定量蛋白组学Word格式文档下载.docx

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通过了解这些功能活动变化的过程，或许可以揭示为什么“健康”细胞有别于“疾病"

细胞和细胞为什么有不同的行为方式。

蛋白质组学研究的一项关键内容，是在对比环境下对蛋白质的差异表达进行准确的定量分析，通过比较正常与异常细胞或组织中蛋白质表达水平的差异，进而找到此环境下密切相关的差异蛋白所引发的疾病，从而确定多种致病因子在对机体作用时最重要的靶分子，为临床诊断、病理研究、药物筛选、新药开发、新陈代谢研究等提供理论依据[2]’。

过去，主要采用二维差异凝胶电泳（DIGE）技术分析蛋白质的差异表达。

近年来发展起来的一种稳定同位素标记（Stable~sotopeLabeling）质谱分析技术，因其使用稳定同位素标记，使得质谱检测更具特异性，加之质谱分析固有的准确性和采用束流检测后的高度灵敏性，使其在低丰度蛋白质的分析中展现出良好的应用前景[3-7]。

基于质谱技术，稳定同位素标记技术定量分析蛋白质表达水平获得了很大进展。

它是在两套对比标本中用同一核素的不同稳定性同位素标记蛋白或多肽。

通常是用富含某种重质同位素（比如：

2H、13C、15N、18O）的试剂标记与被分析肽段相同的肽段作为其内标物，被分析肽段则与正常的同种试剂（即其中所有元素的含量皆为天然丰度）结合。

内标肽段与被分析肽段（组成为一个“分析对”）除了在质量上相差确定的几个单位外，其他的物理、化学性质几乎完全相同，在标记后的诸多分离纯化过程中，其行为很相似，由于质量数的差异，在质谱图上表现为一对峰，峰的间距由内标物所含的重质同位素的个数决定。

目前，各种不同的稳定同位素应用范围极广，而且在蛋白质组实验的不同阶段，它可以和化学方法或生物方法一起使用[8]。

1999年，cygi等建立了同位素亲和标签（isotope-codedaffinitylag，ICAT）技术，为发展定量蛋白质组学提供了一个广阔的空间，ICAT试剂由3部分组成，既特异结合肽段中半胱氨酸残基的巯基、可引入稳定同位素的连接子和生物素（biotin）亲和标签。

试剂分为2种形式，分别被称为“重”质（连接子含有8个氘原子，D8）和“轻”质（连接子含有8个氢原子，DO）试剂；

由8个氘原子与8个氢原子分别标记的ICAT质量正好相差80a。

ICAT技术在定量蛋白组学中广泛应用，但他也存在一些缺点：

首先，这一方法无法分析不含半胱氨酸的蛋白质；

第二，ICAT标记（一500Da）在整个MS分析过程中保留在每个肽上，会影响肽段的检测和增加数据库搜索算法的复杂性，对一些小的肽段（小于7个氨基酸残基）更是如此，而对其二级质谱碎片离子解析增加了难度；

第三，被标记的2个多肽相差8、含有2个半胱氨酸的多肽相差16时与氧化很难区分，对定量和鉴定都带来难度；

第四，一般ICAT定量的误差在200以内，但如果样品成分复杂，定量误差会增大，并往往需要手工检查结果：

第五，这种方法要获得完整的信息，最重要的是标记必须是特异、完全的，但当前标记的效率是时间依赖性的，很少能达到80％以上。

现在国外有许多报道另外一种定量蛋白组学的方法n耵：

SILAC（stableisotopelabe~ingbyaminoacidsincellculture）。

用同位素标记必需氨基酸，将它加到缺乏此氨基酸的培养基。

用此培养基培养细胞，经过细胞代谢，标记的氨基酸融合到蛋白中，形成内码子。

此方法有许多优点：

第一，SILAC不像ICAT有化学标记的参与；

第二，SILAC省去了亲和纯化这一复杂的工作；

第三，SILAC适用于几乎所有细胞的培养，包括原代细胞；

第四，SILAC操作比较方便，并且相对比较便宜。

Fig.2.2SILA技术与ICAT技术的比较

国内外对和厚朴酚研究比较多，对于一些作用机制也做了了详细的研究，我们实验室也对和厚朴酚的治疗心血管疾病、抗肿瘤作用等做了大量的研究，

但对于和厚朴酚具体的作用靶点还没有找到。

SILAC技术与质谱结合是一个很好的定量蛋白方法。

本文用和厚朴酚作用于亮氨酸一d3标记的肝癌HepG2细胞，提取蛋白，用质谱鉴定所有蛋白，以13-aetine蛋白为标准（因为13-actine是高度保守蛋白，不会被药物调控），通过定量蛋白组学方法，确定出和厚朴酚调控的蛋白，根据蛋白功能及相关作用，找出和厚朴酚作用于癌细胞的作用机理。

