冻融后小鼠休眠胚胎超微结构的研究.docx

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冻融后小鼠休眠胚胎超微结构的研究

研究报告

冻融后小鼠休眠胚胎超微结构的研究

顾美超，卢天罡，刘云海，倪和民，张劭俣，翟椿东，邢书涵，郭勇*

（北京农学院动物科学技术学院，北京102206）

【摘要】目的观察小鼠休眠胚胎与正常孵化期胚胎在细胞连接和各细胞器形态与分布上的差异，以及冻融培养后的变化，从亚细胞超微结构的角度揭示其抗冻能力优于正常孵化胚胎的原因。

方法利用透射电子显微镜观察各类小鼠胚胎的超微结构，并进行相关比较分析。

结果通过亚细胞结构对比分析发现：

冷冻前小鼠休眠胚胎为紧缩状，处于能量代谢较低的“基态”，通过冻融后培养，细胞器结构恢复与正常孵化胚胎冷冻前相似。

异染色质减少，甚至消失；而正常孵化胚胎经过冻融后，线粒体数量减少，细胞核松散甚至碎裂，异染色质增多。

结论小鼠休眠胚胎与正常孵化胚胎冻融后相比，其细胞状态更有利于物质储存及能量代谢，表明小鼠休眠胚胎从亚细胞超微结构的角度比其正常孵化胚胎更具抗冻性。

【关键词】小鼠；休眠胚胎；超微结构；冻融

Studyontheultra-structureofmousedormantembryos

Culturedinvitroafterfrozen-thawn

GUMei-chao,LUTian-gang,LIUYun-hai,NIHe-min,ZHANGShao-yu,ZhAIChun-dong,XINGShu-han,GUOYong*

（CollegeoftheAnimalScienceandTechnology,BeijingUniversityofAgriculture,Beijing102206,China）

*:

correspondenceauthor:

GUOYong

[Abstract]ObjectiveInthisstudy,itwasaimedtoinvestigatethedifferencesofthecelljunction,cellularorganellesmorphologyanddistribution,aswellasbeingculturedinvitroafterfrozen-thawnbetweennormalmousehatchedblastocystsandtheirdormantones,andthen,torevealthereasonfromtheultra-structureabouthowtheirdormantembryosinitiatedbetteranti-freezingshockeffectthanthosenormalhatchedonesdid.MethodsBytransmissionelectronmicroscope,theultra-structureofthesetwodifferenttypesofmurineembryoswasobservedandanalyzedrespectively.ResultsBythecomparativeanalysisoftheirultra-structures,theresultsshowedthatthedormantembryosbeausterityandlowerenergymetabolismat‘groundstate’.Itscellularstructureseemedtobesimilartothenormalembryosculturedinvitroafterfrozen-thawn.Theheterochromatindecreasedordisappeared,aswellasthenumberofmitochondriadecreased,andthenucleusofthosenormalhatchedblastocystsafterfrozen-thawn,werelooseandfractured.Inaddition,theirheterochromatinalsoincreased.ConclusionCollectively,itcanbeconcludedthatthesatisfiedcellularultra-structureofmousedelayedembryos,canimprovetheirembryonicmaterialstorageandenergymetabolismafterfrozen-thawnmoreeffectivelythanthosenormalhatchedones.Thisalsoimpliedthatmousedormantembryosplayapositiveroleforembryonicanti-freezing.

【Keywords】Mouse;Dormantembryo;Ultra-structure;Frozen-thawn

[基金项目]基金项目：

2013年度北京市教委北京市属高等学校创新团队建设与教师职业发展计划项目“体细胞转基因克隆肉牛新品系培育与利用”（项目批准号:

PXM2013_014207_000067）；2013年度国家自然基金面上项目“牛体内外植入前胚胎IFNτ的差异表达及对子宫上皮细胞ISG15和Wnt7a表达的体外诱导（项目批准号:

