（40.8ml85%磷酸定容至100ml）实际配制时81.6ml定容至200ml（68ml85%磷酸定容至1升，为1mol/L的磷酸液）
实验9过氧化氢（H2O2）含量测定方法：
参考以下文献：
张峰,杨颖丽,何文亮等：
盐胁迫过程中抗坏血酸对植物的保护功能。
西北植物学报2004
龚吉蕊等：
干旱胁迫下几种荒漠植物植物抗氧化能力的比较研究。
西北植物学报2004
9.1步骤：
取0.5g叶片,加入预冷3%的三氯乙酸（TCA）研磨,12000g离心20min,取1mL上清加入等体积10mmol/l磷酸缓冲液,pH7.0,和2mL1mol/L的KI,摇匀,390nm测吸光值.
结果以ng·g-1;FwG表示L用溶3%的三氯乙酸的H2O2,50～200ng/mL,作标准曲线
实验10超氧阴离子测定方法：
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