2．2．实验材料

2-2-1细胞株

人肝癌细胞株HepG2由本实验室提供。

2．2．2试剂和材料

所有氨基酸，包括同位素标记亮氨酸：

均购自Sigma公司胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶（Tyrisin）：

均购自美国GibieoBRL公司。

蛋白酶抑制剂（ProteaseInhibitorCocktailforusewithmammalioncalland

tissueextracts）．购自Sigma-Aldrich公司。

蛋白质分子量标准品（Proteinmolecularweightmarker）：

购自MBIFerment,as公司。

十二烷基硫酸钠（SDS）、丙烯酰胺（Acrylamide）、甘氨酸（Glycine）、

TF．MED（N,N,N’N’-四甲基乙二胺）、'

Iris碱（Trisbase）、过硫酸铵、亚甲双丙烯酰胺、考马斯亮蓝19250（Coomassiebrilliantblue（3250）、DTT（二硫苏糖醇）：

均购自美国Bio-Rad公司。

培养基用抗生素：

青霉素、链霉素为国产注射用药。

其他试剂均为进口或国产分析纯产品。

2．2．3实验仪器和设备

低速离心机：

Megafuge1-0，Heraeus。

高速离心机：

Centrifuge5415D，Eppendorf。

高速低温离心机：

AllegraTM25RCnatrifuge，BECKMANCOULTER。

超低温冰箱：

MDF-792，SAra'

O（-80'

c）。

恒温培养箱：

CChlncubator，SANYO。

恒温水浴箱：

PolyScience9505。

高压灭菌锅：

LaboAutoelave，SANYO。

超净工作台：

BiologicalSafetyCabinets，ClassⅡ，NUAIR，SANYO。

倒置显微镜：

CK2，Olympus。

普通光学显微镜：

CH-2，Olympus。

纯水仪：

EAsYpurcUF07412，Millipore。

pH计：

DELTA320pHmeter，METTLERTOLEDO。

超声破碎仪：

VibracellTM，SONICS&

MATERIAISINC。

电子天平：

PL2002，AB265-S，METTLERTOLEDO。

漩涡混合器：

XW-80AVortex，宁波新芝生物科技服务股份有限公司。

脱色摇床：

WD．9405B，北京市六一仪器厂。

垂直电泳仪：

Mini-PROTEIM3CELL，Bio-Rad。

凝胶扫描仪：

GS-800CalibratedDensitometer，Bio．Rad。

质谱仪：

Waters-Q-TOF。

2．3实验方法：

2．3．1实验流程图：

Fig.2.3实验流程图

2.3.2试剂配置

2.3.2.1细胞培养所需溶液的配制

（1）细胞培养基：

DMEM培养其按产品说明，常规过滤除菌后，加入抗生素：

青霉素100U／ml，链霉素100U／ml，4"

C保存。

（2）细胞保种液：

DMSO与胎牛血清（FBS）按l：

9混匀，-20℃保存。

（3）0．25％胰酶消化液：

0．25g胰酶溶解于100ml生理盐水，同时还可加入EDTA0．02g，增强消化能力，常规过滤除菌，4℃保存。

2.3.2.2SDS-PAGE和Westernblot相关试剂和溶液的配制

（1）Tris-甘氨酸电泳缓冲溶液：

25mmol／LTrisbase，192mmoFL甘氨酸（电泳级），0．1％SDS，pH8．3。

（2）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳5％积层胶（2m1）：

蒸馏水1．4ml，30％丙烯酰胺溶液O．33ml，1.0mol／LTris（pH6．8）0．25ml，10％SDSO．02ml，10％过硫酸铵O．02ml，TEMED0．002ml。

（3）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳12％分离胶（7．5m1）：

蒸馏水2．45ml，30％丙烯酰胺溶液3m1，1．5moFLTris（1pH8．8）1．95ml，10％SDS0．075ml，10％过硫酸铵0．075ml，TEIVIED0．003ml。