31272526）

[作者简介]顾美超（1988年-），女，硕士生。

E-mail:

gumeichao@

[通讯作者]郭勇，男，教授。

E-mail:

y63guo@

动物的胚胎休眠又称为胚胎滞育或胚胎的不连续发育，在哺乳动物上称为延迟植入,它是一种进化方式，以此来保证野生动物在极端环境条件下的繁殖成功率。

一旦休眠终止，囊胚恢复新陈代谢活性，细胞又开始增殖，囊胚着床并继续发育。

胚胎滞育现象可以最大限度的提高哺乳动物繁殖成功率,并尽量使后代在气候适宜且食物充足时出生[1]。

因此针对哺乳动物的休眠胚胎进行较广泛的相关生物学研究具有一定的理论意义和潜在应用价值[2,3]。

虽然目前国际上对小鼠等哺乳动物休眠胚胎的相关研究取得了巨大进展，但针对此类特殊胚胎进行冷冻及解冻复苏后形态及其亚细胞结构上的研究尚未见到报道。

2008年，本实验室卢天罡等人首次发现：

小鼠休眠胚胎冷冻-解冻后经体外培养的复苏率显著高于正常孵化胚胎[4];有鉴于此，本研究拟着手于小鼠休眠胚胎经程序化冷冻-解冻后与正常孵化胚胎进行亚细胞超微结构上的差异比较，为进一步深入研究哺乳动物休眠胚胎冻融后细胞结构变化及抗冻剂研制，尤其是为动物低温生物学方面的研究提供新的参考途径。

1材料与方法

1.1实验动物

本实验选用8~12周龄雌性成熟，体重为26~28g左右的ICR系小鼠，购自北京维通利华实验动物科技有限公司【SCXK（京）2012－0001】。

1.2实验试剂与器材

胚胎冷冻保护剂，购自ICPbioReproduction，货号：

101129，新西兰；戊二醛，购自sigma，货号：

CAS：

111-30-8；丙酮，购自sigma，货号：

CAS：

67-64-1；锇酸，购自sigma，CAS:

20816-12-0，均为美国；普通光学显微镜：

Nikon，YS2-H，日本；胚胎冷冻仪：

Cryobath；超薄切片机LeicaUc6i，德国，透射电镜JEM-1230，日本。

1.3实验方法

1.3.1超排处理

选择阴门淡粉色的雌性鼠，腹腔注射PMSG10IU/只，48h后注射hCG10IU/只，之后立即与成年公鼠1:

1合笼过夜交配，次日早8点检查交配情况，见阴道栓者即可用于实验。

1.3.2休眠胚胎的获取

于见栓的第四天上午9点摘除小鼠的双侧卵巢，之后连续三天在其颈部皮下注射0.2mg/mL的孕酮0.1mL，术后第四天即可从其子宫中回收休眠胚胎。

1.3.3胚胎的程序化冷冻、冷冻后胚胎的收集及解冻方法

将获得胚胎用PBS清洗两遍，然后三步法脱去PBS再放到冷冻液中清洗两遍，然后装管。

详见卢天罡硕士论文[4]。

把装好的细管放入冷冻仪中，以1℃/min得速度降到-5℃时，平衡10min，然后用预冷的镊子在细管上端进行植冰，平衡10min后，以0.3℃/min的速度直至降到-35℃。

解冻时把冷冻细管从液氮中取出，在室温下轻轻晃动5s～10s后，投入到35℃水中10s取出。

剪掉麦管两端的栓部，将细管里的胚胎置于含有1.0M/L蔗糖溶液的表面皿中，按三步法脱去冷冻液。

1.3.4小鼠胚胎固定、包埋和超薄切片的制备

前固定：

将胚胎移至小培养皿中，加入0.5%甲醛及3%戊二醛混合溶液固定1h，0.1M磷酸缓冲液清洗3次，5min/次。

后固定：

1%锇酸固定1h后，用0.1M磷酸缓冲液清洗2次，5min/次。

预包埋：

用3%～4%琼脂预包埋,待琼脂凝固后，将含胚胎的琼脂切成1mm3左右的小块，移至干净的青霉素小瓶中。

切片观察：

标本经系列酒精脱水，环氧丙烷过渡，环氧树脂Epon812浸透、包埋、聚合、LKB-型超薄切片机切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅双重染色，干燥后透射JEM-1230电镜下观察。

2结果

2.1正常孵化期胚胎

2.1.1滋养层细胞连接

正常孵化期囊胚腔滋养层细胞及内细胞团周围的滋养层细胞的形状呈圆形或者近似的正立方体型，形状均一。

细胞间滋养层细胞之间可见紧密连接结构，且分布均匀，偶尔见到指状结构，但是并无相嵌的并指状结构。

2.1.2细胞核

正常孵化期胚胎的滋养层细胞核和内细胞团细胞核形态相似，大多数呈近似的圆形，边缘比较平缓，只有很小的起伏和凹凸（图3）。

细胞核由两层核膜包裹，有一个或者两个高密度的核仁，常染色质布满整个细胞核，异染色质分布较少，聚集在核膜周围，核周隙明显。

2.1.3细胞器

正常孵化胚胎细胞的胞质中有大量圆形或椭圆形的线粒体，分布在滋养层细胞核内细胞团细胞质中。

在成熟的线粒体中，线粒体嵴密集且清晰可见。

胞质中分布丰富的核糖体颗粒，粗面内质网上也附着核糖体，可见多聚核糖体。

发现有粗面内质网与线粒体相互连接的结构。

高尔基体呈弓形或半球形的囊泡状堆积在一起，其突出面对着内质网（形成面），凹进的一面对着质膜（成熟面或反面）。

在正常孵化期胚胎的滋养层细胞核内细胞团细胞中分布着大量的脂滴和空泡。

脂滴大小不一，在0.5μm~2μm之间。

2.2休眠胚胎

2.2.1滋养层细胞连接

在电子显微镜下，休眠胚胎囊胚腔滋养层细胞和覆盖在内细胞团上的滋养层细胞在形态上都被拉长了，呈长条状。

细胞间的指状结构变的钝圆，并有像微绒毛样的手指样结构伸向临近的细胞，这种手指样结构相互嵌合起来形成并指样结构，与紧密连接黏合斑和桥粒共同组成休眠胚胎滋养层细胞的细胞连接（图2）。

2.2.2细胞核

休眠胚胎滋养层细胞核边缘不平整，有较多凹陷，其中较深的凹陷形成裂缝，异染色质数量较多，分布在核膜周围，颜色较深，容易辨认。

细胞核核仁明显，未发现有两个或两个以上核仁的情况（图3）。

2.2.3细胞器

在休眠胚胎上发现有直径达到6微米的大型脂滴。

内细胞团细胞和滋养层细胞质中核糖体数量较少，偶然可以发现核糖体聚集成多聚核糖体。

（图4）。

2.3正常孵化胚胎冻融后培养24h后

2.3.1滋养层细胞连接

正常孵化期胚胎经冻融后培养24h，与冷冻前相比，滋养层细胞形态变化不大，内细胞团细胞间结构较冷冻前松散，细胞间连接没有冷冻前紧密，有较大的缝隙。

冻融后胚胎细胞，尤其是滋养层细胞细胞质有大量的空泡。

有的细胞的细胞质几乎被网状的大小不一的空泡所占据。

滋养层细胞之间连接可见到模糊的紧密连接结构，与冷冻前相比变化不大。

胚胎表面微绒毛变长，数量增加，但形态依旧不规则。

经过48h的体外培养，滋养层细胞连接方式与培养前无变化。

2.3.2细胞核

与冷冻前相比，正常孵化期胚胎细胞核变化非常明显，细胞核形态不规整，尤其是内细胞团细胞核，有的甚至出现多道裂缝，偶然可以见到两个核仁的情况，异染色质相比冷冻前明显增多。

核周隙较冷冻前明显（图6）。

48h后孵化胚胎细胞核与24h后状态相同。

2.3.3细胞器

经过冻融培养后的正常孵化期胚胎，线粒体虽然数量较冷冻前无明显变化，但大部分线粒体嵴不清晰，数量较少，有的线粒体嵴消失，观察中发现有部分线粒体中存在空泡和高密度物质，部分线粒体膜发生破损，内容物流出。