（4）转移缓冲液：

39mmoFL甘氨酸，48mmol／LTrisbase，0．037％SDS（电泳级），20％甲醇。

（5）磷酸缓冲盐溶液（PBS）：

137mmoFLNaCl，2．7mmoFLKCI，10mmoI／LNa2HP04，2m1110FLKH2P04，蒸馏水配制，用HCl调节溶液的pH值至7．4，保存于室温。

（6）PBST：

含O．05％Tween20的PBS。

（7）2~SDS凝胶加样缓冲液：

100mmoFLTris·

CI（PH6.8），200mmoFL二硫苏糖醇（DTT），40／oSDS（电泳级），O．2％溴酚蓝，20％甘油。

（8）封闭液：

5g脱脂牛奶溶解于100mlPBST中。

（9）碱性磷酸酶缓冲液：

100mmoFLNaCI，5mmoFLMgCl2，100mmo儿强s·

C1~pH9．5），置于密闭容器室温保存。

（10）BCIP：

50mgBCIP溶解于lml蒸馏水中，避光保存于4℃。

（11）NBT：

75mgNBT溶解于70％DMF（二甲基甲酰胺）lml中，避光保存于4℃。

（12）生色底物混合液：

75mg／mlNBT80gl，50mg／mlBCIP60ǖl与20ml碱性磷酸酶缓冲液混匀，这一混合液应在30分钟内使用。

（13）考马斯亮蓝染液：

45ml甲醇，45ml去离子水，10ml冰乙酸，0．25g考马斯亮蓝G250混匀溶解后，室温保存。

（14）0．02％Na2S203：

20mgNa2S203溶解于100ml去离子水中，新鲜配制。

去离子水后，再加入100ü

l40％甲醛混匀即可，最好新鲜配制。

2.3.3.1HepG2细胞复苏

（1）从液氮罐中迅速取出装有HepG2的冻存管，让HepG2能快速通过对细胞有损害的．50"

C～0"

C区域。

（2）立即将冻存管放置于37℃恒温水浴箱中，摇动冻存管，使其内容物在20--一60sec内完全融化成悬液。

（3）在超净工作台中打开冻存管，将细胞悬液用巴氏吸管吸出到无菌的离心管中，加入2mlDMEM培养基，混匀后，室温，2000g，离心3min。

（4）无菌条件下打开离心管，弃上清，加入2ml培养基重悬细胞，将细胞悬液接种到250ml的玻璃培养瓶中，加入新鲜DMEM培养基15ml，置37℃C02孵箱中培养。

（5）培养24h，待大部分细胞贴壁后，更换新鲜的培养基继续培养。

2.3.3.2细胞计数

（1）制备细胞悬液：

倾去培养基，用0．25％胰酶消化液消化并吹打分散单层培养细胞，制成单细胞悬液，要求细胞浓度不低于104／ml。

（2）用吸管吸取少量细胞悬液，滴在计数室边缘的斜面上，让细胞悬液自然流入盖玻片下的空隙中，均匀地充满在计数室内。

注意悬液注入量不要过多或过少，计数室内不应有气泡产生。

（3）计数：

静置2-3min，在低倍镜下进行计数（10×

物镜），计数4个大格中的细胞数。

如细胞压在格线上时，则数上不数下，数左不数右。

（4）计算：

细胞数／毫升原液一（4大格细胞数之和／4）×

104

2.3.3.3HepG2细胞传代

（1）取一瓶HepG2细胞，倒置显微镜下观察，如细胞已长成致密单层，即可进行细胞传代。

（2）倒去细胞培养液于废液缸中，尽量倾倒干净。

加入l～2ml0．25％胰酶消化液，转动培养瓶，使其浸润整个细胞层，置室温下消化3～5min。

倒置显微镜下观察细胞，当细胞由长梭形收缩变为圆形，细胞之间出现间隙，并且可见有细胞漂浮到培养液中时，可以终止消化。

或者翻转培养瓶，肉眼观察细胞单层，见细胞单层薄膜上出现针孔大小空隙时，即可终止消化。

（3）加入2～3ml培养基于培养瓶中终止消化，吸取瓶中培养液反复冲洗瓶壁上的细胞层，直至瓶壁上的细胞全被冲下，再轻轻吹打混匀，将细胞悬液吸取到无菌离心管中，室温，2000g，离心3min。