线粒体常与粗面内质网连接，粗面内质网数量较冷冻前有所增加，形态上变粗膨胀。

粗面内质网上附着核糖体颗粒，细胞质中核糖体分布不均匀，有的区域有很多核糖体分布，而有的则较少或者没有，可发现多核糖体（图7）。

2.4休眠胚胎冻融后培养24h后

2.4.1滋养层细胞连接

休眠胚胎经过冻融培养后滋养层细胞变厚，由冷冻前的长条状变化成立方体状或近似的圆形，只有覆盖在内细胞团上的滋养层细胞仍然呈长条状，冷冻前滋养层细胞间并指状结构消失（图5），指状结构不再伸展，收缩在连接部位，可见到紧密连接斑，细胞间连接较冷冻前紧密，内细胞团各细胞连接紧密，无较大缝隙。

经过48h培养后，与冻融培养24h后结果相似（图8）。

2.4.2细胞核

与冷冻前相比，休眠胚胎细胞核裂缝消失，凹凸较平缓，大量的异染色质消失，核周隙明显，偶然可见两个核仁的细胞核（图6）。

培养48h后，细胞核裂缝消失，细胞核外缘平整，细胞核内大量异染色质消失，核周隙明显（图9）。

2.4.3细胞器

与冷冻前相比，细胞内线粒体数目有显著增加，线粒体比较清晰，但是有很多横断现象，呈颗粒状，偶尔见到空泡状的线粒体。

粗面内质网数量与冷冻前相比，数量明显增加，有粗面内质网池与线粒体相连。

高尔基体数量较冷冻前也有增加。

细胞质中核糖体分布广泛，时常可见多核糖体。

脂滴的数量和体积较冷冻前都明显减少（图7）。

培养48h后，大型脂滴消失且数量减少。

核糖体分布广泛，可见多核糖体。

图1A小鼠休眠胚胎中的大型脂滴，直径达到6µm。

图1B小鼠正常胚胎中的脂滴。

Fig.1A Thelarge lipiddropletis6µmindiameterinmousedormantembryo.

Fig.1BThelipiddropletinthemousenormalembryo.

图2A休眠胚胎滋养层细胞间连接，并指样咬合结构（白箭头），紧密连接斑（黑箭头）。

图2B正常胚胎滋养层细胞间连接，紧密连接斑（黑箭头）。

Fig.2AThefinger-likestructure（whitearrow）andtightjunction plaque （blackarrow）areconsistofclosejunctionsbetweentrophoblastcellsinthedormant embryo.

Fig.2BThe cellconnectionand tightjunctionplaque （blackarrow）areinthe normal trophoblastcells.

图3A休眠胚胎细胞核，有多道裂缝（白箭头），大量的异染色质（黑箭头）。

图3B正常胚胎细胞核，边缘比较平缓，只有很小的起伏和凹凸。

Fig.3AAlotof heterochromatin （blackarrow）andcomplex cracks （whitearrow）inthecellnucleusofdormantembryo.

Fig.3BTheedgeofthenucleusisgentle. Small fluctuations andbumpareinthenormal embryo.

图4A休眠胚胎细胞器，空泡（V）,线粒体（M）,内质网（ER）,高尔基体（黑箭头）。

图4B正常胚胎细胞器，线粒体（M）,内质网（ER）,细胞核内大量的异染色质（黑箭头）。

Fig.4A  Mitochondria （M）,endoplasmicreticulum（ER）,golgiapparatus（black arrow）andvacuoles （V）inthedormantembryo.

Fig.4B Mitochondria（M）, endoplasmicreticulum（ER）andalotofheterochromatin（black arrow）inthenormalembryo.Lipiddroplet（LD）.