（4）弃上清．加入4ml培养基重悬细胞（细胞浓度2×

106／mt），每lml接种到1个250ml培养瓶中，然后再加入15ml新鲜培养基，水平轻轻晃动瓶子，使细胞能够均匀分布，置3712C02孵箱中培养。

一般4～5天传代1次。

（1）取一瓶处于对数生长期（即繁殖期）的细胞进行保种。

（2）倒去细胞培养液于废液缸中，加入l～2ml0．25％胰酶消化液进行消化，制备成细胞悬液。

（3）将细胞悬液转入到无菌离心管中，室温，2000g，离心3min。

弃上清，加2ml细胞保种液，吹打混匀成细胞悬液（细胞浓度5×

106／m1）。

再将细胞悬液分装到两个消毒的冻存管中，每个lml，盖紧管盖，并做好标记o

（4）先将冻存管置于4℃冰箱4h，然后移入液氮罐的气相液氮中放置lh，再迅速浸于液相液氮（-196℃）中冻存（这样能获得较高的复苏率）。

2.3.3.5HepG2细胞的收集与保存

用刮取的方法收集繁殖期与维持期的Hep02细胞，用作下一步的实验（收集细胞要迅速，低温下进行，以减弱蛋白酶作用）。

（1）将细胞培养瓶水平置于冰上，细胞生长面朝下，倒掉培养基，用PBS或者生理盐水清洗2～3次，留适量液体于瓶内，然后用特制的细胞刮棒朝一个方向刮取细胞，用力要轻，尽可能多的将细胞刮下，并用生理盐水将残留于瓶内的细胞洗下。

（2）将细胞悬液转移到离心管，4℃，2000g，离心3min。

（3）弃上清，将细胞保存于-80"

C备用。

2.3.4MTT

黄色的噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的针状Formazzn结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490mim．波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。

实验步骤：

（1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，每孔180ü

1，3000—10000个／孔。

（2）置37℃、5％C02温箱培养使细胞贴壁，培养6—24小时。

（3）加入不同和厚朴酚量，培养12—36小时。

（4）小心吸去上清，加入80ü

1新鲜DMEM培养液，再加入20ulMTF溶液（5mg／m1，即0.5％MTT），继续培养4h。

（5）然后吸掉上清，每孔加入150u1二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。

在酶联免疫检测仪490呦处测量各孔的吸光值。

（6）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。

（7）计算抑制率=[（对照一空白）一（给药一空白）]／（对照一空白）X100％。

2.3.5流式细胞检测细胞凋亡及周期

用适量的和厚朴酚治疗Hep02细胞，在适当的时间收集细胞检测。

（1）将细胞悬液和访瓶内的细胞1-2x106收集到离心管中。

（2）用PBS（PH=7．2）缓冲液清洗两三次。

300g离心5分钟，弃上清夜。

（3）将细胞放置于2-3ml冷70％乙醇中，混匀，保存于4℃。

（4）上机检测。

2.3.6细胞裂解与样品制备n町

（1）选用RIPA裂解体系，使用前4"

C预冷。

取出收集好的HepG2细胞，按8mg／ml的浓度加入RIPA裂解液，同时加入蛋白酶抑制剂（PMSF）20山，吹打混匀。

（t07个细胞总蛋白≈1．0mg）125mRIPA裂解液，cocktail（蛋白酶抑制剂）2m。

（2）裂解体系冰上放置30～40min。

（3）超声波再次裂解．使用探针型超声进行适当频率的短促冲击，共6次，每次10~20sec，中间间隔10-20sec，低温（4℃）下进行。

（4）裂解混合物于4℃，15,000r／min，离心15min，仔细吸取上清液于另一1..5mI离心管（El'

管）中，冰上放置。

（5）加入与上清液等体积的2xSDS凝胶加样缓冲液，沸水中煮样3～5min，即可进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，或者-80℃保存备用。

（1）按Bio-Rad公司说明书安装好玻璃板。

（2）配制好12％的分离胶溶液，迅速在两玻璃板的间隙中灌注丙烯酰胺溶液，留出灌注积层胶所需空间（梳子的齿长再加lcm）。

用微量移液器小心地在丙烯酰胺溶液上覆盖一层去离子水或饱和正丁醇。

将凝胶垂直放置于室温下。

（3）分离胶聚合完全后（60min），倾去覆盖层液体，用去离子水洗涤凝胶顶部2～3次以除去未聚合的丙烯酰胺，尽可能捧去凝胶上的液体，再用滤纸吸净残留液体。

（4）配制好5％的积层胶溶液，在已聚合的分离胶上直接灌注积层胶，立即在积层胶溶液中插入干净的梳子，小心避免混入气泡，将凝胶垂直放置于室温下。

（5）积层胶聚合完全后（30min），小心移去梳子。

把凝胶固定于电泳装置上，上、下槽各加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液。

2.3.8加样与电泳

（1）将制备好的样品按每个加样槽20山的量进行加样，小心缓慢、均匀地将样品加到加样槽中，不可过快及用力过大，避免样品从槽中溢出。

（2）将电泳装置与电源相接，80V电泳15min后，溴酚蓝前沿进入分离胶，再把电压提高到120V，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部（约需要2h），关闭电源。

（3）卸下玻璃板，用拨胶片撬开玻璃板，在凝胶下部切去一角以标注凝胶的方位。

2.3.91DSDS．PAGE（SDS聚丙烯畦胺凝胶电泳）

（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶的制备，步骤同前。

（2）凝胶制好后，开始加样。

加样顺序依次为：

蛋白质分子量标准品，正常对照免疫沉淀样品，卵巢癌患者免疫沉淀样品；

加样量均为20gl。

其余所有不用的样品孔中加上等体积的lxSDS凝胶加样缓冲液。

（注：

蛋白质分子量标准品在凝胶做考马斯亮蓝染色时取5山，在做银染时取1ul，剩余的体积由lxSDS凝胶加样缓冲液来补充。

）

（3）开始电泳，80V电泳15min后，提高电压到120V，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部（约需要2h）。

2.3.10凝胶考马斯亮蓝染色

（1）电泳完毕后，将凝胶浸泡到考马斯亮蓝（G250染液中，放在平缓摇动的摇床上，室温，染色过夜。

（2）第二天将凝胶浸泡在去离子水中脱色，染液回收备用。

室温平缓摇动4～8h或者脱色过夜，其间要更换去离子水3～4次。

脱色越充分，考马斯亮蓝染色法的蛋白质检出下限就越低，并且背景越干净。

（3）扫描己染色的凝胶，保存结果，并分析比较正常对照免疫沉淀样品与卵巢癌患者的差异，找到差异条带（为患者所独有），作下步处理与分析。

2.3.11质谱鉴定和生物信息学分析

2.3.11.1膏白条带的切取和保存

（1）用去离子水漂洗胶2次，并用色谱纯甲醇和去离子水冲洗1．5ml离心管（EP管）。

（2）使用无菌手术刀片，沿着差异条带的边缘，小心仔细准确地将蛋白条带切割下来，放入EP管。

（3）在EP管中将蛋白条带切成约lmm3大小的凝胶颗粒，用去离子水漂洗2次后，瞬时离心，弃上清，尽量吸干EP管中的液体。

（4）做好标记，将蛋白样品置于-80℃保存。

注意事项：

（1）尽量避免皮肤和头发的角蛋白污染，在操作过程中应戴一次性的PE手套（不用乳胶手套）和帽子。

（2）不要将胶长时间存放于乙酸溶液中。

（3）EP管及染胶的容器必须用甲醇和水充分清洗，尤其应与进行Westernblot的容器分开，以避免casein或BSA的污染。

2．3．11．2质谱鉴定（massspectrometry，MS）

（1）切取下的小胶块（约lmm3）置于EP管中，加入100mmol/L碳酸氢氨：

乙腈（1：

1）的溶液，37℃振摇30min。

重复此步骤直到完全脱色，之后倾出液体，加50ul乙腈并使胶脱水l0-15min。

如果胶块没有完全脱水就需要再换一次乙腈，最后倾出乙腈，在Speed~Vac中完全干燥（低温状态，15min）。

（2）在50mmoFL包含测序级胰酶的碳酸氢氨溶液中再水化。

酶的储存液是在25ug的胰酶中加250u1的0.1％三氟乙酸。

每份（15ul）被储存在4℃下。

活性酶溶液的制备是每份15ul加100ul的50mmol/L碳酸氢氨溶液，终

浓度是13ng/ul。

加入约20ul的胰酶溶液于胶块中（充分再水化后的胶块）并放置在4℃下再水化45-60min，移走过量的胰酶溶液加入少量的

50mmol/L的碳酸氢氨溶液（10-20ul）使胶块在酶解过程中保持浸润，37℃孵育1h，然后室温下过夜。

（3）新鲜配制10mg／锄的甜氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）。

点约1ul基质和样

品混合液于靶上，让靶