图5A休眠胚胎冻融后培养24h，滋养层细胞间连接（黑箭头），并指状结构收缩，细胞间距离紧密，线粒体（M）。

图5B正常胚胎冻融后培养24h，滋养层细胞间连接（黑箭头），结构变得疏松，可见大面积细胞质空泡区。

Fig.5AThedormantembryosafterfrozen-thawn arecultured invitrofor24h.Theconnectionsarebetweenthetrophoblastcells（blackarrow）.The finger-likestructureshrunk.Intercellular distancebecome close.Mitochondrial （M）.

Fig.5BThenormal embryos afterfrozen-thawnare culturedinvitrofor24h.theconnectionsarebetweentrophoblastcells（blackarrow）.Thestructure becomeloose. Therearemanycytoplasmicvacuolesdistricts.

图6A经过冻融后培养24h休眠胚胎细胞核，与冷冻前相比，休眠胚胎细胞核裂缝消失，凹凸较平缓，大量的异染色质消失，核周隙明显。

图6B经过冻融后培养24h正常胚胎细胞核，与冷冻前相比，细胞核形态不规整，尤其是内细胞团细胞核，有的甚至出现多道裂缝（白箭头），有大量的异染色质存在（黑箭头）。

Fig.6AThedormantembryosafterfrozen-thawnareculturedinvitrofor24h.Thecracksofnucleusdisappeared.Thebump isgentle, abundantheterochromatin disappearedandperinuclearcisternabecomeobvious.

Fig.6BThenormalembryosafterfrozen-thawnareculturedinvitrofor24h. Comparedwiththe prior, thenucleusshape isirregular, especiallytheinnercellmassof thenucleus,andtheemergenceof multiplecracks （whitearrow）.Thereareplentyof heterochromatin （black arrow）.

图7A经冻融后培养24h休眠胚胎细胞器，线粒体嵴清晰可见，有断裂（M），丰富的内质网（ER）,丰富的核糖体（R）,并可见多核糖体（PR）。

图7B经冻融后培养24h的正常胚胎细胞器，线粒体嵴消失，常常含有空泡或者内容物（黑箭头），内质网肿胀（ER）。

Fig.7AThedormantembryosafterfrozen-thawnareculturedinvitrofor24h.Themitochondrialcrista becomeclearlyvisible,butsomefractured（M）.Therearemany endoplasmicreticulum （ER） andabundantribosomes （R）.Thepolysomes arevisible（PR）.

Fig.7BThenormalafterfrozen-thawnembryosareculturedinvitrofor24h. Themitochondrialcristaedisappeared.Thevacuoles （black arrow）andendoplasmicreticulum （ER）intheembryo.

图8A休眠胚胎经过48h体外培养后，滋养层细胞连接方式发生了较大变化，并指状结构消失，指状结构不再伸展，收缩在连接部位（黑箭头）可见到紧密连接斑。

图8B正常孵化胚胎经过48h体外培养后，滋养层细胞连接方式未发生变化（黑箭头）。

Fig.8AThedormantembryosafterfrozen-thawnareculturedinvitrofor48h.Theobviouslychangeshavetakenplaceinthe connectionofthetrophoblastcells,thefinger-likestructure shrunk（blackarrow）. Thejointcanbeseenthe connection spot.

Fig.8BThenormalembryosafterfrozen-thawnareculturedinvitrofor48h.Theconnectionoftrophoblastcellsdon’tchangethanbeforefrozen （blackarrow）.

图9A休眠胚胎经过48h体外培养后，细胞核裂缝消失，细胞核外缘平整，细胞核内大量异染色质消失（黑箭头），核周隙明显。

图9B正常孵化胚胎经过48h体外培养后，细胞核中的异染色质相比培养前明显增多（黑箭头），有的出现多道裂缝。

Fig.9AThedormantembryosafterfrozen-thawnareculturedinvitrofor48hThenucleusof edge cracks become flat, alotof heterochromatin disappeared（blackarrow）.The perinuclearcisternasbecomeobvious.

Fig.9BThenormalembryosafterfrozen-thawnareculturedinvitrofor48h.Thenucleusheterochromatin increasedsignificantly （blackarrow）, some cracksarevisible.

3讨论

胚胎休眠现象广泛存在于各种动物，但现在已知